مقالة منهجية

تحليل للهجرة كريست العصبية والتمايز بواسطة الصليب الأنواع زرع

DOI:

10.3791/3622

⸱

فبراير 7, 2012

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف هذا النهج لتحليل الهجرة والمصير النهائي من الطيور الخلايا العصبية في قمة السمان، فرخ أجنة خيالية. هذا الأسلوب هو أسلوب بسيط ومباشر لتعقب الخلايا العصبية خلال قمة للهجرة والتمايز التي يصعب على خلاف ذلك للتمييز في جنين الفرخ unmanipulated.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر الأجنة الطيرية منصة فريدة لدراسة العديد من عمليات النمو في الفقاريات، وذلك بسبب سهولة الوصول إلى الأجنة داخل البيضة. وتجمع الأجنة الطيرية الخيمرية، التي يتم فيها نقل أنسجة مانحة من السمان إلى جنين الدجاج in ovo، بين قوة الوسم الجيني الدائم للمجموعات الخلوية وسهولة التعامل التي يوفرها الجنين الطيري.

تُعد الكيميرات الهجينة من السمان والدجاج أداة كلاسيكية لتتبع خلايا العرف العصبي (NCCs) المهاجرة1-3. وخلايا العرف العصبي هي مجموعة مؤقتة من الخلايا المهاجرة في الجنين، تنشأ في المنطقة الظهرية للأنبوب العصبي النامي4. وتخضع هذه الخلايا لتحول ظهاري متوسطي، ثم تهاجر لاحقاً إلى مناطق أخرى من الجنين، حيث تتمايز إلى أنواع خلوية مختلفة تشمل الغضاريف5-13، والخلايا الميلانينية11,14-20، والعصبونات والخلايا الدبقية21-32. وتتميز خلايا العرف العصبي بأنها متعددة القدرات، ويتأثر مصيرها النهائي بـ 1) منطقة الأنبوب العصبي التي نشأت منها على طول المحور الرأسي-الذيلي للجنين11,33-37، 2) الإشارات الواردة من الخلايا المجاورة أثناء هجرتها38-44، و3) البيئة المجهرية لوجهتها النهائية داخل الجنين45,46. إن تتبع هذه الخلايا من نقطة منشئها في الأنبوب العصبي وصولاً إلى موقعها ومصيرها النهائي داخل الجنين يوفر رؤى هامة حول العمليات التنموية التي تنظم التنميط وتخلق الأعضاء.

يمكن أن يكشف نقل مناطق متكاملة من الأنبوب العصبي للمانح (الزراعة المتجانسة) أو مناطق مختلفة من الأنبوب العصبي للمانح (الزراعة غير المتجانسة) عن الاختلافات في التحديد المسبق لخلايا العرف العصبي (NCCs) على طول المحور الرأسي-الذيلي2,47. ويمكن تكييف هذه التقنية بشكل أكبر لنقل جزء أحادي الجانب من الأنبوب العصبي، بحيث يكون أحد الجانبين مشتقاً من أنسجة المانح، بينما يظل الجانب المقابل غير متأثر في جنين المضيف، مما يوفر ضابطاً داخلياً ضمن العينة نفسها2,47. كما يمكن تكييفها لنقل قطع دماغية في أجنة في مراحل لاحقة، بعد المرحلة HH10، عندما يكون الأنبوب العصبي الأمامي قد أغلق47.

نعرض هنا تقنيات لتوليد كيميرات (أجنة هجينة) من السمان والدجاج عبر زراعة الأنبوب العصبي، والتي تسمح بتتبع خلايا العرف العصبي (NCCs) المهاجرة والمشتقة من جزء محدد من الأنبوب العصبي. يتيح الوسم النوعي للخلايا المشتقة من المانح باستخدام جسم مضاد QCPN الخاص بالسمان48-56 للباحث التمييز بين خلايا المانح والمضيف عند نقطة النهاية التجريبية. وتتميز هذه التقنية بأنها مباشرة وغير مكلفة ولها تطبيقات عديدة، بما في ذلك رسم خرائط المصير، وتتبع سلالة الخلايا، وتحديد أحداث التنميط المسبق على طول المحور الرأسي-الذيلي45. ونظراً لسهولة الوصول إلى الجنين الطيري، يمكن دمج تقنية تطعيم السمان والدجاج مع إجراءات أخرى، تشمل على سبيل المثال لا الحصر استئصال العدسة40، أو حقن جزيئات مثبطة57,58، أو التلاعب الجيني عبر التثقيب الكهربائي لبلازميدات التعبير59-61، وذلك لتحديد استجابة تدفقات مهاجرة معينة من خلايا العرف العصبي للاضطرابات في البرنامج التنموي للجنين. علاوة على ذلك، يمكن استخدام تقنية التطعيم هذه أيضاً لتوليد أجنة كيميرية بين أنواع أخرى، مثل كيميرات السمان والبط لدراسة مساهمة خلايا العرف العصبي في التشكيل الوجهي القحفي، أو كيميرات الفأر والدجاج للجمع بين قوة علم وراثة الفأر وسهولة التعامل مع الجنين الطيري.62

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. احتضان الفرخ والبيض السمان إلى المرحلة المطلوبة

لHH9 الأجنة، مرات حضانة نموذجية تتراوح بين 29-33 ساعة عند 38 درجة مئوية 63

  1. غسل أي حطام من البيض مع الماء الفاتر.
  2. ترتيب بيض الدجاج في صينية أفقيا. بمناسبة جانب مواجهة مع قلم رصاص، وهذا سوف تتطابق مع المنطقة حيث سيتم ترجمة الجنين. احتضان البيض السمان نهاية حادة تصل.
  3. مكان في 38 درجة مئوية حاضنة مرطب. بدوره على هزاز وظيفة.

