مقالة منهجية

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

18.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/3702

⸱

مارس 26, 2012

 , 
1RNA Biology, New England Biolabs

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه الطريقة عملية تخليق in vitro عالية المردود لكل من mRNA المزود بقبعة (capped) وغير المزود بقبعة (uncapped) من بلازميد خطي يحتوي على جين لوسيفيريز Gaussia (GLuc). يتم تنقية الـ RNA، ثم تُضاف القبعة إنزيميًا إلى جزء من الـ RNA غير المزود بقبعة باستخدام إنزيم إضافة القبعة الخاص بفيروس Vaccinia. وفي الخطوة النهائية، يتم ترانسفكشن الـ mRNA في خلايا HeLa، ثم تُفحص السوائل الطافية للمزارع الخلوية لقياس نشاط اللوسيفيريز.

الملخص

In vitro النسخ هو تخليق نسخ RNA بواسطة إنزيم RNA polymerase من قالب DNA خطي يحتوي على تسلسل المحفز المقابل (T7, T3, SP6) والجين المراد نسخه (الشكل 1A). يتكون تفاعل النسخ النموذجي من قالب DNA، وإنزيم RNA polymerase، وribonucleotide triphosphates، ومثبط RNase، ومحلول منظم يحتوي على أيونات Mg2+.

غالبًا ما تكون هناك حاجة إلى كميات كبيرة من RNA عالي الجودة لمجموعة متنوعة من التطبيقات. وقد تم الإبلاغ عن استخدام النسخ in vitro في دراسات بنية RNA ووظيفته مثل عملية التوصيل1، وتجارب RNAi في الخلايا الثديية2، وتضخيم RNA المضاد للمعنى بواسطة "طريقة Eberwine"3، وتحليل المصفوفات الدقيقة4، وفي دراسات لقاحات RNA5. كما يمكن استخدام هذه التقنية لإنتاج مجسات موسومة إشعاعياً أو موسومة بصبغات6. وأفاد Warren وزملاؤه et al. مؤخراً بإمكانية إعادة برمجة الخلايا البشرية عن طريق ترنسفكشن RNA مُنسخ in vitro ومزود بغطاء (capped RNA)7. وقد صُممت مجموعة T7 High Yield RNA Synthesis Kit من شركة New England Biolabs لتخليق ما يصل إلى 180 μg من RNA لكل تفاعل بحجم 20 μl. وقد تم بنجاح نسخ RNA يصل طوله إلى 10kb باستخدام هذه المجموعة. ويمكن استخدام DNA البلازميد الخطي، ونواتج PCR، وأوليغونوكليوتيدات DNA الاصطناعية كقوالب للنسخ طالما أنها تحتوي على تسلسل محفز T7 في المنطقة العلوية (upstream) من الجين المراد نسخه.

تعد إضافة بنية غطاء للنهاية '5 في الحمض النووي الريبوزي (RNA) عملية مهمة في حقيقيات النوى، وهي ضرورية لاستقرار الـ RNA8، وكفاءة الترجمة9، والنقل النووي10، وعملية التضفير11. تتضمن هذه العملية إضافة غطاء 7-ميثيل غوانوزين عند النهاية ثلاثية الفوسفات '5 للـ RNA. ويمكن إجراء عملية إضافة الغطاء للـ RNA بعد عملية النسخ باستخدام إنزيمات إضافة الغطاء، أو بالتزامن مع عملية النسخ باستخدام نظائر الغطاء. وفي الطريقة الإنزيمية، يتم إضافة الغطاء للـ mRNA باستخدام إنزيم إضافة الغطاء من فيروس Vaccinia12,13؛ حيث يقوم الإنزيم بإضافة غطاء 7-ميثيل غوانوزين عند النهاية '5 للـ RNA باستخدام GTP وS-adenosyl methionine كمانحين (بنية cap 0). وتنتج كلتا الطريقتين RNA مغطى نشط وظيفياً ومناسباً لعمليات عفن الخلايا (transfection) أو تطبيقات أخرى14 مثل توليد RNA جينومي فيروسي لأنظمة الوراثة العكسية15 والدراسات البلورية لبروتينات الارتباط بالغطاء مثل eIF4E16.

