Method Article

وفي اشارة الى نقص الأوكسجين داخل تعقب المجاميع خلية مغلف

DOI:

10.3791/3521

⸱

December 16th, 2011

 ,  , 
1Biomedical Engineering Program, University of South Carolina, 2Chemical Engineering Department, University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف طريقة لتغليف الخلايا الضوئية الشمسية في هيدروجيل PEG crosslinked. يتم تعقب إشارات ميتة داخل ورم جزيري الفئران مغلفة (MIN6) المجاميع باستخدام نظام علامة الفلورسنت. يسمح هذا النظام التسلسلي للفحص الخلايا في غضون سقالة هيدروجيل ويشير ارتباط نقص الأوكسجين مع التغيرات في النمط الظاهري الخلية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في داء السكري من النوع 1 ، يؤدي تدمير المناعة الذاتية لخلايا البنكرياس β إلى فقدان إنتاج الأنسولين وارتفاع السكر في الدم المميت. كخيار علاجي بديل لحقن الأنسولين الخارجي ، تم استكشاف زرع أنسجة البنكرياس الوظيفية1،2. يقدم هذا النهج وعدا باستعادة طبيعية وطويلة الأمد لمرض السكر في الدم. حماية الأنسجة المانحة من الجهاز المناعي للمضيف مطلوبة لمنع الرفض والتغليف هو طريقة تستخدم للمساعدة في تحقيق هذا الهدف.

المواد المشتقة بيولوجيا ، مثل الجينات3 والأغاروز4 ، كانت الخيار التقليدي لبناء الكبسولة ولكنها قد تسبب الالتهاب أو فرط النمو الليفي5 الذي يمكن أن يعيق نقل المغذيات والأكسجين. بدلا من ذلك ، فإن الهلاميات المائية الاصطناعية القائمة على البولي (الإيثيلين جلايكول) (PEG) غير مهينة ، ويمكن تشغيلها بسهولة ، ومتوفرة بدرجة نقاء عالية ، ولها حجم مسام يمكن التحكم فيه ، ومتوافقة حيويا للغاية ، 6،7،8. كفائدة إضافية ، يمكن تشكيل الهلاميات المائية PEG بسرعة في تفاعل بسيط للتشابك الضوئي لا يتطلب تطبيق درجات حرارة غير فسيولوجية6،7. يتم وصف هذا الإجراء هنا. في تفاعل التشابك ، ينتج عن تدهور الأشعة فوق البنفسجية للبادئ الضوئي ، 1- [4- (2-Hydroxyethoxy) -phenyl] -2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959) ، الجذور الحرة التي تهاجم الروابط المزدوجة بين الكربون والكربون من الفينيل PEG ثنائي الميثاكريلات (PEGDM) مما يؤدي إلى تشابك في نهايات السلسلة. يمكن تحقيق التشابك في غضون 10 دقائق. لقد ثبت أن الهلاميات المائية PEG التي تم إنشاؤها بهذه الطريقة تدعم الخلايا بشكل إيجابي7،9 ، كما أن تركيز البادئ الضوئي المنخفض والتعرض القصير للأشعة فوق البنفسجية لا يضر بقابلية ووظيفة الأنسجة المغلفة10. بينما نقوم بعمل PEG الخاص بنا بالطريقة الموضحة أدناه ، يمكن أيضا شراء PEGDM مباشرة من بائعين مثل Sigma.