2. تحضير البيض للتشريح والنوافذ

  1. إزالة البيض من الحاضنة، وتعقيم قمم مع الايثانول 70٪. فمن الأفضل للرش على الايثانول ومحوها بسرعة مع منشفة ورقية أو Kimwipe لتجنب أي امتصاص من الايثانول من خلال قشرة البيضة.
  2. مكان بيضة دجاج على حامل البيض الفردية (نستخدم طبق بيتري واصطف مع مناشف ورقية مطوية، على سبيل المثال، "Kimwipes"). باستخدام ملقط AA، استفادة من الحول صغيره إلى السطح العلوي من قشر البيض في نهاية مدببة للبويضة.
  3. إزالة 1.5 3mL الضوء زلال البيض من الدجاج مع إبرة تحت الجلد G 18 ونصف و 5 مل حقنة. فمن الأفضل أن يدخل الإبرة عموديا في الحفرة، مع شطبة التي تواجه نهاية مدبب من البيض (الشكل 2A). بهذه الطريقة، عندما يتم سحب الزلال، وهناك خطر كبير من الإضرار بطريق الخطأ صفار البيض عن طريق الشفط. تجاهل الزلال. هذه الخطوة سوف تقلل من صفار البيض والجنين داخل البيضة للسماح للنافذة التي سيتم افتتاحها في قشرة البيضة.
  4. مسح حفرة مع الايثانول 70٪ كما هو موضح أعلاه، وختم ذلك مع لاصق شفاف. من المهم أن قشر البيض المحيطة ثقب يخلو تماما من الزلال وجافة أو لاصق وختم لا.
  5. مع ملقط AA، اضغط على آخر ثقب في سطح العلوي واضح للبويضة أفقي، ليست واردة في ذروة. والحرص على عدم السماح للملقط يذهب بعيدا عن طريق قشر البيض لتجنب إتلاف صفار البيض أو الجنين.
  6. فيسرت جانب واحد من ملقط القزحية المنحني في حفرة موازية للقشرة البيض. معسر أسفل على قذيفة، والعمل في حركة دائرية لكسر ~ 2 سم في نافذة قطر في الدجاج قشرة البيضة. تجاهل قشر البيض إزالتها. بدلا من ذلك، تغطي السطح العلوي للبيضة مع التعبئة الشريط واستخدم مقصا لقطع خارج النافذة. هذا يقلل من فرصة للحطام قشر البيض الوقوع في البيضة. وينبغي أن الجنين تظهر على شكل قرص معتم على أعلى من صفار البيض. تجاهل أي بويضة غير مخصبة (التي حددتها بقعة صغيرة بيضاء على السطح من صفار البيض، أو عدم وجود الأريمة).
  7. حقن كمية صغيرة من الحبر الهند (1:10 المخفف في حل قارع الأجراس العقيمة التي تحتوي على "القلم / بكتيريا" مضاد حيوي: تركيز نهائي 100 ميكروغرام / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل) تحت الأريمة للمساعدة في تنظيم الجنين. استخدم حقنة 1 مل و 26 ونصف G إبرة تحت الجلد، عازمة في زاوية 45 درجة في قاعدة الإبرة، مع شطبة مواجهة، بدلا من ذلك، واحد أماهذ استخدام الماصة سحبت باستور الزجاج والفم جهاز pipetting (ارتداء حماية العين عند الانحناء إبرة تحت الجلد أو كسر زجاج إبرة). ثقب في الغشاء المحي خارج محيط الأريمة وحرك رأس الإبرة تحت الجنين، على مقربة من سطح الصفار ولكن ليس في الطبقات الجنينية (الشكل 2B). حقن الحبر ما يكفي لتحديد الجنين، ثم سحب بعناية الإبرة (الشكل 2C). ويمكن حقن الحبر الكثير يؤدي إلى الوفاة جنين. من المهم عدم ضخ أي فقاعات هواء تحت الجنين، وهذا يمكن أن تكون مصدرا للتلوث. ملاحظة: يتم تعقيمها حل جميع رينغر المستخدمة في هذا الإجراء، ويحتوي القلم / بكتيريا على النحو المحدد أعلاه. مخزنة فوسفات العقيمة المالحة (PBS) هو أيضا بديلا مقبولا إلى حل قارع الأجراس في جميع خطوات من هذا البروتوكول.
  8. مرحلة الجنين وفقا للهمبرغر وهاميلتون 63 وسجل المرحلة على قشر البيض في حبر دائم أو قلم رصاص. ويتم تقييم أفضل مراحل تحت إستيرomicroscopy، مع الألياف البصرية مصادر "gooseneck" الخفيفة التي لديها الحمل الحراري محدود.
  9. تطبق 2-3 قطرات حل قارع الأجراس معقم دافئ على السطح من جنين لمنع الجفاف والتلوث. اغلاق النافذة مؤقتا مع parafilm امتدت على سطح البيضة.
  10. كرر الخطوات من 2،2-2،9 مع كل بيض الدجاج قبل البدء في تجارب زراعة.
  11. منذ تستخدم فقط أجنة السمان لأنسجة المانحة، وربما في خطوات OVO يتم حذف 2،2-2،9. لإعداد OVO السابقين من الأجنة المانحة، ويتم تحضين بيض السمان الجانب كليلة وفتحها في هذه المنطقة مع ملقط المنحني للكشف عن الجنين. باستخدام مقص تشريح، وجعل 4 تخفيضات في شكل مربع من خلال الغشاء المحي والأريمة خارج الجنين (للتأكد من أن جميع التخفيضات تلبية). باستخدام ملقط منحني قزحية، فهم بلطف حافة واحدة خفض ورفع جنين من بيضة وتحويلها إلى حل قارعو الأجراس في طبق بيتري. بدلا من ذلك، يمكن للمرء استخدام منحنىد قزحية ملقط لرفع جنين رفعه من تحت، أو ملعقة جنين أو البلاستيك ماصة نقل قطع طريق على نطاق أوسع جزء من اسطوانة، ويمكن أن تستخدم لنقل الجنين للخروج من البيض. إزالة بلطف الغشاء المحي مع # 5 ملقط. جمع الأجنة السمان المتبقية على النحو الوارد أعلاه، ويصتطدم تحت المجهر تشريح.

