Method Article

رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)

DOI:

10.3791/3599

⸱

May 27th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, UMR 631, Parc scientifique de Luminy, 2Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6102, Parc scientifique de Luminy, 3Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Aix-Marseille University, 4École Centrale Marseille, Technopôle de Château-Gombert, 5Institut Fresnel, Aix-Marseille University, 6Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6133, Aix-Marseille University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

متعددة للبحث عن المفقودين الهدف هو خوارزمية محلية الصنع وضعت لتتبع الجزيئات بشكل فردي وصفت داخل الغشاء البلازمي للخلايا الحية. كشف بكفاءة، وتقدير وتعقب جزيئات مع مرور الوقت في كثافة عالية توفر سهل الاستعمال، وأداة شاملة للتحقيق في ديناميات غشاء النانو.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هدفنا هو الحصول على وصف شامل لعمليات الجزيئية التي تحدث في الأغشية الخلوية في الوظائف البيولوجية المختلفة. ونحن نهدف إلى تحديد خصائص منظمة معقدة وديناميكية من غشاء البلازما في مستوى واحد جزيء، من خلال تطوير أدوات تحليلية واحدة مخصصة لتتبع الجسيمات (SPT) في كثافة عالية: الهدف متعددة للبحث عن المفقودين (MTT) 1. واحدة جزيء videomicroscopy، وتقدم ميلي ثانية واحدة وقرار النانومترية 1-11، يسمح لتمثيل مفصل لمنظمة غشاء 12-14 بدقة عن طريق تعيين واصفات مثل مستقبلات الخلايا التوطين، والحبس، والتنقل أو التفاعلات.

نحن النظر SPT، على حد سواء بالتجربة وحسابيا. وشملت الجوانب التجريبية تحسين الإعداد ووسم الخلية، مع التركيز بشكل خاص على الوصول إلى كثافة العلامات أعلى مستوى ممكن، من أجل توفير لقطة الحيوية للديناميات الجزيئية 1ق يحدث داخل غشاء. المعنية بقضايا حسابي كل خطوة تستخدم لإعادة بناء مسارات: قمم الكشف، وتقدير وإعادة الاتصال، التي تناولتها وسائل محددة من تحليل الصور 15،16. تنفيذ الانكماش بعد اكتشاف يسمح قمم انقاذ مخبأة في البداية من قبل القمم، أقوى المجاورة. من المذكرة، وتحسين الكشف يؤثر تأثيرا مباشرا لإعادة الاتصال، عن طريق تقليل الفجوات في المسارات. وقد تم تقييم العروض باستخدام مونتي كارلو محاكاة لكثافة العلامات المختلفة والقيم الضجيج، والتي تمثل عادة القيود الرئيسيتين لقياسات موازية في القرار المكانية العالية.

يمكن للدقة النانومترية 17 التي تم الحصول عليها عن الجزيئات واحدة، وذلك باستخدام إما المتعاقبة على / قبالة البصريات photoswitching أو غير الخطية، وتقديم الملاحظات شاملة. هذا هو أساس أساليب nanoscopy 17 مثل STORM 18، 19،20 النخيل، RESOLFT 21 أو STED 22،23، مبادرة الخوذ البيضاءقد الفصل غالبا ما تتطلب عينات التصوير الثابت. المهمة المركزية هي الكشف وتقدير من الحيود محدودة القمم الصادرة عن جزيئات واحدة. وبالتالي، توفير افتراضات كافية مثل التعامل مع دقة ثابت الموضعية بدلا من الحركة البراونية، هي مناسبة بشكل مباشر MTT لتحاليل نانوية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم أساسا MTT بأي مقياس: ليس فقط لجزيئات، ولكن أيضا لخلايا أو الحيوانات، وعلى سبيل المثال. وبالتالي، MTT هو خوارزمية تتبع القوية التي تجد تطبيقات في موازين الجزيئي والخلوي.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا الفيديو، نقدم كامل تتبع جسيم واحد تجربة، وذلك باستخدام الكم النقاط التي تستهدف مستقبلات غشاء محدد. والهدف الرئيسي من هذه التجربة تتمثل في أنواع مختلفة من السلوكيات التي تميز الانتشار الجزيئي تقاس داخل الغشاء البلازمي للخلايا الحية. في الواقع، يمكن للحركات الجزيئية التي تنشأ في الغشاء يخرج عادة من نشر البراونية التي يجري توجيه خطي أو محصورة داخل nanodomains 26-29، على سبيل المثال. ونحن نهدف في بعد واحد كما مستقبلات عدد ممكن من الناحية التقنية، لتوفير لقطة من مجموعة متنوعة الناشئة في الديناميات التي تحدث داخل غشاء الخلية الحية. ومن المتوقع في نهاية المطاف هذا للسماح للآليات فك رموز تنظيم مستقبلات الخلايا مما يشي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في واحدة تتبع الجسيمات، بجانب الجوانب الخلية والمجهري، وتحليل يمثل جزءا كبيرا من العمل. هذا ويتناول الخوارزمية المستخدمة لتنفيذ المهام الرئيسية الثلاث: كشف وتقدير وإعادة قمم فوق كل إطار. لكن الجانب يترتب على ذلك من هذا العمل تكمن في وضع الخوارزمية نفسها، والتي قد تحتاج إلى أن تتكيف لتحقيق أي مخصص جديد، وذلك أساسا للخطوات، مشاركة إضافية (مثل فك رموز وسائل الحركة، والتفاعل أو رياضيات الكيمياء).