النتيجة المتأصلة للتغليف هي عزل الخلايا عن شبكة الأوعية الدموية. وبالتالي يتم تقليل إمدادات العناصر الغذائية ، ولا سيما الأكسجين ، والحد منها عن طريق الانتشار. قد يؤثر هذا الانخفاض في توافر الأكسجين بشكل خاص على β الخلايا التي تعتمد وظيفة إفراز الأنسولين فيها بشكل كبير على الأكسجين11-13. سيؤثر تكوين الكبسولة وهندستها أيضا على معدلات انتشار الأكسجين وأطوال أطوال الأكسجين. لذلك ، نصف أيضا تقنية لتحديد الخلايا التي تعاني من نقص الأكسجين داخل كبسولات PEG الخاصة بنا. تسمح إصابة الخلايا بالفيروس الغدي المؤتلف بإنتاج إشارة فلورية عند تنشيط مسارات العامل المحفز لنقص الأكسجة داخل الخلايا(HIF) 14. نظرا لأن HIFs هي المنظمين الأساسيين للاستجابة النسخية لنقص الأكسجة ، فإنها تمثل علامة مستهدفة مثالية للكشف عن إشارات نقص الأكسجة15. يسمح هذا النهج بالكشف السهل والسريع عن الخلايا التي تعاني من نقص الأكسجة. باختصار ، يحتوي الفيروس الغدي على تسلسل لبروتين فلوري أحمر (Ds Red DR من Clontech) تحت سيطرة أداة تشذيب العناصر المستجيبة لنقص الأكسجة (HRE). سيؤدي تثبيت HIF-1 من خلال ظروف الأكسجين المنخفضة إلى نسخ البروتين الفلوري (الشكل 1). تم نشر تفاصيل إضافية حول بناء هذا الفيروس سابقا15. يتم تخزين الفيروس في 10٪ من الجلسرين عند -80 درجة مئوية مثل 150 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل بتركيز 3.4 × 1010 pfu / mL.

أظهرت الدراسات السابقة في مختبرنا أن خلايا MIN6 المغلفة على شكل مجاميع تحافظ على صلاحيتها طوال 4 أسابيع من الثقافة في 20٪ من الأكسجين. أظهرت مجاميع MIN6 المزروعة في 2 أو 1٪ أكسجين علامتي الخلايا النخرية (لا تزال حوالي 85-90٪ قابلة للحياة) عن طريق تلطيخ بروميد الإيثيديوم بالإضافة إلى التغيرات المورفولوجية بالنسبة للخلايا في 20٪ أكسجين. فقد الشكل الكروي السلس للركام المعروض بنسبة 20٪ وبدا المجاميع أشبه بمجموعات غير منظمة من الخلايا. في حين أن إجهاد الأكسجين المنخفض لا يسبب انخفاضا واضحا في الجدوى ، إلا أنه يؤثر بوضوح على تراكم MIN6 ووظيفته كما تم قياسه بواسطة إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز15. أظهر تحليل اللطخة الغربية للخلايا المغلفة في 20٪ و 1٪ أكسجين أيضا زيادة كبيرة في HIF-1α للخلايا المزروعة في ظروف الأكسجين المنخفض والتي ترتبط بالتعبير عن بروتين DsRed DR.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. PEGDM التوليف ومتفاعل للضوء حل macromer إعداد PEGDM

  1. تزن 2G من PEG (خطي ، 10،000 دا) إلى قارورة زجاجية 40mL مع غطاء من البلاستيك الصلب.
  2. إضافة 308μL تقريبا أنهيدريد ميثاكريليك فضفاضة وغطاء القارورة.
  3. القارورة الميكروويف على ارتفاع لمدة 2 دقيقة في الميكروويف محلية القياسية. قفازات مقاومة للحرارة لبس ، دوامة القارورة جيدا ، ثم الميكروويف على ارتفاع لمدة 5 دقائق إضافية.
  4. السماح لفترة وجيزة القارورة ليبرد بما يكفي ليكون التعامل معها قفازات. إرفع قبعة وإضافة ببطء في حين يحوم كلوريد الميثيلين القارورة. إضافة كافية بحيث يبدو الحل واضح ومتجانس ، vortexing العينة حسب الحاجة. وينبغي أن إجمالي حجم كلوريد الميثيلين استخدامها 1،5-2 مل.
  5. PEGDM يعجل في 200 مل من البرد ، أثار إثيل الأثير عن طريق إضافة قطرة قطرة الحل.
  6. جمع PEGDM الفراغ عن طريق الترشيح واتركه حتى يجف.
  7. حل PEGDM في كمية كافيةمن الماء منزوع الأيونات (عادة 100 -150 مل).
  8. Dialyze الحل ضد الماء منزوع الأيونات لمدة 5 أيام في أنابيب غسيل الكلى مع الوزن الجزيئي قطع من 1000 دا. استبدال المياه مرة واحدة يوميا.
  9. قسامة الحل في حاويات مناسبة والتجميد في -80 درجة مئوية خلال الليل. Lyophilize الحل لمدة 4 أيام لتنقية تسفر عن مسحوق أبيض PEGDM. تخزين مسحوق عند 4 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال.
  10. لإعداد حل PEGDM متفاعل للضوء ، وإعداد لأول مرة في المائة من الوزن 0.5 photoinitiator حل الأسهم عن طريق تذويب Irgacure 2959 في الماء منزوع الأيونات. دوامة الحل وتخزينه في الظلام.
  11. إعداد 10 ٪ بالوزن وPEGDM 0.025 ٪ بالوزن Irgacure 2959 حل في محلول هانك في سولت المتوازن (HBSS). دوامة بدقة لضمان حل PEGDM. نحن نستعد عادة 1mL هذا الحل في وقت واحد.
  12. تعقيم حل عن طريق التصفية عليه من خلال تصفية حقنة 0.2 ميكرومتر في أنبوب مل microcentrifuge 1.8. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوموتخزينها في 4 درجات مئوية