3. إعداد الجنين المضيف في الحصول على الكسب غير المشروع

  1. إزالة parafilm من المضيف (كتكوت) الجنين وباستخدام إبرة التنغستن شحذ أو ملقط # 5، احداث ثغرة صغيرة في الغشاء المحي في المنطقة المطلوب في الأنبوب العصبي (الشكل 3A).
  2. إضافة قطرة من محلول رينغر إلى الجنين. العناية للحفاظ على الجنين مغمورة تماما في حل رينغر أثناء إجراء كامل لمنع جفاف الأنسجة. مضيفا أن تبقي قطرات من محلول رينغر إلى السطح من الجنين عن طريق نقل ماصة إذا لزم الأمر.
  3. باستخدام إبرة زجاج سحب، وجعل بعناية منقاري وكاليفورنياشقوق عرضية udal المقابلة لطول والمنطقة التاريخية في أنبوب للالعصبية الظهرية. (يتم إنشاؤها الإبر زجاج سحبها من الانابيب الزجاجية السيليكون الشعرية التي تم سحبها تحت حرارة مع إبرة سحب الجهاز.) للحصول على الطعوم من جانب واحد وينبغي أن الشقوق تمتد فقط إلى تجويف الأنبوب العصبية الظهرية، والطعوم الثنائية، وجعل الشقوق عبر كامل الأنبوب العصبي ظهري. ثم قص ثنائيا بين الأنبوب العصبي ظهري والأديم المتوسط ​​مجاور للمحور.
  4. بعناية فصل يزدرع استئصاله من الأنبوب العصبي ثم إزالته من الجنين بواسطة الشفط في micropipette زجاج (الشكل 3B).

4. تحضير الأنسجة الكسب غير المشروع من الجهات المانحة

  1. اختيار مرحلة المطابقة جنين السمان. عقد الجنين إلى أسفل مع ملقط AA، وإزالة الغشاء المحي، والمكوس منطقة مماثلة الحجم من الأنبوب العصبي كما هو موضح أعلاه (3،3-3،4) (الشكل 3A'-B '). تبعا لاحتياجات من تجربتك، قد تكون هذه المنطقةمكمل المنطقة من الأنبوب (كتكوت) المضيف العصبية أو من منطقة مختلفة على طول المحور rostro-الذيلية. (ملحوظة: لترقيع أكبر الإقليمية، بما في ذلك الطعوم كاملة الأنبوب العصبي، قد الباحثين يرغبون في إضافة الهضم البروتيني في هذه الخطوة لإزالة أي نوع من الأنسجة الملتصقة الوسيطة من النسيج المتبرع قبل زرع ومع ذلك، للشركات الصغيرة ظهري ترقيع الأنبوب العصبي في المراحل المبكرة. ، كما هو مفصل هنا، الهضم البروتيني وليس من الضروري كما يتم فصل بسهولة الأنبوب العصبي من اللحمة المتوسطة المجاورة من خلال التقنيات الجراحية بدقة.)

5. الكسب غير المشروع والأنسجة

  1. نضح في يزدرع المانحة الى micropipette الزجاجية التي تحتوي على محلول رينغر. يجب الحرص على عدم إدخال أي فقاعات في ماصة.
  2. نقل يزدرع المتاخمة للمنطقة رفعه للمضيف الفرخ. سحبت باستخدام إبرة زجاج، توجيه وإرشاد يزدرع برفق الى المنطقة ذاب (الشكل 3C).
  3. إضافة بعناية بضع قطرات من محلول رينغرالى جنين لمنع الجفاف. الحرص على تجنب إسقاط السائل مباشرة على موقع الكسب غير المشروع، لأن هذا قد طرد الكسب غير المشروع.
  4. اغلاق النافذة مع التعبئة الشريط. تأكد من أن الشريط الأختام المنطقة كلها من البيض في إطارات. هذا يمنع جفاف وتلوث الجنين خلال حضانة لاحق.
  5. عودة البيض إلى الحاضنة حتى المرحلة المرجوة. تأكد من تشغيل "هزاز" وظيفة، في حين وتفرخ في الوهم. قد يكون البيض تحول بلطف باليد مرتين في اليوم لأن ذلك قد يزيد من قدرتها على الاستمرار في حال استهدفت مراحل لاحقة من التطور.

