خلايا العضلات مثقف هي نموذج غير كافية لتلخيص العضلات معصب في الجسم الحي. يمكن استنساخها وحدة محرك وظيفي في المختبر من جانب تعصيب من متباينة الإنسان الخلايا العضلية الأولية باستخدام الفئران explants الجنين الحبل الشوكي. توضح هذه المقالة كيفية إنشاء شارك في ثقافات explants النخاع الشوكي وخلايا العضلات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وحدة للسيارات وظيفية في صحن الثقافة: شارك في ثقافة Explants النخاع الشوكي وخلايا العضلات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
خلايا عضلة الابتدائي تربيتها في aneurally أحادي الطبقة عقد نادرا لأن عفويا، في ظل عدم وجود عنصر العصب، ويقتصر تمايز الخلايا وتنشيط الخلايا العصبية الحركية مفقود 1. هذه القيود تعوق الدراسة في المختبر من العديد من الأمراض العصبية والعضلية في خلايا العضلات مثقف. الأهم من ذلك، يمكن التغلب على المعوقات التجريبية من monolayered، مثقف خلايا العضلات بواسطة الغدد العرقية وظيفية من myofibers مع explants الحبل الشوكي في الثقافات المشتركة.
هنا، نعرض مختلف الخطوات اللازمة لتحقيق فعال وتعصيب السليم للخلايا عضلة الأولية، مما أدى إلى إكمال التفاضل والألياف الانكماش وفقا للطريقة التي وضعتها Askanas 2. للقيام بذلك، وخلايا العضلات شارك في تربيتها مع explants الحبل الشوكي لأجنة الفئران في ED 13.5، مع العقد الجذرية الظهرية لا تزال تعلق لشرائح الحبل الشوكي. بعد بضعة أيام، في عضلة فايbers بدء العقد وتصبح في نهاية المطاف عبر مخططة من خلال تعصيب بواسطة neurites الوظيفية تتوقع من explants النخاع الشوكي الذي يربط إلى خلايا العضلات. يمكن الحفاظ على هذا الهيكل لعدة شهور، وذلك ببساطة عن طريق التبادل المنتظم للثقافة المتوسط.
تطبيقات هذا أداة لا تقدر بثمن هي عديدة، كما أنه يمثل نموذج وظيفي لتحاليل متعددة التخصصات للتنمية البشرية وتعصيب العضلات. في الواقع، مجموعة كاملة من جديد تركيب الموصل العصبي العضلي يحدث في طبق والثقافة، والسماح لقياس سهولة العديد من المعلمات في كل خطوة، في سياق الأساسية والفسيولوجية.
ويمكن لمجرد ذكر بعض الأمثلة، الجينومية و / أو دراسات البروتين أن يؤديها بشكل مباشر على الثقافات المشتركة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الآثار قبل وبعد متشابك، على وجه التحديد وبشكل منفصل المقررة في الوصل العصبي العضلي، لأن كلا من مكونات تأتي من مختلف الأنواع،الفئران والبشر على التوالي،. ويمكن أيضا أن العصب العضلات المشاركة في ثقافة يتعين القيام بها مع الخلايا العضلية البشرية المعزولة من المرضى الذين يعانون من الأمراض العصبية والعضلية في العضلات أو 3، وبالتالي يمكن أن تستخدم كأداة لفحص المخدرات مرشح. أخيرا، ليس هناك حاجة إلى معدات خاصة ولكن منتظمة مرفق BSL2 لإعادة إنتاج وحدة محرك وظيفي في صحن الثقافة. هذا الأسلوب هو وبالتالي قيمة لعضلة على حد سواء، فضلا عن الأوساط البحثية العصبي العضلي للدراسات الفسيولوجية والميكانيكية وظيفة الاعصاب، في سياق طبيعي والمرض.
البروتوكول
1. إعداد الإنسان الأساسية العضلات خلية ثقافة
- إنشاء خلية عضلة الإنسان الثقافات وفقا لتقنية explantation إعادة explantation-4. أولا، عدم إزالة الأنسجة العضلية من الخزعات. ثم، تضمين 1 explants مم 3 في عضلة خثرة من البلازما، والذي يسمح الليفية للخروج من explants.