في الطريقة الموصوفة أدناه، تُستخدم مجموعة T7 High Yield RNA Synthesis Kit من شركة NEB لتخليق نسخ RNA مُقبعة وغير مُقبعة من لوسيفيراز Gaussia (GLuc) ولوسيفيراز Cypridina (CLuc). يتم تقبيع جزء من RNA GLuc غير المُقبع باستخدام نظام Vaccinia Capping System (NEB). ويُستخدم بلازميد خطي يحتوي على جين GLuc أو CLuc ومُحفز T7 كقالب DNA. يتم ترانسفكشن RNA المنسوخ في خلايا HeLa، ثم تُقاس نشاطات اللوسيفيراز في السوائل الطافية لمزارع الخلايا. ويُستخدم RNA CLuc المُقبع كضابط داخلي لمعايرة تعبير GLuc.

البروتوكول

تتواجد إنزيمات RNases بشكل شائع على الجلد والشعر والغبار وأسطح المختبر والمحاليل وغيرها. ارتدِ القفازات ونظف سطح المنضدة والماصات وغيرها جيداً قبل الاستخدام لتجنب التلوث بإنزيمات RNase. يوصى بشدة باستخدام رؤوس ماصات وأنابيب وأدوات زجاجية وكواشف خالية من النوكلياز.

1. النسخ In vitro باستخدام طقم T7 High-yield RNA Synthesis Kit

قالب DNA لتفاعل النسخ عبارة عن بلازميد خطي يحتوي على جين Gaussia luciferase ومحفز T7 يقع في الجزء العلوي من التسلسل المشفر (الشكل 1B).

  1. قم بإذابة مكونات طقم T7 High Yield RNA Synthesis وحافظ عليها مبردة على الثلج.
  2. بالنسبة لـ RNA غير المغطى (uncapped)، قم بإعداد التفاعل في درجة حرارة الغرفة بالترتيب التالي:
مكوّنالحجم (μl)نهائي
ماء خالٍ من النوكلييز*إكس 
محلول منظم للتفاعل بتركيز 10X21X
أدينوسين ثلاثي الفوسفات (100 مللي مولار)210 مللي مولار
سيتيدين ثنائي الفوسفات (100 ملي مولار)2١٠ مللي مولار
يوريدين ثلاثي الفوسفات (100 ملي مولار)210 مللي مولار
GTP (100 مللي مولار)210 ميلي مولار
الحمض النووي القالب *إكس1 μg
مزيج بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T72 
إجمالي20 

*أضف 1 μg من الـ DNA وأكمل الحجم الكلي للتفاعل إلى 20 μl باستخدام ماء خالٍ من النوكلياز. ستختلف كمية الماء المضافة بناءً على تركيز الـ DNA القالب.

  1. بالنسبة لـ RNA المضاف إليه غطاء (capped RNA): قم بإعداد التفاعل في درجة حرارة الغرفة وفق الترتيب التالي:
مكوّنالحجم (μl)النهائي
ماء خالٍ من النوكلياز*X 
محلول منظم للتفاعل بتركيز 10X21X
ATP (100 ملي مولار)210 ملي مولار
سيتيدين ثلاثي الفوسفات (100 مللي مولار)2١٠ ملي مولار
UTP (100 ملي مولار)210 ملي مولار
جوانوزين ثلاثي الفوسفات (20 مللي مولار)2٢ ملي مولار
3´-0-Me-m7نظير غطاء G(5')ppp(5')G (ARCA) (بتركيز 40 مللي مولار)4٨ ملي مولار
الحمض النووي القالب*X1 μg
مزيج بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T72 
إجمالي20 

*أضف 1 μg من DNA وأكمل الحجم الإجمالي للتفاعل إلى 20 μl باستخدام ماء خالٍ من النوكلياز. ستختلف كمية الماء المضافة بناءً على تركيز DNA القالب.

  1. امزج جيداً باستخدام جهاز دوامة (vortex) واحضن التفاعلات عند 37 °C لمدة ساعتين في حاضنة هواء جاف.
  2. باستخدام الخطوات 1.3-1.4، قم بتصنيع نسخ مضاف إليها غطاء (capped transcripts) من لوسيفيريز Cypridina (CLuc) من بلازميد خطي يحتوي على جين CLuc. سيتم إجراء ترانسفكشن مشترك لهذا الـ mRNA مع الـ GLuc mRNA المضاف إليه غطاء وغير المضاف إليه غطاء لمعايرة تعبير GLuc.

2. إزالة الحمض النووي القالب (Template DNA)

تُعامل تفاعلات النسخ بـ DNase I لإزالة قالب DNA قبل البدء في عملية التنقية.