6. إعداد أجنة خيالية لباجتزاء

  1. في نقطة النهاية التجريبية، وقطع الشريط الذي يغطي النافذة باستخدام مقص غرامة.
  2. فهم على حافة الأريمة بالملقط قزحية منحنية (أسهل أن تفعل مع نصائح مسننة)، ثم قطع جنين بعيدا عن صفار البيض مع 4 تخفيضات كبيرة خارج حدود الأريمة.
    3. نقل الجنين إلى طبق بتري تحتوي على محلول رينغر. رعاية للحد من التعرض للجنين في الهواء من اجل تجنب جفاف الأنسجة.
  3. تحت stereomicroscopy، فصل بلطف الغشاء المحي من الأريمة باستخدام # 5 ملقط.
  4. بعناية ترتيب جنين في الصحن بحيث تكون الجنين في الاتجاه نفسه كما كان في البيضة، مع الأغشية المحيطة التي وضعت شقة.
  5. تشريح استخدام الإبر مصنوعة من أسلاك التنجستن 64 لإزالة نظيفة للالأريمة المحيطة بها من الجنين عن طريق ترتيب الإبرة على الحدود من الجنين والأنسجة خارج الجنين، مع طول سلك التنغستن مواز لقاع الطبق. تستخدم حركة نشر لطيف لقطع طريق الأنسجة.
  6. إزالة بعناية السلى مع # 5 ملقط. عند هذه النقطة قد، ترغب في مزيد إما تشريح المنطقة من اهتمامك، أو يترك كله جنين.
  7. نقل الجنين إلى paraf الباردة الجليد 4٪ormaldehyde والصخور بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  8. تحضير العينات وتضمين لباجتزاء البرد أو البارافين.

تتبع الأنسجة المطعمة داخل الجنين المضيف. هناك أساليب عدة لتحديد الأنسجة السمان في جنين الفرخ، بما في ذلك الكشف عن نويات السمان بواسطة تلوين الهيماتوكسيلين (السمان نواة لديها كبيرة جدا، والادراج المظلمة تلطيخ من نوى كتكوت)، رد فعل Feulgen-Rossenbeck، أكريدين البرتقالي أو بيز بينزاميد، وصمة عار جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني، أو الوسم المناعي لالسمان محددة المستضدات 3،47،65،66. هنا نستخدم مستضد QCPN ومعيار كل جبل أو قسم تقنيات المناعي للتعرف على الخلايا العصبية في قمة السمان السمان، فرخ الوهم (الشكل 4). هذه التقنية توفر أقصى المرونة في التصميم التجريبي، كما يمكن أيضا لالمناعي QCPN يمكن الجمع بين الأضداد مع الآخرين لتحديد الخلايا المتميزة المستمدة من الأنسجة (السمان) من الجهات المانحة. استخدم standaالثالث كامل جبل أو تقنيات المناعي قسم لتسمية السمان المشتقة من الخلايا في الوهم.

7. ممثل النتائج

صورة ممثل المنطقة المطعمة في الأنبوب العصبي بعد 6H من حضانة إعادة (لHH11) ويبين دمج المتوقعة من الأنسجة المطعمة (السمان) المانحة إلى المضيف (كتكوت) الأنبوب العصبي (الشكل 4A). يجب التخلص من الأجنة غير مكتملة تظهر التكامل من الكسب غير المشروع، أو التنمية غير المتكافئة في المنطقة أو في الجمجمة بعد somites reincubation.

عبور قسم من خلال المنطقة المطعمة البلدان المساهمة الصافية في المعرض HH11 المسمى مع HNK-1 المهاجرة بعيدا أفقيا من الأنبوب العصبي. وصفت بشكل واضح الخلايا السمان المساهمة في تيار NCC المهاجرة، والأنبوب العصبي، مع QCPN (الشكل 4B).

في مراحل لاحقة، يمكن أن تعزى السمان NCC المشتقة من الخلايا لأنسجتهم الهدف النهائي. ويتخلل خلايا QCPN المسمى داخل كتكوت اللحمة المتوسطة جنينعملية الفك العلوي في E5 (الشكل 4C).

ويمكن للأجسام المضادة QCPN مجتمعة بسهولة مع الأجسام المضادة الأخرى للنظر في التمييز بين السمان المستمدة من البلدان المساهمة الصافية في البيئة المضيفة. وصفت السمان NCC المشتقة من الخلايا العصبية الحسية مثلث التوائم بواسطة QCPN وTuj1 الأجسام المضادة (الشكل 4D).