ومع ذلك، بمجرد أن يت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر أعضاء فريق العمل لدينا، Blache MC خاصة لتقديم المساعدة التقنية، وكذلك M Irla Imhof وباء، ولما قدموه من دعم ومناقشات مثمرة. استنساخ الأرقام لالانكماش والحبس مجاملة من طرق الطبيعة. هذا المشروع يتم بدعم من المنح المقدمة من المؤسسات CNRS، INSERM وجامعة مرسيليا، ومنح محددة من منطقة بروفانس ألب كوت--d'Azur، المعهد الوطني للسرطان دو، الوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR-PCVI-08- 0034-02، ANR بلان 2010 1214 01) ومؤسسة بور لا بحوث ميديكال (إيكيب labélisée FRM-2009). ويدعم VR من قبل زمالة من السرطان الوطني الفرنسي جنيه كونتر.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الكاشف شركة فهرس العدد كمية
كوس-7 خط الخلية ATCC CRL-1651 5000 خلايا / جيد
HBSS دون كا 2 + GIBCO 14175 1 مل
0.05٪ التربسين EDTA GIBCO 25300 1 مل
8-جيدا مختبر تيك نونك 155441 1
QDot-605 streptavidin إينفيتروجن Q10101MP 20 ملي مول
المعقدة البيروكسيديز فاب (لتخليق فاب، أنظر المرجع 21)
القوات المسلحة البوروندية من 108 خريطة موقع ATCC HB-9764 200 ميكروغرام
NHS-بيوتين الحرارية العلمية 21435 18.5 ميكروغرام
إكمال المتوسطة
DMEM GIBCO 41965 500 مل
الأبقار مصل الجنين SIGMA F7524 50 مل
L-الجلوتامين GIBCO 25030 5 مل
HEPES GIBCO 15630 5 مل
الصوديوم البيروفات GIBCO 11360 5 مل
التصوير المتوسطة
HBSS مع كا 2 + GIBCO 14025 25 مل
HEPES GIBCO 15630 250 ميكرولتر

1 "> معدات شركة مرجع المقلوب المجهر نيكون كسوف TE2000U مصباح فلوري نيكون Intensilight C-HGFIE 1.3 NA 100X هدف نيكون تخطط شركة فلور 1.30 1.49 هدف NA 100X نيكون APO TIRF 1.49 كاميرا روبر العلمية تتالي 512 B Thermostated مربع حياة التصوير خدمات مربع

ملحق: سيناريو سبيل المثال من تحليل تكميلي MTT

وظيفة MTT_example (FILE_NAME)
أمثلة٪٪٪ الأساسية التي تبين كيفية استرداد نتائج الإخراج MTT
٪٪٪ لرسم كل تراكه وبناء الرسم البياني
٪٪٪ من كثافة مضان

إذا nargin <1٪ لا FILE_NAME المقدمة؟
الملفات = دير ('* STK.')؛
إذا isempty (ملفات)، DISP ('لا توجد بيانات في المسار الحالي')، والعودة، نهاية
. FILE_NAME = الملفات (1) الاسم؛ الافتراضية٪: أولا ملف STK
DISP (['باستخدام' FILE_NAME 'افتراضيا'])
نهاية

file_param = [FILE_NAME "_tab_param.dat ']؛ إخراج الملف٪

بيانات٪ الحمولة
استخدام القرص المضغوط ('output23')٪ أو ('output22')، وفقا لإصدار
تنويه٪: الإصدار 2.2 يولد سوى 7 معلمات،
أضيف٪ معلمة إضافية، والضوضاء، في الإصدار 2.3

٪ لقراءة جميع المعلمات في آن واحد، في جدول واحد
tab_param٪ = fread_all_param (file_param)؛
تا٪b_i = tab_param (2:08: نهاية، :)؛ tab_j = ...

٪ لقراءة جميع المعلمات (باستثناء frame_number) في جداول منفصلة
٪ [tab_i، tab_j، tab_alpha، tab_radius، tab_offset، tab_blk، tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param)؛

tab_i = fread_data_spt (file_param، 3)؛ مؤشر٪ هي 3 لأن يتم تجاهل رقم التتبع ورقم الإطار، وغير مفيدة،!
tab_j = fread_data_spt (file_param، 4)؛
tab_alpha = fread_data_spt (file_param، 5)؛
tab_blk = fread_data_spt (file_param، 8)؛

٪٪ خلال حلقة آثار
N_traces = حجم (tab_i، 1)؛
الجداول٪ من خطوط N_traces بواسطة colums N_frames

لitrc = 1: N_traces
No_blk_index = tab_blk (itrc، :)> 0؛٪ خطوات امض غير فقط
مؤامرة (tab_i (itrc، No_blk_index)، tab_j (itrc، No_blk_index))
& ملاحظة:س؛ xlabel ('ط (بكسل)')، ylabel ('ي (بكسل)')
لقب ([num2str 'تتبع #' (itrc)])
DISP ('الرجاء ضرب أي مفتاح لتتبع المقبل)، وقفة
نهاية

رسم بياني٪ Fluo
N_datapoints = SUM (tab_blk (:)> 0)؛٪ خطوات غير وامض فقط
تاريخ (tab_alpha (tab_blk> 0)، 2 * الجذر التربيعي (N_datapoints))٪ باستخدام 2sqrt (N) صناديق
xlabel ('كثافة (الاتحاد الافريقي)')، ylabel ('ظهور')
عنوان ('رسم بياني لكثافة الجسيمات مضان')

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
  2. Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiple Target TracingSingle Particle TrackingEpidermal Growth Factor ReceptorQuantum Dot LabelingHigh Density ImagingTrajectory ReconstructionPeak DetectionDeflation AlgorithmTransient Confinement AnalysisMonte Carlo Simulations

Related Articles