  1. أضف 70 μl من الماء الخالي من النوكلياز إلى تفاعلات النسخ، يليه 10 μl من منظم تفاعل DNase I.
  2. أضف 2 μl من DNase I إلى التفاعلات.
  3. حضّن الخليط عند 37 °C لمدة 15 دقيقة في حاضنة هواء جاف.

3. تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) المقرون وغير المقرون باستخدام العمود

  1. قم بتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) ذي القبعة (capped) وغير ذي القبعة (uncapped) باستخدام طقم MEGAclearKit وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة (ويمكن استخدام أي طقم تنقية RNA يعتمد على أعمدة الطرد المركزي).
  2. قم بقياس كمية الـ RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop.
  3. وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، قم بتقييم جودة عينة الـ RNA باستخدام طقم Agilent RNA 6000 Nano وجهاز Agilent 2100 Bioanalyzer.

4. إضافة القبعة لـ RNA باستخدام نظام إضافة القبعة من فيروس Vaccinia

  1. خذ 10 μg من mRNA الخاص بـ GLuc المُنقى وغير المُغطى (uncapped).

يمكن لتفاعل إضافة القبعة القياسي أن يضيف القبعة إلى ما يصل إلى 10 μg من الـ RNA (بطول 100nt أو أكثر). وإذا كانت هناك حاجة لإضافة القبعة إلى كمية أكبر من الـ RNA، فيمكن زيادة حجم التفاعل وفقاً لذلك.

  1. زيادة الحجم إلى 15 μl باستخدام ماء خالٍ من النوكلييز.
  2. تسخين RNA عند 65 °C لمدة 10 دقائق لإزالة البنى الثانوية، ثم وضعه على الثلج لمدة 5 دقائق.
  3. لإعداد تفاعل إضافة القبعة (capping reaction)، أضف 2 μl من 10X Capping Buffer، و 1 μl من GTP (10 mM)، و 1 μl من S-adenosyl methionine المخفف حديثاً (2 mM)، و 1 μl (10 units) من Vaccinia capping enzyme إلى 15 μl من RNA المنزوع الطبيعة.
  4. المزج جيداً عن طريق الرج اللطيف بجهاز vortex، ثم تحضين التفاعل عند 37 °C لمدة 30 دقيقة في حضانة هواء جافة.

5. تنقية الـ RNA المـُقـوّس باستخدام العمود

  1. قم بتنقية الـ RNA ذو النهاية المقيدة باستخدام طقم MEGAclear (ويمكن استخدام أي طقم تنقية RNA يعتمد على أعمدة الدوران).
  2. قم بتقييم جودة عينة الـ RNA باستخدام طقم Agilent RNA 6000 Nano وجهاز Agilent 2100 Bioanalyzer، وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

6. ترانزفكشن خلايا HeLa باستخدام مجموعة TransIT mRNA Transfection Kit

  1. يتم توزيع خلايا HeLa في طبق يحتوي على 48 بئراً في 150 μl من وسط Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)، عالي الجلوكوز، والمكمل بنسبة 10% من مصل الجنين البقري (0.7-2.3 × 105 خلية/بئر).
  2. تُحضن الخلايا لمدة تتراوح بين 16-24 ساعة عند 37 °C حتى تصل نسبة التلاقي (confluency) إلى 60-90%.
  3. يتم تخفيف RNA الخاص بـ GLuc (المغطى وغير المغطى) و CLuc إلى تركيز 100 ng/μl.

تُجرى كل عملية عفن (transfection) في 8 مكررات.