figure-protocol-1
الشكل 1. وينبغي أن نظرة عامة على إجراء التجارب والأدوات اللازمة. مضيف) (كتكوت) والأجنة المانحة (السمان) قد يكون مرحلة المتطابقة. لتسمية تيار NCC التي تساهم في عقدة العصب الثلاثي التوائم ومنطقة الفكين، HH9 مثالية. في HH9، الأنبوب العصبي هو بداية ليغلق في المنطقة منقاري، ولكن لم يتم حتى الآن مغلقة تماما. خط رمادي في المخططات يمثل خط الوسط لإغلاق أنبوب العصبي. خطوط بيضاء منقطة تشير إلى قطع خطوط لاستئصال منطقة الدماغ المتوسط ​​من الجانب الأيمن من الأنبوب العصبي من المضيفة والمانحة مbryos. يتم تجاهل منطقة استئصاله من الجنين المضيفة والمانحة زرع الأنسجة في لتوليد الجنين خيالية. B) الأدوات اللازمة ما يلي: حقنة) 5mL مع 18 ونصف G إبرة تحت الجلد، ب) 1 حقنة مل مع 26 ونصف G عازمة إبرة تحت الجلد في 45 درجة حبر الهند زاوية، ج)، د) شريط التغليف واضحة، ه) ماصة الزجاج مع الفم pipetting جهاز، و) 60 ملم، طبق بتري، ز) AA ملقط، ح) منحني ملقط القزحية مع نصائح مسنن، ط) # 5 ملقط، ي) مقص غرامة، ك) شحذ سلك التنجستن، ل) وسحبت زجاج إبرة، م) parafilm المربعات.

figure-protocol-2
الشكل 2. تحضير البيض والأجنة. A) مستعرضة رسم بياني للبويضة، بما في ذلك نقطة الإدراج المثالي من 18 ونصف G إبرة تحت الجلد للانسحاب من ضوء الزلال. ب) بعد سحب ~ 3mL من الزلال الخفيفة، وصفار البيض وجنين يقلل من داخل البيضة، مما يسمح للباحثين لخفض "نافذة" (الأسهم) في رانه قشر البيض للوصول إلى الجنين. الهند الحبر، 1:10 المخفف في حل قارع الأجراس العقيمة التي يمكن، ثم يتم حقن تحت الأريمة لتقديم المقابل لتنظيم سهل من الأجنة. C) جنين الفرخ بعد التحبير.

figure-protocol-3
الشكل 3. التخطيطي وأمثلة من أجنة مرحلة سمو المانحة والمضيفة 9 في كل خطوة من خطوات إجراء عمليات ترقيع. مضيف الفرخ) جنين. الخطوط المتقطعة في الرسم البياني تشير إلى حيث يجب أن تمزق الغشاء المحي للوصول إلى منطقة الجمجمة للتطعيم. وينبغي مقشر ممزقة مرة واحدة في رفرف الثلاثي من الغشاء المحي caudally. في المربع يشير إلى صورة أقحم المستخدمة في (قبل الميلاد). A ') السمن جنين من الجهات المانحة. الصورة هي لجنين المانحة استئصاله من البيض ويوضع في طبق بيتري لتشريح الأنسجة الكسب غير المشروع. في المربع يشير إلى صورة أقحم المستخدمة في (B '). الخطوط المتقطعة في الرسم التخطيطي (A ') تشير إلى حيث يجب أن يتم خفض المحي والأغشية صفار من أجل إزالة تيكان الجنين من بويضة. ب) الجنين المضيف مع منطقة المخ الأوسط من جانب واحد من الأنبوب العصبي استئصاله (السهام البيضاء) في انتظار الكسب غير المشروع. الخط المنقط في الرسم التخطيطي حيث يشير ينبغي بذل تخفيضات على أنبوب للضريبة العصبية في منطقة الدماغ المتوسط. جنين ب 'الجهات المانحة) مع ظهري الأنبوب العصبي الأنسجة الكسب غير المشروع استئصاله (الأنسجة الكسب غير المشروع المشار إليها السهام السوداء). الخط المنقط في الرسم البياني يشير إلى حيث ينبغي أن التخفيضات في جنين السمان إلى الأنسجة المتبرع الاستهلاك من جانب واحد لترقيع للمنطقة الدماغ المتوسط ​​في الأنبوب العصبي. C) جنين همي بعد تطعيم السمان ظهري يزدرع الأنبوب العصبي في الدماغ المتوسط ​​كتكوت المنطقة.