- يتم نقل explants جزءا لا يتجزأ من على طبق من البلازما الجيلاتين المغلفة وتركها لتنمو في المتوسط النمو الطبيعي (MEM تستكمل مع متوسط 25٪ 199، 10٪ الجنين المصل البقري [FBS]، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 10 ميكروغرام / مل الأنسولين، 10 نانوغرام / مل الإنسان عامل نمو البشرة [EGF]، 12.5 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الإنسان [جمعية جيل المستقبل]) في أحادي الطبقة. الخلايا التي تخرج من explants في ظل هذه الظروف هي خلايا العضلات. وهذه الخلايا تستمر في النمو في أحادي الطبقة بعد إزالة explants.
- ثقافة الخلايا aneurally على 0،1 لوحات الجيلاتين المغلفة٪ في متوسط النمو الطبيعي. يمكن للخلايا أن يكونمثقف aneurally وتوسيعها حسب الحاجة. فمن الأفضل أن تستخدم خلايا العضلات في ممر بين 3 و 8 لأداء المشترك الثقافات. من المهم جدا أن يعصب myotubes الشباب، وبعد هذه المرحلة، شارك في والثقافات وارتفاع مخاطر الفشل. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن myotubes لا تكون كبيرة جدا وسميكة جدا.
- قبل يومين من يخطط للتعصيب، لوحة خلايا العضلات على 35 مم أطباق زراعة الأنسجة (أو 6 لوحات أيضا) في مناطق ذات كثافة من 500000 خلية لكل طبق في متوسط النمو الطبيعي. في ذلك الكثافة، كانت الخلايا في confluency المناسب لبدء الاندماج في اليوم التالي، وتعصيب لاحق من اليوم بعد ذلك. باستخدام هذه الظروف، وmyotubes في مرحلة حق لتعصيب الأمثل واللاحقة وبالتالي تقلص الألياف.
- في اليوم التالي، بدلا من متوسط النمو الطبيعي مع وسيلة اندماج تتألف من MEM تستكمل مع متوسط 25٪ 199، 5٪ FBS، الانسولين 10 ميكروغرام / مل و 1٪ من البنسلين / الستربتومايسين عقار.
2. Isolati على من الفأر الجنينية Explants الحبل الشوكي
يتم تنفيذ الإجراء بأكمله لعزل explants الحبل الشوكي تحت المجهر مجهر، في الحل هانك في سولت المتوازن (HBSS، Gibco / إينفيتروجن المرجع 14170) التي تحتوي على 10٪ الجنين مصل بقري (FBS).
- فمن الأهمية بمكان أن أجنة الفئران ما بين 13 و 14 ED كمرحلة التنمية المختلفة من شأنه أن يعرض للخطر الإجراء بالكامل. تضحية امرأة حامل مع CO 2 وجمع سلسلة جنين كامل في المتوسط HBSS. عزل كل جنين والقضاء على راس منهم للقتل الرحيم.
- تشريح الحبل الشوكي من جنين وباقي الجسم في قطعة واحدة وإزالة العضلات المحيطة بها، والنسيج الضام. نكون حذرين للغاية للحفاظ على ganglions الجذر الظهري (DRGs) تعلق على الحبل الشوكي لضمان تعصيب وظيفي.
- كل شريحة الحبل الشوكي عرضيا بطريقة كل يزدرع يحتوي على الأقل 2 DRG مرفقة به (explants من 1 ملم 3).
- إزالة المتوسطة الانصهار في ثقافة الخلية العضلية، وترك طبقة رقيقة من المتوسط على أحادي الطبقة.
- وضع explants بعناية على طبقة الخلايا العضلية، وخمسة explants متباعدة بالتساوي في صحن 35 ملم.
- إضافة ببطء شديد، وانخفاض متوسط الحكمة الانصهار، وعلى كل ازدراع. فمن الضروري إضافة المتوسطة لخلايا العضلات على قيد الحياة، ولكن ليس كثيرا للسماح للexplants الالتزام الأولى، واجراء اتصالات مع الخلايا. إذا لا يتم إضافة المتوسطة بشكل صحيح (أيضا بقوة أو المتوسطة أكثر من اللازم)، فإن explants تطفو، وسوف تفشل في عصب خلايا العضلات.
- وبمجرد أن تبدأ explants إلى الالتزام بها وتتصدر المتوسطة الانصهار إلى 2 مل لكل طبق 35 ملم، ووضع أطباق بعناية جدا العودة الى الحاضنة.