  1. قم بتجهيز 8 أنابيب إبندورف (eppendorf) أنابيب. أضف إلى كل أنبوب 1 μl حمض GLuc RNA غير المغلّف، 1 μl حمض رنا CLuc المضاف إليه غطاء (لأغراض التنميط) و 25 μl من وسط DMEM الخالي من المصل. اخلط جيداً.
  2. جهز 8 أنابيب إيبندورف (eppendorf). أضف إلى كل أنبوب 1 μl حمض GLuc النووي الريبي المزود بغطاء (نظير الغطاء)، 1 μl حمض RNA الخاص بـ CLuc المغلَف (لأغراض التسوية) و 25 μl من وسط DMEM الخالي من المصل. اخلط جيداً.
  3. قم بتجهيز 8 أنابيب إبندورف (eppendorf tubes). أضف إلى كل أنبوب 1 μl RNA الخاص بـ GLuc المُزود بقبعة (جدري البقري), 1 μl حمض RNA الخاص بـ CLuc والمغطى (لأغراض التسوية) و 25 μl من وسط DMEM الخالي من المصل. اخلط جيداً.
  4. أضف 0.2 μl إضافة كاشف تعزيز mRNA (mRNA Boost Reagent) إلى المجموعة الأولى المكونة من 8 أنابيب والخلط.
  5. أضف 0.2 μl يرجى تزويدي بالنص المصدر الذي ترغب في ترجمته.أضف كاشف الـ mRNA إلى المجموعة الأولى المكونة من 8 أنابيب ثم امزج.
  6. تُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 2 إلى 5 دقائق. (يجب ألا تتجاوز مدة التحضين 5 دقائق).
  7. أضف خليط عفن الخلايا (transfection mixture) على شكل قطرات إلى الآبار التي تحتوي على مستنبتات خلايا HeLa (راجع الشكل ٣ (لتجهيز الطبق).
  8. كرر الخطوات من 7 إلى 10 مع الـ 2إندُوميتريوم (بطانة الرحم) و ٣البحث والتطوير مجموعات مكونة من 8 أنابيب.
  9. تُحضن طوال الليل (16 ساعة) في درجة حرارة 37 °C في 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2)2.

7. مقايسة لوسيفيريز Gaussia (GLuc)

قم بقياس نشاط GLuc في الطافي من كل بئر باستخدام طقم مقايسة Gaussia Luciferase من BioLux كما يلي:

  1. قم بتحضير محلول المقايسة الطازج عن طريق إضافة 15 μl من BioLux GLuc Substrate إلى 1.5 ml من BioLux GLuc Assay Buffer (يتطلب الأمر 50 μl من محلول المقايسة لكل عينة). قم بتحضير كمية كافية للعينات ولتجهيز حاقن مقياس السطوع (يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة).
  2. امزج المحلول جيداً عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات (تجنب استخدام جهاز الرج vortex).

يتم قياس التألق باستخدام مقياس التألق للأطباق الدقيقة Centro LB 960 من شركة Berthold Technologies.

  1. اضبط مقياس التلألؤ البيولوجي (luminometer) على حجم حقن 50 μl وفترة تكامل تتراوح بين 2-10 ثوانٍ.
  2. أضف 10 μl من السائل الطافي لمزرعة الخلايا من كل بئر إلى طبق أسود ذو 96 بئراً.
  3. قم بتهيئة الحاقن باستخدام محلول المقايسة ثم ابدأ بقياس التلألؤ البيولوجي.
  4. ستُستخدم القيم التي تم الحصول عليها من الآبار غير المنقولة كضوابط سلبية.

8. مقايسة لوسيفيريز Cypridina (CLuc)

قم بقياس نشاط CLuc في السائل الطافي من كل بئر باستخدام طقم مقايسة Cypridina Luciferase من BioLux كما يلي:

  1. قم بتحضير ركيزة مُعاد تكوينها طازجة (100x) وفقاً للتعليمات الواردة في دليل الطقم.
  2. قم بإذابة محلول المنظم الخاص بمقايسة لوسيفيراز Cypridina BioLux واخلطه جيداً (مع الحماية من الضوء).
  3. لتحضير محلول مقايسة CLuc، أضف 15 μl من الركيزة المُعاد تكوينها (100x) إلى 1.5 ml من محلول المنظم الخاص بمقايسة لوسيفيراز Cypridina BioLux (يتطلب كل عينة 50 μl من محلول المقايسة). قم بتحضير كمية كافية للعينات ولتهيئة حاقن مقياس الضيائية (راجع تعليمات الشركة المصنعة).
  4. اخلط جيداً عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات (تجنب استخدام جهاز مزج العينات vortex).
  5. احتفظ بالمحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (مع الحماية من الضوء).

يتم قياس التألق باستخدام مقياس التألق للأطباق الدقيقة Centro LB 960 من شركة Berthold Technologies.

  1. اضبط مقياس التلألؤ على حقن 50 μl، وتأخير لمدة 1-2 ثانية، وتكامل لمدة 2-10 ثوانٍ.
  2. أضف 10 μl من سائل الطفو الخاص بمزرعة الخلايا من كل بئر إلى طبق أسود مكون من 96 بئراً.
  3. قم بتجهيز المحقن بمحلول مقايسة CLuc وقياس التلألؤ.
  4. ستُستخدم القيم التي تم الحصول عليها من الآبار غير المنقولة كضوابط سلبية.