figure-protocol-4
الشكل 4. المناعي كشف السمان محددة QCPN مستضد النووية في المانحة المشتقة من الخلايا في جنين خيالية. A) الجامع جبل صورة HH11 الوهم (المطعمة في HH9) تظهر تلطيخ QCPN في الحمراء، وHNK-1 تلطيخ (علامة من البلدان المساهمة الصافية المهاجرة) فيأخضر. 10X التكبير، نظرا ظهري. B) من خلال قسم الصليب في جنين (A)، والتي تبين الخلايا السمان QCPN إيجابية مستمدة في الأنبوب العصبي وNCC المهاجرة المشارك ملطخة HNK-1 (الأخضر). 40X التكبير. C) مقطع عرضي من خلال عملية الفك العلوي من E5 الوهم (تحضين لمدة 3 أيام طعم آخر)، والتي تبين QCPN إيجابية لجنة التنسيق الوطنية المستمدة من الخلايا (الحمراء) التي هاجرت من المنطقة المطعمة في الأنبوب العصبي إلى موقعها النهائي في جنين. 10X التكبير. D) القسم من خلال مساهمة الوهم E5 تبين من السمان المستمدة NCC إلى عقدة العصب الثلاثي التوائم (الحمراء) والتمايز في TuJ1 إيجابية الخلايا العصبية (الخضراء). 40X التكبير. *، البلدان المساهمة الصافية، عضو البرلمان، وعملية الفك العلوي، NT، الأنبوب العصبي، TG، عقدة مثلث التوائم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصف عمليات ترقيع من الأنبوب العصبي السمان في افراخ الدجاج المضيف هنا هي تقنية بسيطة وغير مكلفة لتعقب مجموعات سكانية فرعية محددة من الهجرة البلدان المساهمة الصافية النابعة من مناطق مختلفة على طول المحور rostro-الذيلية 21،67-69. هذه التقنية تستفيد من سهولة الحصول على أجنة الطيور (بالمقارنة مع أجنة الثدييات)، ويمكن الجمع مع غيرها من التقنيات، مثل الاجتثاث الأنسجة، وحقن الجزيئات المثبطة، أو عن طريق التلاعب الجيني electroporation من البلازميدات التعبير، لدراسة التجربة في اس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر أعضاء مختبر Lwigale للنقد من المخطوطة. ويدعم SLG من قبل L. روث زمالة NRSA كيرشتاين من المعهد الوطني للعيون (F32 EY02167301). ويدعم PYL من قبل المعهد الوطني للعيون (EY018050).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكاشف شركة فهرس العدد
بيض الدجاج مختلف - نستخدم تكساس A & M في جامعة الدواجن وزارة العلوم وتكساس.
بيض السمان مختلف - نستخدم أوزاركس الشركة البيض، MO.
البيض الحاضنة (رقمية عبر الاقمار الصناعية 1502 رياضي حاضنة ث / الرطوبة 110-120 فولت AC) www.poultrysupply.com 1502
دومون AA ملقط، INOX إبوكسي المغلفة أدوات العلم غرامة 11210-10
سكوتش الشريط أي مخزن مكتب التوريد
منحني إيريس الملقط أدوات العلم غرامة 11065-07
أنامطار الدوحة الدولي الجديد حبر أي متجر فن العرض
القلم / بكتيريا (البنسلين، الستربتوميسين) الحل VWR الدولية 101447-068
التعبئة الشريط واضح أي مخزن مكتب التوريد
إبرة جهاز سحب Narashige، اليابان PE-21
سحبت إبرة الزجاج، وجعلت 1،5-1،8 100mm س أنبوب زجاجي البورسليكات الشعرية كيمبل مطاردة 34500 99
سحبت زجاج ماصة، جعلت من 5 ¾ "باستور ماصة فيشر العلمية 13-678-6A
الفم ماصة جهاز (الشافطة الجمعية أنبوب للماصة microcapillary معايرة) سيغما الدريخ A5177-52A
دومون # 5 ملقط أدوات العلم غرامة 11251-30
برميل للخمرسلك gsten، وقطره 0.1mm VWR الدولية AA10404-H2
أصحاب الإبرة (مطلي بالنيكل حائز دبوس) أدوات العلم غرامة 26018-17
QCPN ضدي الدراسات التنموية ورم هجين البنك، جامعة ولاية ايوا QCPN
اليكسا فلور الأضداد الثانوية (على سبيل المثال، اليكسا فلور 594 ماعز مكافحة فأر IgG1) إينفيتروجن A21125
محلول رينغر (2L):
  • 14.4g كلوريد الصوديوم
  • 0.34g CaCl 2
  • 0.74g بوكل
  • 0.230g نا 2 هبو 4
  • 0.04g KH 2 PO 4
  • DDH 2 O إلى 2L
  • التصفية والتعقيم
كل الكواشف من العلم فيشر
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-79-4
  • 7778-77-0

