مقالة منهجية

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

48.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/3781

⸱

مارس 15, 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

في هذه المقالة

ملخص

وقد ثبت أن الأجنة الزرد شفاف المضيفين نموذجا مفيدا لتصور ودراسة التفاعلات وظيفيا بين الخلايا المناعية الفطرية ومسببات الأمراض البكتيرية داخل الخلايا، مثل السالمونيلا التيفية الفأرية و المتفطرة البحرية. الدقيقة حقن البكتيريا ومتعددة الألوان التصوير مضان من التقنيات الأساسية التي ينطوي عليها تطبيق نماذج من الزرد عدوى الجنين.

الملخص

ويتزايد استخدام الزرد (دانيو rerio) الأجنة كنموذج لدراسة وظيفة نظام المناعة الفطرية في الفقاريات المضيف الممرض التفاعلات 1. من أنواع الخلايا الرئيسية للنظام المناعة الفطرية، الضامة والعدلات، ووضع خلال الأيام الأولى من التطور الجنيني قبل نضوج الخلايا اللمفية التي مطلوبة من أجل الاستجابات التكيفية المناعي. سهولة الحصول على أعداد كبيرة من الأجنة، وسهولة الحصول عليها بسبب التنمية الخارجية، والشفافية البصرية من المراحل الجنينية واليرقات، مجموعة واسعة من الأدوات الجينية، والموارد متحولة واسعة ومجموعة من خطوط مراسل المعدلة وراثيا، إضافة إلى براعة كل من الزرد نموذج. يمكن السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية (س. التيفية الفأرية) وmarinum المتفطرة intracellularly يقيمون في الضامة وكثيرا ما تستخدم لدراسة المضيف الممرض التفاعلات في الأجنة الزرد. عمليات العدوى من هذينمسببات الأمراض البكتيرية مقارنة مثيرة للاهتمام لأنه س. عدوى التيفية الفأرية حادة وقاتلة في غضون يوم واحد، في حين م. marinum عدوى مزمنة، ويمكن تصوير ما يصل الى مرحلة اليرقات 2، 3. موقع الدقيقة حقن البكتيريا في جنين (الشكل 1) يحدد ما إذا كانت العدوى سوف تصبح بسرعة النظامية أو سيبقى في البداية مترجمة. يمكن تأسيس عدوى السريع الأجهزة عن طريق حقن البكتيريا الدقيقة مباشرة في الدورة الدموية عن طريق الوريد الذيلية في جزيرة دم الخلفي أو عن طريق القناة كوفييه، قناة تداول واسع على الكيس المحي الذي يربط بين القلب إلى الأوعية الدموية في الجذع. في 1 DPF، عندما الأجنة في هذه المرحلة لديها الضامة نشط phagocytically لكن العدلات لم تنضج بعد، عن طريق الحقن في الدم ويفضل جزيرة. لحقن في DPF 2-3، عندما الأجنة أيضا قد وضعت وظيفية (الميلوبيروكسيديز المنتجة) العدلات، ويفضل القناة كوفييه كما تيانه موقع الحقن. لدراسة الهجرة الموجهة للخلايا الدم النخاعي نحو العدوى المحلية، ويمكن حقن البكتيريا في عضلة الذيل، وحويصلة أذني، أو الدماغ المؤخر البطين 4-6. وبالإضافة إلى ذلك، والحبل الظهري، وهو الهيكل الذي يبدو أنه لا يمكن الوصول إليها عادة لخلايا الدم النخاعي، هي عرضة للعدوى المحلية 7. وثمة بديل مفيد للالإنتاجية العالية لتقديم الطلبات هو حقن البكتيريا في صفار البيض من الأجنة في غضون الساعات الأولى بعد الإخصاب 8. الجمع بين البكتيريا الفلورسنت وخطوط الزرد المعدلة وراثيا مع الضامة فلوري أو العدلات يخلق الظروف المثالية لمتعددة الألوان التصوير من المضيف الممرض التفاعلات. هذه المادة سوف فيديو وصف بروتوكولات تفصيلية للعدوى عن طريق الوريد والمحلية من الأجنة الزرد مع س. التيفية الفأرية أو م. بكتيريا marinum و. التصوير مضان اللاحقة للتفاعل مع خلايا الجهاز المناعي الفطرية