9. النتائج التمثيلية

يمكن لمجموعة أدوات T7 High Yield RNA Synthesis Kit إنتاج ما يصل إلى 180 μg من الـ RNA غير المُغطى (uncapped RNA) و40 إلى 50 μg من الـ RNA المُغطى (capped RNA) لكل تفاعل بحجم 20 μl. عند التحليل باستخدام جهاز Agilent 2100 Bioanalyzer، يجب أن يُظهر الـ RNA السليم وعالي الجودة قمة واحدة حادة تمثل النسخة المنسوخة من الـ RNA. أما القمة العريضة أو القمم المتعددة فتشير إلى تحلل الـ RNA. ومن المهم أيضاً التحقق من حجم الـ RNA؛ حيث قد يكون وجود نسخ RNA أطول من المتوقع ناتجاً عن الهضم غير الكامل للحمض النووي البلازميدي القالب (template plasmid DNA). وعادة ما يكون تحلل الـ RNA وانخفاض الإنتاجية نتيجة للملوثات التي تنتقل إلى التفاعل من الـ DNA القالب. الشكل 2 هو مثال على مخطط الرحلان الكهربائي وصورة الهلام التي تم الحصول عليها بعد تشغيل RNA سليم وعالي الجودة على جهاز Bioanalyzer.

يتبع عملية ترنسفكشن خلايا HeLa بكل من RNA لـ GLuc المغلّف وغير المغلّف فترة حضانة ثم تحليل السوائل الطافية للمزارع الخلوية لقياس نشاط اللوسيفيريز. وتعد بنية الغطاء 5' مهمة لحماية RNA من التحلل بواسطة الإكسونوكلياز8 ولتعزيز بدء عملية الترجمة9 لـ mRNA. لذلك، يعد تغليف RNA خطوة أساسية في تجارب الترنسفكشن. وتنتج طريقة النسخ المتزامن (تناظر الغطاء) ما يقرب من 40 μg من RNA بنسبة تغليف تصل إلى 80%. أما البروتوكول الذي يستخدم إنزيم تغليف Vaccinia فيقوم بتغليف ما يصل إلى 10 μg من RNA (بطول 100 nt أو أكثر) لكل تفاعل بكفاءة تقارب 100%.

يوضح الشكل 4 الفرق في تعبير لوسيفريداز بين المزارع التي تم ترنسفكشنها بعينات RNA ذات نهايات مغطاة (capped) وعينات غير مغطاة (uncapped). ويمكن ملاحظة أن المزارع الخلوية التي تم ترنسفكشنها بـ RNA مغطى تظهر تعبيراً أعلى بكثير للوسيفريداز مقارنة بتلك التي تم ترنسفكشنها بـ RNA غير مغطى (والتي لا تظهر أي نشاط للوسيفريداز). بالإضافة إلى ذلك، يؤكد الشكل 4 أيضاً أن كلتا تقنيتي التغطية، باستخدام نظير القبعة (cap analog) وباستخدام إنزيم التغطية الخاص بفيروس Vaccinia، تنتجان بنجاح نسخ RNA وظيفية ومغطاة يمكن ترجمتها إلى بروتين. وكانت قيمة p-value ذات الذيلين التي تم الحصول عليها من اختبار t هي 0.2583، مما يشير إلى عدم وجود فرق إحصائي معنوي بين بيانات اللمعان الناتجة عن طريقتي التغطية.

مخطط لعملية النسخ T7؛ قالب DNA، نسخة RNA؛ عملية تتابع النيوكليوتيدات.

الشكل 1A. تخليق الـ RNA بواسطة بوليميراز الـ RNA T7

مخطط خريطة البلازميد pCMV-GLuc، بطول 5764 bp؛ التعبير الجيني، ناقلات الاستنساخ، مواقع التقييد.
الشكل 1ب. ناقل pCMV-GLuc الذي يحتوي على جين GLuc ومحفز T7.

