هنا علينا أن نبرهن بروتوكول لدينا لعزل الخلايا القاعدية وتحت المخاطية قناة الغدة من القصبات الماوس. علينا أن نبرهن أيضا طريقة حقن الخلايا الجذعية في لوحة الماوس الدهون الظهرية لإنشاء في الجسم الحي نموذج للتجديد الغدة تحت المخاطية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الخلايا القاعدية والخلايا تحت المخاطية قناة الغدة من القصبة الهوائية ماوس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الشعب الهوائية الكبيرة على اتصال مباشر مع البيئة وبالتالي عرضة للإصابة من السموم والعوامل المعدية أننا في التنفس 1. الشعب الهوائية الكبيرة تتطلب بالتالي إصلاح آلية فعالة لحماية أجسامنا. هذه العملية يحدث إصلاح من الخلايا الجذعية في الشعب الهوائية وعزل هذه الخلايا الجذعية من الشعب الهوائية من المهم لفهم آليات الإصلاح والتجديد. من المهم أيضا لفهم إصلاح الشاذة التي يمكن أن تؤدي إلى أمراض الشعب الهوائية 2. والهدف من هذا الأسلوب هو لعزل الخلايا الجذعية من رواية سكان القصبة الهوائية الماوس القنوات الغدة تحت المخاطية ووضع هذه الخلايا في المختبر في وأنظمة نموذج الجسم الحي للتعرف على آليات إصلاح وتجديد الغدد تحت المخاطية 3. يظهر هذا الإنتاج الأساليب التي يمكن استخدامها لعزل وفحص الخلايا الجذعية لاصق والقاعدية من الشعب الهوائية كبيرة 3، مما سيسمح لنالدراسة أمراض الشعب الهوائية، مثل التليف الكيسي، الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن. حاليا، لا توجد طرق لعزل خلايا الغدة تحت المخاطية القناة وليس هناك أي نماذج في الجسم الحي لدراسة تجديد الغدد تحت المخاطية.
البروتوكول
الخطوط العريضة للخطوات
1. تشريح القصبة الهوائية
2. تنظيف القصبة الهوائية وقطع عليه
3. انزيم الهضم ومعالجة في التعليق خلية واحدة
4. لتلطيخ FACS والفرز
5. معالجة الخلايا في الجسم الحي لفرز ونماذج في المختبر
1. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذه التقنية لعزل الخلايا القاعدية والقناة من الشعب الهوائية من المهم لتحسين فهمنا للإصلاح والتجديد الهوائية وأمراض الشعب الهوائية. التقنيات الموضحة هنا تشمل على بعد خطوات قليلة حرجة. الأول هو الأمثل فترة الهضم الأنزيمي. والثاني هو إنشاء خلية واحدة من خلال التعليق المسلسل الركض مع الإبر سبر أعلى تدريجيا لمنع قص الخلية ولكن لتفريق كتل الخلايا. والثالث هو تحليل FACS، والنابضة من خلايا الأجسام المضادة مع المناسبة.
وب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نود أن نعترف الخلايا الجذعية واسع FACS مركز البحوث وأشكر خصوصا جيسيكا سكولز وكودريا فيليسيا لمساعدتهم مع الفرز الخلية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل CIRM RN2-00904-1، K08 HL074229، وجمعية أمراض الصدر الأميركية / COPD مؤسسة ATS-06-065، المؤسسة المعنية وUCLA جونسون المركز الشامل للسرطان الصدر SPORE الأورام السرطانية برنامج / الرئة، سرطان في جامعة كاليفورنيا البحث جنة التنسيق وهازن غوين الكرز التذكارية المختبرات (BG).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | كتالوج رقم | |
| استكمال المتوسطة 10: DMEM-F-12، 50/50، 1X) | Mediatech | 15-090-CV | |
| HEPES (15 ملم) | إينفيتروجن | 15630 | |
| بيكربونات الصوديوم (3.6mM أو 0.03٪) | إينفيتروجن | 25080 | |
| الجلوتامين L-(4 ملم) | Mediatech | 25-005-الكلورين | |
| البنسلين (100 U / مل) | Mediatech | 30-001-CI | |
| الستربتوميسين (100 ميكروغرام / م) | Mediatech | 30-001-CI | |
| الأمفوتريسين B (0.25 ميكروغرام / مل) | Lonza | 17-836R | |
| فيsulin (10 ميكروغرام / مل) | سيجما | I6634 | |
| ترانسفيرين (5 ميكروغرام / مل) | سيجما | T1147 | |
| بكتيريا الكوليرا (0.1 ميكروغرام / مل) | سيجما | C8052 | |
| عامل نمو البشرة (25 نانوغرام / مل) | BD | 354001 | |
| النخامية البقري استخراج (30 ميكروغرام / مل) | إينفيتروجن | 13028-014 | |
| المصل البقري الجنين (5٪) | الصياد | SH3008803HI | |
| حمض الريتينويك (0.05 ميكرومتر) | سيجما | R2625 | |
| انخفاض عامل النمو Matrigel | BD | 354230 |
الجدول 1. أكمل وسائل الإعلام المكونات.
| اسم كاشف | شركة | كتالوج رقم | تعليقات |
|---|---|---|---|
| Pronase | روش | 10165921001 | تستخدم في 0.15٪: -O / N عند 4 ° C الهضم لعزل خلايا القصبة الهوائية الإجمالي (ALI للثقافة) -4 ساعة الهضم 4 ° C لعزل SMG |
| Dispase | BD العلوم البيولوجية | 354235 | استخدام وحدات في 16: 30 دقيقة في RT |
| الدناز I | سيجما | DN25 | تستخدم عند 0.5 ملغ / مل: 20-30 دقيقة في RT |
الجدول 2. إنزيمات الهضم الأنزيمية المستخدمة لمن القصبة الهوائية.
المراجع
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