2. والثقافة ، والعدوى ، وتجميع الخلايا MIN6

  1. تستزرع MIN6 الخلايا في المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع FBS 10 ٪ والجلوكوز 7mM ، 100 وحدة / مل البنسلين / الستربتومايسين ، و0.5 ميكروغرام / مل ب amphotercin في بيئة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
  2. الافراج عن الخلايا من سطح القارورة ثقافة المعالجة ، ونضح والمتوسطة ، وشطف الخلايا مع 37 درجة مئوية الكالسيوم / المغنيسيوم خالية HBSS ، ونضح HBSS ، ثم يضاف 2 مل من 37 درجة مئوية التربسين - EDTA الحل وتسمح للخلايا احتضان لمدة 3 دقائق.
  3. جرة بحزم الى جانب القارورة لضرب الخلايا الحرة ، ثم تضاف 8 مليلتر من 37 درجة مئوية والمتوسطة بقوة ماصة تعليق الخلية أعلى وأسفل مع الحرص على عدم إدخال الفقاعات.
  4. ماصة الخلايا في العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي ، وإجراء تعداد خلايا باستخدام عدادة الكريات أو خلية أخرى العد الداخلي.
  5. في الاستعداد لتصيب الخلايا مع صانعالفيروس ، أولا تحديد العدد الكلي للخلايا المصابة ويكون لحساب حجم تعليق الفيروس اللازمة لتحقيق تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) (5-10 الجزيئات المعدية في الخلية).
  6. تمييع الفيروس في HBSS بواسطة pipeting بعناية كمية مناسبة من التعليق الفيروس إلى وحدة تخزين من قبل aliquoted HBSS في أنبوب مل microcentrifuge 1.8. 50 ميكرولتر من HBSS لكل بئر من الخلايا في مجموعها مناسبة.
  7. تفريق الخلايا pipeting لهم صعودا ونزولا في أنبوب بهم ، ثم الماصة حجم اللازمة لتحقيق 400،000 الخلايا لكل بئر من الآبار في تعليق لوحة الثقافة 6 - جيدا.
  8. إضافة الحجم المناسب من الفيروس المخفف لكل بئر إلى تحقيق المنشود وزارة الداخلية.
  9. إضافة إلى كل بئر المتوسطة لتحقيق حجم يصل الإجمالي إلى 1.7 مل.
  10. وضع لوحة على شاكر المداري داخل الحاضنة. تعيين شاكر على إعداد منخفض بحيث المتوسطة يغسل بلطف حول الآبار (~ 100 دورة في الدقيقة). السماح للخلايا لaggregaالشركة المصرية للاتصالات ل24-36 ساعة. وينبغي تشكيل المجاميع التي يبلغ قطرها التقريبي لل75-175 ميكرون.