نتائج كروماتوغرافيا الـ RNA؛ تحليل الـ RNA غير المغلّف مقابل المغلّف؛ مخطط الرحلان الكهربائي.
الشكل 2. مخططات الرحلان الكهربائي لجهاز Bioanalyzer وصورة الهلام لـ RNA المغلّف وغير المغلّف. يمثل المحور X حجم الـ RNA بالنيوكليوتيدات (nt) ويمثل المحور Y وحدات الفلورة (FU). أ) مخطط الرحلان الكهربائي لـ GLuc mRNA (غير مغلّف) بعد التنقية. ب) مخطط الرحلان الكهربائي لـ GLuc mRNA (مغلّف باستخدام إنزيم تغليف Vaccinia). ج) مخطط الرحلان الكهربائي لـ GLuc mRNA (مغلّف أثناء عملية النسخ باستخدام نظير الغطاء). د) صورة شبيهة بالهلام تم إنشاؤها بواسطة جهاز Bioanalyzer. يمثل المسار 'L' سلم الـ RNA، والمسار 1 هو GLuc mRNA غير مغلّف، والمسار 2 هو GLuc mRNA مغلّف باستخدام نظير الغطاء، والمسار 3 هو GLuc RNA مغلّف باستخدام إنزيم تغليف Vaccinia.

مخطط تخطيط الطبق لتجربة التعبير الجيني؛ أنواع العينات: GLuc غير مغطاة/مغطاة و CLuc.
الشكل 3. مثال على إعداد الطبق لعملية ترنسفكشن خلايا HeLa. تتكون كل بئر من خلايا HeLa مزروعة بنسبة تلاقي تتراوح بين 60-90%. يضاف إلى كل بئر خليط الترنسفكشن المكون من GLuc RNA المناسب (غير مغطاة، أو مغطاة بنظير الغطاء، أو مغطاة بواسطة إنزيم تغطية Vaccinia)، و CLuc RNA مغطاة (لأغراض التسوية)، وكاشف mRNA Boost، وكاشف TransIT mRNA. تُجرى كل عملية ترنسفكشن في 8 مكررات (الآبار ذات اللون نفسه في الشكل).

مخطط أعمدة للوميض الموحد؛ RNA لـ GLuc مقنع وغير مقنع؛ نتائج تحليل RNA.
الشكل 4.تعبير GLuc في خلايا HeLa. تم ترنيق mRNA لـ GLuc منقى، مقنع وغير مقنع، في خلايا HeLa وحضنها طوال الليل (16 hrs) عند 37 °C. تم تحليل السوائل الطافية للمزارع الخلوية من كل بئر لقياس نشاط GLuc و CLuc وتسجيل قيم الوميض. وتم توحيد قيم وميض GLuc بالنسبة لقيم وميض RNA لـ CLuc المقنع.

صيغة نسبة وميض GLuc، قياس الوميض، معادلة القيم المعيرة، RLU.

* تم طرح التألق من الخلايا غير المنقولة من قيم GLuc و CLuc قبل إجراء عملية المعايرة.

العلامات التجارية

BioLux هي علامة تجارية لشركة New England Biolabs, Inc.

TransIT هي علامة تجارية مسجلة لشركة Mirus Bio LLC.

MEGAclear هي علامة تجارية لشركة Ambion.

المناقشة

In vitro النسخ هو طريقة مفيدة للحصول على إنتاجيات عالية من RNA لمجموعة متنوعة من التطبيقات. وتكمن الميزة الرئيسية لاستخدام طقم T7 High Yield RNA Synthesis في أن تركيبته قد تم تحسينها لتحقيق إنتاجيات عالية من RNA. بالإضافة إلى ذلك، فإن الكواشف المتوفرة في الطقم خالية من النيوكليازات الملوثة، مما يؤدي إلى تخليق نسخ RNA سليمة وعالية الجودة. وقد صُمم الطقم لضمان استقرار ومرونة عاليتين بحيث يمكن استخدامه لتخليق mRNA، وRNA المسمى بالصبغات، والمجسات المشعة ذات النشاط النوعي العالي، وRNA المضاف إليه غطاء (capped RNA). يتضمن دليل الطقم قائمة ببروتوكولات محددة ومواد إضافية مطلوبة لكل تطبيق من هذه التطبيقات، كما يتضمن معلومات تقنية حول استخدام نواتج PCR وأوليغونوكليوتيدات DNA الاصطناعية كقوالب للنسخ. ومن المهم ملاحظة أن طقم النسخ لا يمكنه استخدام سوى قوالب DNA التي تحتوي على محفز T7.