4. صيانة غيروي العصب العضلات الثقافات المشارك
- تغيير وسيلة اندماج مرتين في الأسبوع.
في أقرب وقت ممكن بعد يومين من تعصيب، فمن الممكن أن نرى neurites الخارجة من كل ازدراع وإقامة اتصالات مع خلايا العضلات، ممثلا في هياكل تشبه الازرار (الشكل رقم 1).
في أقرب وقت 4-6 أيام بعد تعصيب، فإن بعض الألياف الفردية تبدأ في العقد.
وانقباضات تستمر لعدة أشهر، واصلت ببساطة عن طريق تغيير ثقافة المتوسط مرتين في الأسبوع.
بعد حوالي 2 أسابيع، ويزدرع الحبل الشوكي نفسه ينحط، ولكن يتم الحفاظ على تعصيب. هذا أمر طبيعي. طبقة رقيقة من عنصر العصب يبقى على سطح عضلة طبقة الخلية. هذه الشبكة العصبية كافيا للحفاظ على وظيفة من وحدة السيارات.
إذا كان explants تطفو على المدى المتوسط بعد يوم من تعصيب، فإنها لن تلتزم. هذا يحدث عندما طبقة الخلايا العضلية هييضاف ليس متكدسة بما فيه الكفاية، أو عندما يكون متوسط تقريبا أيضا. في بعض الأحيان، وسوف تلتزم يزدرع neurites لكن لا تظهر. وهذا هو الأرجح بسبب عدم وجود DRG المرتبطة به. في هذه الحالة كذلك، لن تعصيب تنشأ. التلاعب في أطباق بعناية شديدة في الأسبوع الأول، كما يمكن فصل explants لا يزال بسهولة. لتبادل وسائل الاعلام الانصهار، وإضافة السائل التسرب من الحكمة مع سرعة الحد الأدنى لتجنب انفصال الخلية.
الشكل 1. الحبل الشوكي explants العضلات الخلية شارك في الثقافات من يوم 1 إلى يوم 15.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وهناك أداة الفسيولوجية في المختبر لدراسة العضلات وظيفة الخلية في السياق الطبيعي والمرضي هو أعلى من الفائدة للmyologists، وذلك لأن مزارع الخلايا العضلية عادة لا تلخص أهمية خلايا متعددة واتصالات من نوع الخلية. إضافة تنقية الخلايا العصبية الحركية إلى خلايا العضلات ليست كافية لتحقيق وحدة محرك وظيفي منذ مطلوب من وجود خلايا شوان لتعصيب لتكون فعالة (5) وليس طبوغرافيا (3D + التوزيع الخاصة) ذات الصلة البروتوكول، المذكورة هنا قد استخدمت بنجاح لتأسيس خلايا العضلات معصب
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا ما يكشف.
شكر وتقدير
ويدعم عملنا من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (SNF)، والمبادرة السويسرية في بيولوجيا الأنظمة (SystemsX.ch)، والضمور العضلي جمعية الولايات المتحدة الأمريكية (نجمة داود الحمراء)، والفرنسية جمعية مناهضة ليه الاعتلالات العضلية (فؤاد)، والميتوكوندريا المتحدة مرض مؤسسة (UMDF)، وغيبرت في الجبهة المتحدة الثورية مؤسسة برنامج الأمراض النادرة (GRF)، والجمعية السويسرية للأبحاث في أمراض العضلات (SSEM / FSRMM)، والسويسري ايف "Jubiläumsstiftung FÜR Volksgesundheit اوند medizinische Forschung" للأبحاث روش المؤسسة والجامعة من بازل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | |
| HBSS | Gibco / إينفيتروجن | 14170 | |
| MEM | Gibco / إينفيتروجن | 31095 | |
| متوسط 199 | Gibco / إينفيتروجن | 31153 | |
| الأبقار مصل الجنين | استنساخ الأجنة Perbio | SH30066.03 | |
| أنسولين | سيغما | I9278 | |
| الإنسان EGF | سيغما | E9644 | |
| الإنسان جمعية جيل المستقبل | SIGMA | F0291 | |
| البنسلين / الستربتومايسين حل | Gibco | 15140 |
المراجع
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