البروتوكول

1. إعداد إبر حقن

  1. إعداد البورسليكات الزجاج حقن الإبر microcapillary (هارفارد جهاز، 300038، 1 مم OD × 0،78 ملم معرف) باستخدام جهاز مجتذب micropipette (سوتر الآلات شركة، ويلهب / P-97 براون مع الإعدادات التالية لفترة أطول تلميح: الضغط الجوي 400؛ حرارة 610؛ سحب 40؛ سرعة 50؛ الساعة 30 و بالإعدادات التالية لأقصر تلميح: الضغط الجوي 500؛ حرارة 510؛ سحب 100؛ سرعة 200؛ الساعة 60).
  2. قطع رأس إبرة مع ملاقط غرامة للحصول على قطر افتتاح قمة ميكرومتر 5-10. فإنه من المستحسن أن شطبة افتتاح قمة إبرة في زاوية 45 درجة مع microgrinder (Narishige شركة، EG-400) لانتاج أكثر وضوحا طرف. وسوف يسهل هذا ثقب طبقة البشرة ويؤدي بالتالي في حقن أكثر استنساخه مع ضرر أقل من الأنسجة مع الإبر غير حادة. ويفضل الإبر يعد يميل لالوريد الذيلية (الخطوة 5) والقناة كوفييه (الخطوة 6.1) الحقن والإبر أقصر الرؤوسويفضل لحقن بروتوكولات أخرى (خطوات 6،2-6،6).

2. إعداد S. التيفية الفأرية اللقاح

  1. لوحة من أصل س. التيفية الفأرية من مخزون -80 ° C الجلسرين على لوحات أجار رطل (مع المضادات الحيوية المناسبة لاختيار لناقلات التعبير مضان)، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. اختيار الفرد المستعمرات إيجابي fluorescently وresuspend لهم تركيز المطلوب (انظر بروتوكولات 5 و 6) في المياه المالحة الفوسفات مخزنة معقم (PBS)، التي تحتوي على اختياريا 0.085٪ (V / V) الفينول الحمراء (سيغما الدريخ) للمساعدة على تصور لل حقن عملية. استخدام مباشرة تعليق جديد لحقن أو إعداد مخزونات الجلسرين. لإعداد مخزون الجلسرين، وتدور باستمرار على الأوراق المالية حقن الطازجة مع التركيز المطلوب من البكتيريا والتركيز على الأسهم من قبل resuspending لبيليه في حجم النصف ابتداء من عام عقيمة الجلسرين (V / V) 20٪ (سيغما الدريخ) في برنامج تلفزيوني. تخزين الأوراق المالية الجلسرين في -80 درجة مئوية. يخفف من الجلسرين 1:01 الأوراق المالية (V / V) قبل الحقن في برنامج تلفزيوني العقيمة، التي تحتوي على اختياريا أحمر الفينول 0.17٪.
  3. دوامة تعليق الجرثومي بشكل جيد لتجنب تراكمها.
  4. تحميل اللقاح في إبرة microcapillary باستخدام طرف microloader (إيبندورف، 5242956.003).
  5. بسبب الحجم الكبير نسبيا من س. بكتيريا التيفية الفأرية وعلى مشرق مضان DS-RED عند استخدام ناقلات التعبير pGMDs3 3 (السلالة متوفرة عند الطلب)، ويمكن بسهولة الخلايا البكتيرية الفردية تحسب مع stereomicroscope مضان من أجل ضبط جرعة حقن. تحقيقا لهذه الغاية، حقن 1 NL إلى قطرة من برنامج تلفزيوني على صفيحة أجار، عد البكتيريا فلوري، وحساب حجم الحقن ما هو مطلوب للحصول على جرعة المرجوة البكتيرية (ويفضل ابقاء حجم الحقن بين NL 1-2). حقن الأجنة مع س. التيفية الفأرية عبر الطريق المحدد (انظر بروتوكولات 5 و 6).