توضح الطريقة الموضحة في هذا المقال عملية إضافة القبعة لـ RNA بعد النسخ باستخدام إنزيم إضافة القبعة من فيروس Vaccinia، بالإضافة إلى إضافة القبعة بالتزامن مع النسخ باستخدام نظير بنية قبعة RNA. وقد أظهرنا أن كلتا الطريقتين تؤديان إلى تخليق RNA مُقبع نشط وظيفياً بعد عملية عفن الخلية (transfection). وتعمل بنية القبعة عند الطرف '5 على تحسين استقرار RNA وكفاءة الترجمة، وبالتالي فهي مهمة لتجارب الحقن المجهري11 وعفن الخلية7. وتنتج طريقة إضافة القبعة بالتزامن مع النسخ ما بين 40-50 μg من RNA مُقبع بنسبة ~80%. ومن المهم ملاحظة أن استخدام نظير قبعة RNA من نوع 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA)، والمغلق عند مجموعة 3'-hydroxyl لـ m7G، يضمن دمج القبعة في الاتجاه الصحيح17. ولإضافة القبعة لكميات أكبر من RNA، يمكن توسيع نطاق التفاعلات القياسية لكلتا طريقتي إضافة القبعة. ومع ذلك، فإن استخدام نظام إضافة القبعة من Vaccinia سيكون خياراً أكثر جدوى من حيث التكلفة لأن إضافة القبعة بالتزامن مع النسخ تتطلب استخدام نظير القبعة، وهو مكون باهظ الثمن نسبياً. كما يعد نظام إضافة القبعة من Vaccinia طريقة أفضل نظراً لأن كفاءة إضافة القبعة فيه تصل إلى 100% تقريباً.

تؤدي طرق وضع القبعة (capping) لـ RNA الموصوفة أعلاه إلى تخليق RNA ببنية cap 0 عند الطرف '5. وتتضمن بنية cap 1 عملية ميثيلة إضافية عند الموضع '2-O لسكر الريبوز في النوكليوتيد الأول عند الطرف '5 لـ RNA. وقد أفادت التقارير أن بنية cap 1 تعزز كفاءة ترجمة RNA18 ويمكن دمجها باستخدام إنزيم 2'-O- Methyltransferase20, 21.

يمكن استخدام الطريقة الموضحة في هذه الورقة لنسخ وتغطية ونقل أي mRNA مطلوب. وقد تم استخدام لوسيفيراز GLuc وCLuc تحديداً في هذا البروتوكول نظراً لمزاياهما العديدة؛ حيث يتم إفرازهما مباشرة في وسط الخلايا، مما يغني عن الحاجة إلى تحلل الخلايا. كما أنهما يولدان كثافة إشارة بيولومينية عالية، وتتميز مقايسات النشاط بأنها عالية الحساسية وسهلة التنفيذ. ومن المهم ملاحظة أن تعبير GLuc في الخلايا يمكن أن يتأثر بعوامل متنوعة بخلاف وظيفية الـ RNA نفسه، ومن الأمثلة على ذلك أخطاء الماصة، وتفاوت أعداد الخلايا في كل بئر، وكفاءة عملية النقل، وغيرها. ويُستخدم تطبيع البيانات (Data normalization) لمراعاة هذه العوامل. وفي البروتوكول الخاص بنا، نقوم بنقل RNA الخاص بـ CLuc بالتزامن مع RNA الخاص بـ GLuc ليكون بمثابة ضابط داخلي. وعند قسمة لومينيسنس GLuc على قيم الضابط CLuc، يتم تطبيع النتائج لتعويض الأخطاء والتباين في عملية النقل19.

الإفصاحات

جميع المؤلفين هم موظفون في شركة New England Biolabs, Inc.

شكر وتقدير

دونغشيان يوي، بريت روب، جورج تيرتزينيس، تانيا بهاتيا، بريتون هورنبلور.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم تخليق الـ RNA عالي الإنتاجية T7New England BiolabsE2040S
نظير بنية غطاء الـ RNA 3’-0-Me-m7G(5’)ppp(5’)GNew England BiolabsS1411S
DNase I (خالٍ من الـ RNase)New England BiolabsM0303S
نظام إضافة الغطاء VacciniaNew England BiolabsM2080S
طقم MEGAclearAmbionAM1908
مقياس الطيف الضوئي NanoDropThermo Fisher Scientific, Inc.
طقم Agilent RNA 6000 NanoAgilent Technologies5067-1511
محلل Bioanalyzer 2100 من AgilentAgilent TechnologiesG2939AA
طقم ترنسفكشن الـ mRNA TransITMirus Bio LLCMIR2250
أوساط سائلة كلاسيكية HyClone*: وسط Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium، جلوكوز مرتفعThermo Fisher Scientific, Inc.SH30285.01
أحماض أمينية غير أساسية HyCloneThermo Fisher Scientific, Inc.SH30238.01
جهاز Centro LB 960Berthold Technologies
طقم مقايسة لوسيفيراز Gaussia BioLuxNew England BiolabsE3300S
طقم مقايسة لوسيفيراز Cypridina BioLuxNew England BiolabsE3309S
مثبط RNase، فاريNew England BiolabsM0314
مثبط RNase، مشيمة بشريةNew England BiolabsM0307
بلازميد التحكم pCMV-GLucNew England BiolabsN8081