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Le Douarin, G., Renaud, D. Morphologic and physiologic study of the differentiation in vitro of quail embryo precardial mesoderm. Bull. Biol. Fr. Belg. 103 (3), 453-468 (1969).
  2. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods. Mol. Biol. 461, 337-350 (2008).
  3. Le Douarin, N. A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology. Dev. Biol. 30 (1), 217-222 (1973).
  4. Noden, D. M. An analysis of migratory behavior of avian cephalic neural crest cells. Dev. Biol. 42 (1), 106-130 (1975).
  5. Johnston, M. C. A radioautographic study of the migration and fate of cranial neural crest cells in the chick embryo. Anat. Rec. 156 (2), 143-155 (1966).
  6. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. I. Skeletal and connective tissues. Dev. Biol. 67 (2), 296-312 (1978).
  7. Oka, K. The role of TGF-beta signaling in regulating chondrogenesis and osteogenesis during mandibular development. Dev. Biol. 303 (1), 391-404 (2007).
  8. Chai, Y. Fate of the mammalian cranial neural crest during tooth and mandibular morphogenesis. Development. 127 (8), 1671-1679 (2000).
  9. Lengele, B., Schowing, J., Dhem, A. Embryonic origin and fate of chondroid tissue and secondary cartilages in the avian skull. Anat. Rec. 246 (3), 377-393 (1996).
  10. Le Douarin, N. M., Ziller, C., Couly, G. F. Patterning of neural crest derivatives in the avian embryo: in vivo and in vitro studies. Dev. Biol. 159 (1), 24-49 (1993).
  11. Lallier, T. E. Cell lineage and cell migration in the neural crest. Ann. N.Y. Acad. Sci. 615, 158-171 (1991).
  12. Nakamura, H. Mesenchymal derivatives from the neural crest. Arch. Histol. Jpn. 45 (2), 127-138 (1982).
  13. Le Lievre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 34 (1), 125-154 (1975).
  14. Rawles, M. E. The Development of Melanophores from Embryonic Mouse Tissues Grown in the Coelom of Chick Embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (12), 673-680 (1940).
  15. Rawles, M. E. The Pigment-Forming Potency of Early Chick Blastoderms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (1), 86-94 (1940).
  16. Mosher, J. T. Intrinsic differences among spatially distinct neural crest stem cells in terms of migratory properties, fate determination, and ability to colonize the enteric nervous system. Dev. Biol. 303 (1), 1-15 (2007).
  17. Dupin, E., Le Douarin, N. M. Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene. 22 (20), 3016-3023 (2003).
  18. Faraco, C. D., Vaz, S. A., Pastor, M. V., Erickson, C. A. Hyperpigmentation in the Silkie fowl correlates with abnormal migration of fate-restricted melanoblasts and loss of environmental barrier molecules. Dev. Dyn. 220 (3), 212-225 (2001).
  19. Selleck, M. A., Bronner-Fraser, M. Avian neural crest cell fate decisions: a diffusible signal mediates induction of neural crest by the ectoderm. Int. J. Dev. Neurosci. 18 (7), 621-627 (2000).
  20. Stocker, K. M., Sherman, L., Rees, S., Ciment, G. Basic FGF and TGF-beta 1 influence commitment to melanogenesis in neural crest-derived cells of avian embryos. Development. 111 (2), 635-645 (1991).
  21. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Experimental analysis of the migration and differentiation of neuroblasts of the autonomic nervous system and of neurectodermal mesenchymal derivatives, using a biological cell marking technique. Dev. Biol. 41 (1), 162-184 (1974).
  22. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. II. Neural tissues. Dev. Biol. 67 (2), 313-329 (1978).
  23. Barraud, P. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (49), 21040-21045 (2010).
  24. Li, H. Y., Say, E. H., Zhou, X. F. Isolation and characterization of neural crest progenitors from adult dorsal root ganglia. Stem Cells. 25 (8), 2053-2065 (2007).
  25. Carney, T. J. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
  26. Maro, G. S. Neural crest boundary cap cells constitute a source of neuronal and glial cells of the PNS. Nat. Neurosci. 7 (9), 930-938 (2004).
  27. Bronner-Fraser, M. Molecular analysis of neural crest formation. J. Physiol. Paris. 96 (1-2), 3-8 (2002).
  28. Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Development. 128 (20), 3949-3961 (2001).
  29. Britsch, S. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
  30. Bronner-Fraser, M. Origin of the avian neural crest. Stem Cells. 13 (6), 640-646 (1995).
  31. Jessen, K. R., Mirsky, R. Neural development. Fate diverted. Curr. Biol. 4 (9), 824-827 (1994).
  32. Le Douarin, N., Dulac, C., Dupin, E., Cameron-Curry, P. Glial cell lineages in the neural crest. Glia. 4 (2), 175-184 (1991).
  33. Chan, W. Y., Cheung, C. S., Yung, K. M., Copp, A. J. Cardiac neural crest of the mouse embryo: axial level of origin, migratory pathway and cell autonomy of the splotch (Sp2H) mutant effect. Development. 131 (14), 3367-3379 (2004).
  34. Bronner-Fraser, M. Segregation of cell lineage in the neural crest. Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (4), 641-647 (1993).
  35. Peters-vander Sanden, M. J., Luider, T. M., vander Kamp, A. W., Tibboel, D., Meijers, C. Regional differences between various axial segments of the avian neural crest regarding the formation of enteric ganglia. Differentiation. 53 (1), 17-24 (1993).
  36. Kuratani, S., Bockman, D. E. Capacity of neural crest cells from various axial levels to participate in thymic development. Cell Tissue Res. 263 (1), 99-105 (1991).
  37. Leblanc, G. G., Epstein, M. L., Bronner-Fraser, M. E. Differential development of cholinergic neurons from cranial and trunk neural crest cells in vitro. 137 (2), 318-330 (1990).
  38. Golding, J. P., Trainor, P., Krumlauf, R., Gassmann, M. Defects in pathfinding by cranial neural crest cells in mice lacking the neuregulin receptor ErbB4. Nat. Cell. Biol. 2 (2), 103-109 (2000).
  39. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R. Cranial neural crest migration: new rules for an old road. Dev. Biol. 344 (2), 543-554 (2009).
  40. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Semaphorin3A/neuropilin-1 signaling acts as a molecular switch regulating neural crest migration during cornea development. Dev. Biol. 336 (2), 257-265 (2009).