3. تغليف الخلايا في PEGDM

  1. قد تكون مغلفة الخلايا كما تشتت (الخطوة 2.4) أو التجميع التالية (الخطوة 2.10). منذ PEGDM السلائف حل هيدروجيل هو السائل ، قد تميل إلى تسوية الخلايا قبل يشابك وتشكيل هيدروجيل. إذا كان من المتوقع أن تحدث تسوية بسرعة ، كما هو الحال مع المجاميع الكبيرة ، قد يكون من المفيد لانتاج هيدروجيل في خطوتين بحيث تستقر الخلايا إلى الطائرة المركزية للهلام. ويرد التوليف هيدروجيل خطوة واحدة الإجراء المناسب لخلايا متفرقة (الشكل 2) ، ويظهر الإجراء على مرحلتين وكذلك (الشكل 3) ومفصلة أدناه (3،2-3،9).
  2. إنشاء السفينة التي سيتم تشكيلها في هيدروجيل بقطع رأس مدبب الخروج من حقنة من البلاستيك 1 مل ووضعه في نهاية المطاف فتح في رفوف.
  3. الماصة 20 ميكرولتر من PEGDM متفاعل للضوء ذلكlution في النهاية المفتوحة للحقنة على الغواص التأكد من حجم يغطي سطح المكبس بأكمله. ضبط المكبس بزيادات صغيرة لتحقيق سطح السائل المسطحة.
  4. وضع الماصة في رف رف وموقف تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (365nm ، ~ 7 ميغاواط / سم 2) لحوالي 8 دقائق للسماح لليشابك هيدروجيل. خلال هذا الوقت ، قد بدأت التحضير للخلايا
  5. الماصة مجلد يحتوي على العدد المطلوب من الخلايا / المجاميع في أنبوب 1.8 مل microcentrifuge ، وكأب ، والطرد المركزي في أنبوب 130 جرام لمدة 5 دقائق.
  6. باستخدام micropipettor ، إزالة بعناية وسائل الإعلام من دون إزعاج بيليه الخلية في طرف الأنبوب. رئيسا وسائل الاعلام النهج بيليه ، فإنه قد يكون من المفيد استخدام الدقيقة ، 10 ميكرولتر طرف الماصة.
  7. resuspend بلطف بيليه الخلية في 20 ميكرولتر من محلول PEGDM متفاعل للضوء (استخدام طرف الماصة واسعة الفم إذا كان يعمل مع المجاميع) وإضافة تعليق الخلية إلى حقنة على رأس اله crosslinked سابقا جزء هيدروجيل.
  8. فضح المحقنة إلى 8 دقائق إضافية من الأشعة فوق البنفسجية لاستكمال بناء هيدروجيل. عند الانتهاء ، يجب أن تكون خلايا مغلفة بشكل كامل في هيدروجيل اسطواني الشكل (3).
  9. إخراج هيدروجيل من المحاقن وعلى 1 مل من HBSS في البئر من 24 لوحة ليغسل جيدا لفترة وجيزة من هلام. نقل الجل إلى 1 مل من وسائل الإعلام في البئر من 24 لوحة جيدا والثقافة وفقا للشروط المطلوبة.

4. تتبع نقص الأكسجة

  1. في أي نقطة خلال الصور ، والثقافة الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت لتعقب بدء إشارات ميتة. اعتمادا على ما يجري تصويرها يمكنك الصورة في لوحة متعددة جيدا أو نقل الجل على شريحة المجهر قبل وضعها على المسرح المجهر. ويتم تحقيق الإثارة ذروتها الأحمر التاءات في 556nm والانبعاثات ذروتها في 586nm. الانبعاثات المكثفة إلى حد ما وبالتالي photobleaching لم observإد أن يكون مشكلة. الفارق الزمني بين الشروع في إنتاج البروتين وأول إشارة الكشف عن ما يقرب من 12 ساعة. إشارة محددة بما فيه الكفاية لتحديد الخلايا الفردية إشارات ، ولكن القرار قد لا تكون كافية لتحديد الخلايا توطين الإشارة. في الخلايا مما يشير ، يلاحظ عادة إشارة بشكل موحد في جميع أنحاء السيتوبلازم. ويمكن الإشارة أيضا زيادة كثافة مع التعرض لنقص الأكسجة الموسعة ، على الرغم من أننا حتى الآن لم يحدد تماما ما إذا كان هذا يرجع إلى زيادة البروتين التعبير ، عموما تراكم البروتين ، أو تأخر نضج البروتين.