المراجع

  1. Lazarev, D., Manley, J. L. Concurrent splicing and transcription are not sufficient to enhance splicing efficiency. RNA. 13, 1546-1557 (2007).
  2. Donze, O., Picard, D. RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7. RNA Polymerase. Nucl. Acids Res. 30, 10-46 (2002).
  3. Van Gelder, R. N. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
  4. Schneider, J. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5, 29-29 (2004).
  5. Conry, R. M. Characterization of a messenger RNA polynucleotide vaccine vector. Cancer Research. 55, 1397-1400 (1995).
  6. Huang, F., Wang, G., Coleman, T., Li, N. Synthesis of adenosine derivatives as transcription initiators and preparation of 5′ fluorescein- and biotin-labeled RNA through one-step transcription. RNA. 9, 1562-1570 (2003).
  7. Warren, L. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  8. Furuichi, Y., LaFiandra, A., Shatkin, A. J. 5'-Terminal structure and mRNA stability. Nature. 266, 235-239 (1977).
  9. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. 2, 277-298 (2011).
  10. Lewis, J. D., Izaurflde, E. The Role of the Cap Structure in RNA Processing and Nuclear Export. Eur. J. Biochem. 247, 461-469 (1997).
  11. Inoue, K., Ohno, M., Sakamoto, H., Shimura, Y. Effect of the cap structure on pre-mRNA splicing in Xenopus oocyte nuclei. Genes Dev. 3, 1472-1479 (1989).
  12. Martin, S. A., Paoletti, E., Moss, B. Purification of mRNA guanylyltransferase and mRNA (guanine 7-)methyltransferase from vaccinia virus. J. Biol. Chem. 250, 9322-9329 (1975).
  13. Martin, S. A., Moss, B. Modification of RNA by mRNA guanylytransferase and mRNA (guanine-7-)methyl-transferase from vaccinia virions. J. Biol. Chem. 250, 9330-9335 (1975).
  14. Shuman, S., Moss, B. Purification and use of vaccinia virus mRNA capping enzyme. Meth. Enzymol. 181, 170-180 (1990).
  15. Thiel, V., Herold, J., Scelle, B., Siddell, S. G. Infectious RNA transcribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus. J. Gen. Virol. 82, 1273-1281 (2001).
  16. Marcotrigiano, J., Gingras, A. -C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cocrystal Structure of the Messenger RNA 5′ Cap-Binding Protein (eIF4E) Bound to 7-methyl-GDP. Cell. 89, 951-961 (1997).
  17. Stepinski, J. Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl (3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl (3'-deoxy) GpppG. RNA. 7, 1486-1495 (2001).
  18. Kuge, H., Brownlee, G. G., Gershon, P. D., Richter, J. D. Cap ribose methylation of c-mos mRNA stimulates translation and oocyte maturation in Xenopus laevis. Nucl. Acids Res. 26, 3208-3214 (1998).
  19. Schagat, T., Paguio, A., Kopish, K. Normalizing Genetic Reporter Assays: Approaches and Considerations for Increasing Consistency and Statistical Significance. Cell Notes. 17, 9-12 (2007).
  20. Barbosa, E., Moss, B. mRNA (nucleoside-2'-) - methyltransferase from Vaccinia Virus. J. Biol. Chem. 253, 7698-7702 (1978).
  21. Lockless, S. W. Recognition of capped RNA substrates by VP39, the vaccinia virus-encoded mRNA cap-specific 2'-O-methyltransferase. Biochemistry. 37, 8564-8574 (1998).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تغطية الحمض النووي الريبوزي (RNA Capping)طقم T7 لتخليق الحمض النووي الريبوزي عالي المردودإنزيم تغطية فيروس الجدري (Vaccinia Capping Enzyme)طريقة نظير الغطاء (Cap Analog Method)مقايسة نشاط اللوسيفيريزتنقية الحمض النووي الريبوزيالتكميم بجهاز NanoDrop
في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.