3. إعداد م. marinum اللقاح

  1. الحفاظ على م. marinum الضغط المتزايد على أجار Difco 7H10 Middlebrook دينار بحريني (وشركة) تستكمل مع الأوليك 10٪ حمض الألبومين سكر العنب، الكاتلاز (OADC، وشركة دينار بحريني)، الجلسرين بنسبة 0.5٪، ومع المضادات الحيوية المناسبة لاختيار لناقلات التعبير مضان (سلالات متاح بناء على طلب 9)، وهناك لذلك هو دائما مخزون جديد.
  2. اختيار مستعمرة م. marinum وresuspend في 7H9 Difco مرق Middlebrook دينار بحريني (وشركة) تستكمل مع 10٪ الألبومين سكر العنب، الكاتلاز (ADC، وشركة دينار بحريني) و 0.05٪ توين 80 (سيغما الدريخ) والمضادات الحيوية المناسبة. تأكد من أن الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر هو 0،2-0،3 وتركها تنمو بشكل ثابت بين عشية وضحاها في 28.5 درجة مئوية. الوقت من جيل م. marinum حوالي 4-6 ساعات، تتفاوت وفقا للسلالة.
  3. قياس عملية التطوير التنظيمي في 600 نانومتر مرة أخرى في اليوم من الحقن. وOD600 من 1 يتوافق مع ما يقرب من 10 8 م. marinum / مل(وهذا قد تختلف وفقا لسلالة بكتيريا المستخدمة، وبالتالي ينبغي أن تقوم على منحنى النمو للسلالة معينة).
  4. حصاد البكتيريا عندما تكون في مرحلة لوغاريتمي (لا تدع OD600 تتجاوز 1.00) بواسطة الطرد المركزي، وغسلها ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني العقيمة.
  5. قياس OD600 مرة أخرى للتعليق البكتيرية في برنامج تلفزيوني، وتدور إلى أسفل، وresuspend البكتيريا للتركيز المطلوب (انظر بروتوكولات 5 و 6) في برنامج تلفزيوني أو في بوفيدون 2٪ (PVP40) في برنامج تلفزيوني (ث / ت)، مما يحسن من تجانس للتعليق البكتيرية. ويمكن إضافة أحمر الفينول (سيغما الدريخ) إلى تركيز 0.085٪ للمساعدة على تصور لعملية الحقن. استخدام مباشرة تعليق جديد لحقن أو إعداد مخزونات الجلسرين. لإعداد مخزون الجلسرين تدور باستمرار على الأوراق المالية حقن الطازجة مع التركيز المطلوب من البكتيريا والتركيز على الأسهم من قبل resuspending لبيليه في حجم النصف ابتداء من عام عقيمة الجلسرين بنسبة 20٪ في برنامج تلفزيوني. تخزين glycإيرول السهم عند -80 درجة مئوية. يخفف من الجلسرين 1:01 الأوراق المالية (V / V) في برنامج تلفزيوني العقيمة، التي تحتوي على 4٪ اختياريا PVP40 و / أو بنسبة 0.17٪ الفينول الحمراء.

4. إعداد الأجنة الزرد لحقن

  1. إعداد أزواج تربية اسماك الزرد وجمع الأجنة كما هو موضح في مقال آخر فيديو 10. الحفاظ على الأجنة في طبق بيتري مملوءة بالماء البيض (60 أملاح البحر ميكروغرام / مل؛. CA 60 الأجنة / طبق)، واحتضان في 28.5 درجة مئوية.
  2. إذا كان ذلك مطلوبا، إضافة 0.003٪ N-الفنيل (PTU، سيغما الدريخ) إلى الماء البيض عندما الأجنة هي ما يقرب من 12 HPF لمنع التصبغ.
  3. حوالي 24 إخصاب آخر ساعة (HPF)، dechorionate الأجنة مع ملاقط غرامة (الجميلة العلوم أدوات المحدودة، دومون # 5 الملقط - INOX علم الأحياء.
  4. الحفاظ على الأجنة في طبق بيتري مملوءة بالماء بيضة مع وجود طبقة من الاغاروز 1٪ على الجزء السفلي لمنع الأجنة من الالتصاق إلى السطح البلاستيك.
  5. مخزنة تخدير الأجنة مع 200 ميكروغرام / مل 3أمينوبنزوي حامض (Tricaine، سيغما الدريخ) ما يقرب من 10 دقيقة قبل الحقن.