  41. Killian, O. lesnicky, Birkholz, E. C., A, D., Artinger, K. B. A role for chemokine signaling in neural crest cell migration and craniofacial. Dev. Biol. 333 (1), 161-172 (2009).
  42. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67 (1), 47-56 (2007).
  43. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the chick. Dev. Dyn. 232 (4), 939-949 (2005).
  44. Kanzler, B., Foreman, R. K., Labosky, P. A., Mallo, M. BMP signaling is essential for development of skeletogenic and neurogenic cranial neural crest. Development. 127 (5), 1095-1104 (2000).
  45. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  46. Goldstein, A. M., Nagy, N. A bird's eye view of enteric nervous system development: lessons from the avian embryo. Pediatr. Res. 64 (4), 326-333 (2008).
  47. Le Douarin, N., Dieterlen-Lievre, F., Creuzet, S., Teillet, M. A. Quail-chick transplantations. Methods Cell. Biol. 87, 19-58 (2008).
  48. Wingate, R. J., Lumsden, A. Persistence of rhombomeric organisation in the postsegmental hindbrain. Development. 122 (7), 2143-2152 (1996).
  49. Karagenc, L., Sandikci, M. Tissue distribution of cells derived from the area opaca in heterospecific quail-chick blastodermal chimeras. J. Anat. 216 (1), 16-22 (2010).
  50. Teague, W. J., Jayanthi, N. V., Lear, P. V., Johnson, P. R. Foregut mesenchyme contributes cells to pancreatic acini during embryonic development in a chick-quail chimera model. Pediatr. Surg. Int. 21 (3), 138-142 (2005).
  51. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  52. He, L. Three different fates of cells migrating from somites into the limb bud. Anat. Embryol. (Berl). 207 (1), 29-34 (2003).
  53. Huang, R., Zhi, Q., Christ, B. The relationship between limb muscle and endothelial cells migrating from single somite. Anat. Embryol. (Berl). 206 (4), 283-289 (2003).
  54. Hidalgo-Sanchez, M., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. Fgf8 and Gbx2 induction concomitant with Otx2 repression is correlated with midbrain-hindbrain fate of caudal prosencephalon. Development. 126 (14), 3191-3203 (1999).
  55. Verberne, M. E., Gittenberger-de Groot, A. C., Poelmann, R. E. Lineage and development of the parasympathetic nervous system of the embryonic chick heart. Anat. Embryol. (Berl). 198 (3), 171-184 (1998).
  56. Burns, A. J., Douarin, N. M. The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system. Development. 125 (21), 4335-4347 (1998).
  57. Debby-Brafman, A., Burstyn-Cohen, T., Klar, A., Kalcheim, C. F-Spondin, expressed in somite regions avoided by neural crest cells, mediates inhibition of distinct somite domains to neural crest migration. Neuron. 22 (3), 475-488 (1999).
  58. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Dev. Biol. 306 (2), 750-759 (2007).
  59. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24 (1), 43-48 (2001).
  60. Chen, Y. X., Krull, C. E., Reneker, L. W. Targeted gene expression in the chicken eye by in ovo electroporation. Mol. Vis. 10, 874-883 (2004).
  61. Sato, F., Nakagawa, T., Ito, M., Kitagawa, Y., Hattori, M. A. Application of RNA interference to chicken embryos using small interfering RNA. J. Exp. Zool. A. Comp. Exp. Biol. 301 (10), 820-827 (2004).
  62. Lwigale, P. Y., Schneider, R. A. Other chimeras: quail-duck and mouse-chick. Methods Cell. Biol. 87, 59-74 (2008).
  63. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
  64. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  65. Le Douarin, N. M. A Feulgen-positive nucleolus. Exp. Cell. Res. 77 (1), 459-468 (1973).
  66. Feulgen, R., Rossenbeck, H. Mikroskopisch-chemischer Nachweis einer Nucleinsaure vom typus der Thymonucleinsiiure und die darauf beruhende elektive Faibung von Zellkemen in mikroskopischen Praparaten. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 135, 203-252 (1924).
  67. Lwigale, P. Y., Conrad, G. W., Bronner-Fraser, M. Graded potential of neural crest to form cornea, sensory neurons and cartilage along the rostrocaudal axis. Development. 131 (9), 1979-1991 (2004).
  68. Weston, J. A. A radioautographic analysis of the migration and localization of trunk neural crest cells in the chick. Dev. Biol. 6, 279-310 (1963).
  69. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , 2nd Ed, Cambridge University Press. (2009).
  70. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 30 (1), 31-48 (1973).
  71. Douarin, N. M. L. e, Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142 (1), 17-40 (1975).
  72. Le Douarin, N. M., Renaud, D., Teillet, M. A., Le Douarin, G. H. Cholinergic differentiation of presumptive adrenergic neuroblasts in interspecific chimeras after heterotopic transplantations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72 (2), 728-732 (1975).
  73. Houssaint, E., Belo, M., Le Douarin, N. M. Investigations on cell lineage and tissue interactions in the developing bursa of Fabricius through interspecific chimeras. Dev. Biol. 53 (2), 250-264 (1976).
  74. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V., Houssaint, E., Belo, M. Ontogeny of the avian thymus and bursa of Fabricius studied in interspecific chimeras. Ann. Immunol. (Paris). 127 (6), 849-856 (1976).
  75. Fontaine, J., Le Douarin, N. M. Analysis of endoderm formation in the avian blastoderm by the use of quail-chick chimaeras. The problem of the neurectodermal origin of the cells of the APUD series. J. Embryol. Exp. Morphol. 41, 209-222 (1977).
  76. Narayanan, C. H., Narayanan, Y. On the origin of the ciliary ganglion in birds studied by the method of interspecific transplantation of embryonic brain regions between quail and chick. J. Embryol. Exp. Morphol. 47, 137-148 (1978).
  77. Lwigale, P. Y., Cressy, P. A., Bronner-Fraser, M. Corneal keratocytes retain neural crest progenitor cell properties. Dev. Biol. 288 (1), 284-293 (2005).
  78. Lwigale, P. Y. Embryonic origin of avian corneal sensory nerves. Dev. Biol. 239 (2), 323-337 (2001).
  79. Tanaka, H., Kinutani, M., Agata, A., Takashima, Y., Obata, K. Pathfinding during spinal tract formation in the chick-quail chimera analysed by species-specific monoclonal antibodies. Development. 110 (2), 565-571 (1990).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

QCPN

مقالات ذات صلة