5. ممثل النتائج

ويبين المثال ممثل MIN6 المجاميع مغلفة في هيدروجيل PEG في الشكل 4. فإن جل crosslinked تكون صلبة في جميع أنحاء ، آخذا شكل السفينة التي كان يؤديها في رد الفعل. وهلام مع أسطح سلسة الخارجي هو الأفضل لزرع للمساعدة في منع إعادة جسم غريبsponse. في هلام ، ينبغي المجاميع الخلية المغلقة بالكامل في المصفوفة وتوزيعها متجانس للسماح لنقل المواد الغذائية على نحو أفضل.

والصور المصورة ممثل يشير ميتة في MIN6 المجاميع في الشكل 5. وكانت متطابقة مثقف MIN6 المجاميع المصابة بالفيروس في علامة O 20 ٪ إما 2 (5A) أو 1 ٪ O 2 (5B) لمدة 44 ساعة قبل التقاط الصورة.

figure-protocol-1
الشكل 1. التخطيطي لنشاط نظامنا علامة نقص الأكسجة. الفيروسة الغدانية الإدراج من الجين التاءات DR الأحمر والمنبع المروج تعليم حقوق الإنسان يسمح لنقص الأكسجة الناجم عن إنتاج بروتين فلوري تحت سيطرة مؤسسة الحرمين - 1.

figure-protocol-2
الشكل 2. فرقت الإجرائية الرسم البياني للتغليف خطوة واحدة من الخلايا في MIN6 هيدروosslinked هيدروجيل PEGDM. لكل جيل ، وعلقت الخلايا الموزعة في 40μL من macromer حل PEGDM متفاعل للضوء. يتم وضع هذا في حقنة a 1mL مقطوعة الرأس ، ويتم تشكيل هيدروجيل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 365nm بعد 10-12 دقيقة. عند الانتهاء ، يتم إزالة القرص هيدروجيل من المحاقن ، وغسلها ووضعها في لوحة متوسطة مملوءة جيدا لحضانة.

figure-protocol-3
الشكل 3. الإجرائية الرسم البياني للتغليف المزدوج خطوة من الخلايا MIN6 مجمعة في هيدروجيل PEGDM crosslinked. لكل جيل ، يتم تشكيل لأول مرة نصف هلام الأشعة فوق البنفسجية التي يشابك من 20μL من macromer حل PEGDM متفاعل للضوء لمدة 8 دقائق. وعلقت بعناية MIN6 المجاميع في 20μL إضافية من حل macromer متفاعل للضوء الذي يضاف على الجزء العلوي من هلام نصف قبل تشكيلها. يتم تشكيل هلام الكامل من قبل 8 دقائق من التعرض للأشعة فوق البنفسجية إضافية مع المجاميع مغلفة بشكل كامل في الإنسيالطائرة من هلام.

figure-protocol-4
الشكل 4. صورة من هيدروجيل 40μL 20X تحت التكبير. وينظر بشكل واضح MIN6 المجاميع (~ 400000 مجموع الخلايا) داخل هلام. قطرها حوالي 6mm هيدروجيل هو (شريط 1MM =).

figure-protocol-5
الشكل 5. نقص الأكسجين في الخلايا مما يشير نيون MIN6 مجمعة في هيدروجيل PEGDM. الخلايا التي تم تغليفها ثم توضع في الحضانة عند 20 ٪ O 2 لمدة 44 ساعة لا تعرض إشارات نقص الأكسجة (أ) في حين أن الخلايا التي تم تغليفها ثم حضنت في 2 ٪ O ​​2 لمدة 44 ساعة شاشة واضحة ، إشارة في كل مكان. (شريط 100μm =) (ب).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطريقة المعروضة هنا تقدم تقنية سريعة وبسيطة لتغليف الخلايا في هيدروجيل الربط مع استخدام الحد الأدنى من الشروط غير الفسيولوجية. PEG يمثل مادة التغليف مفيدة جدا للتوافق مع الحياة وسهولة التعديل. اختلاف بسيط من نسبة الربط في حل متفاعل للضوء ، على سبيل المثال ، قد يتم استخدامها لضبط الخواص الميكانيكية ، مثل معامل الضغط ، وخصائص النقل عن طريق حجم المسام. أيضا ، يتم تعديل الربط بسهولة عن طريق إضافة السلاسل الجانبية. PEG الهلاميات المائية ، وبالتالي ، تمثل كل جهاز السريرية واعدة منصة مرنة للأبحاث في المختبر

كما تم تتبع طريقة لنقص الأكسجة في الربط بين الخلايا مغلفة المقدمة. هذه الطريقة مفيدة للكشف عن نقص الأكسجة بساطة وتجنب الحاجة للتضحية خلايا الفائدة. ويمكن تطبيق هذه التقنية لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في مجموعة متنوعة من الظروف مما يجعلنا فيefulness اسعة. على سبيل المثال ، قد يتم تعقب نقص الأكسجة وتلميحا عن تمايز الخلايا الجذعية في الثقافات الجذعية micromass الخلية. ومع ذلك ، لا يمكن إلا أن تطبق هذه الطريقة لتفريق نظم الخلية أو النظام الذي يتم تجميعها في وقت لاحق فرقت الخلايا. أيضا ، قد كشف للإشارة الفلورسنت يكون من الصعب في الأنسجة أكبر أو أكثر كثافة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بفضل المختبر Anseth كريستي من جامعة كولورادو في بولدر لتوريد بسخاء MIN6 الخلايا. وقد تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل جبهة الخلاص الوطني.

Materials

اسم الكاشف شركة فهرس العدد تعليق (اختياري
PEG سيغما الدريخ 309028 - 500G
ميثاكريليك الاندريد سيغما الدريخ 276685 - 100ML
الميكروويف ايمرسون MW8784SB
Vortexer الصناعات العلمية SI - A236
كلوريد الميثيلين سيغما الدريخ D65100 - 1L
إثيل الأثير سيغما الدريخ 346136 - 1L
غسيل الأنابيب طيف 132640
المختبرات
الفريزر
Lyophilizer Labconco 7670521
فراغ مضخة وولش 8917Z - 01
Irgacure 2959 شركة سيبا Geigy 029891301PS04
HBSS Mediatech 21-022 - CV
حقنة تصفية VWR 28145-477
RPMI 1640 Mediatech * * صياغة مخصصة
FBS PAA مختبرات A15 - 351
البنسلين الستربتوميسين Mediatech 30-002 - CI
الأمفوتريسين B Mediatech 30-003 - CF
حاضنة الحرارية العلمية 3597 نابكو سلسلة WJ 8000 ث / O2 قمع
التربسين EDTA Mediatech 25-052 - CI
شاكر المداري VWR 12620-926
مصباح الأشعة فوق البنفسجية سانيو Denri FLR40SBLB / M دورتين 40W ، 365nm المصابيح blacklight الأشعة فوق البنفسجية الزرقاء
الطرد المركزي إيبندورف * 5811 000.010 * رقم الطلب.
طراز R 5810
مجهر نيكون TI - ND6 - PFS مع filterset عن الإثارة 556nm / الانبعاثات 586nm

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy. Surgery. 61, 827-837 (1967).
  2. Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation. N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).
  3. Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas. Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).
  4. Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation. Diabetes. 39, 224-225 (1989).
  5. Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts. Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).
  6. Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
  7. Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled β-cell microenvironments. Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).
  8. Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).
  9. Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).
  10. Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).
  11. Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).
  12. Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
  13. De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia. Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).
  14. Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S,, Blanchette, J. O. Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system. J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).
  15. Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. ypoxia hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing. Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hypoxic SignalingPEG HydrogelCell AggregatesFluorescent MicroscopyHIF 1 AlphaPEGDM PurificationUV CrosslinkingOxygen ConditionsEncapsulated CellsAdenovirus Marker

Related Articles