5. حقن في الوريد من البكتيريا في يوم واحد الأجنة القديمة

  1. استضافة أجنة في 28 HPF 11 عن طريق التحقق من دوران الدم ثابتة، ابتداء من تصبغ في العين، وذيل مستقيم، ويتم وضعه في قلب البطني فقط للعين.
  2. تخدير الأجنة، راجع الخطوة 4.5.
  3. تحميل إبرة مع اللقاح البكتيري باستخدام طرف microloader.
  4. تركيب إبرة تحميلها على micromanipulator (سوتر الصك، MM-33) متصلا موقف (أدوات دقيقة العالم، والوقوف المغناطيسي M10L) ووضعه تحت المجهر ستيريو (لايكا M50، أعمى الألوان 1X هدف 0،15 NA، قاعدة الضوء المرسل TL ST). ضبط الوقت حقن إلى 0.2 ثانية وضغط التعويض إلى 15 هكتو باسكال (إيبندورف، Femtojet). ضبط ضغط حقن ما بين 700 و 900 هكتو باسكال للحصول على حجم الصحيح للحقن إبرةالمستخدمة. ضبط حجم الانخفاض لتتناسب مع القطر المطلوب مع مساعدة من شريط النطاق على شريحة المجهر أو في العين. ويمكن لتحديد حجم يتم حقن انخفاض في الزيوت المعدنية على شريحة المجهر، أو يمكن تقدير حجم عن طريق حقن في الهواء، الأمر الذي يترك قطرة معلقة على رأس إبرة. في دائرة نصف قطرها بنسبة انخفاض قدرها 1 NL هو 0،062 ملم (V = 4/3 π ص 3).
  5. تعيين micromanipulator مع إبرة تحميلها في الموضع الصحيح قبل الحقن (ما يقرب من أي بزاوية 45 درجة بالنسبة للحقن سطح اللوحة)، والتحرك فقط ذهابا وإيابا لحقن.
  6. وpipetted الأجنة تخدير على طبق مسطح الاغاروز 1٪ عن طريق الحقن وفائض المياه بيضة يتم إزالة، مما يسمح التوتر السطحي لعقد الأجنة في مكان أثناء الحقن. استخدام أداة حلقة الشعر (الشكل 2) للاصطفاف الأجنة. توجيه لوحة حقن باليد أثناء الحقن لوضع الأجنة في موقف المفضل لinsertiنانوغرام الإبرة، أي مع ذيولها مشيرا نحو طرف الإبرة.
  7. وضع طرف الإبرة مباشرة فوق إغلاق الوريد الذيلية لافتتاح البولي التناسلي (الشكل 1A)، تخترق محيط بالأدمة مع طرف إبر وحقن الجرعة المطلوبة من البكتيريا، ونحن نستخدم كاليفورنيا. 250 وت س. التيفية الفأرية البرية نوع (وزن) سلالة SL1027، الذي يحتوي على التعبير DS-RED ناقلات pGMDs3، وكاليفورنيا. 120 وت م. marinum سلالة Mma20. وسوف توقف حقن البكتيريا تتبع تدفق الدم عن طريق الوريد الذيلية في اتجاه القلب. مراقبة إذا تم إجراء الحقن بشكل صحيح عن طريق التحقق من وحدة تخزين توسيع الأوعية الدموية مباشرة بعد نبضة 2. الجرعة والاستجابة للتجارب، ويمكن أن يؤديها 2-3 حقن متتالية دون استخراج إبرة.
  8. تحقق في كثير من الأحيان أن حجم الحقن لا يزال هو نفسه أثناء التجربة. لتوفير الرقابة على اتساق الحقن في كافة مراحل التجربة، حقن DROف من البكتيريا مباشرة إلى انخفاض في برنامج تلفزيوني العقيمة في المتوسط ​​نمو البكتيريا بعد ما يقرب من كل حقن الجنين الموافق 30. لوحة من هذا التراجع والاعتماد على المستعمرات البكتيرية بعد حضانة لتحديد وحدات تشكيل مستعمرة (وت م) في حجم الحقن.
  9. استخدام stereomicroscope مضان (بروتوكول 7) لمراقبة فردية فلوري س. التيفية الفأرية الخلايا التي تدور في مجرى الدم مباشرة بعد الحقن، والتخلص من الاجنة التي لم يتم حقنها بشكل صحيح. فرد فلوري م. لا يمكن أن البكتيريا marinum يجب مراعاتها من مضان المجهر ستيريو مباشرة بعد الحقن، ولكن الركام فلوري من الخلايا المصابة يجب أن يكون مرئيا من قبل 2 إصابة آخر أيام (نقطة في البوصة)، وتكبر مع مرور الوقت.

6. طرق بديلة من العدوى

  1. قناة من حقن كوفييه: يصطف الأجنة تخدير (2-3 DPF) على لوحة مسطحة الاغاروز 1٪ عن طريق الحقن كما لحقن الوريد الذيلية (انظر 5.6). توجيه حقنلوحة ايون باليد أثناء الحقن لوضع الأجنة في موقف المفضل لإدخال الإبرة، قطريا أي تحت 45 درجة زاوية بحيث يمكن الاقتراب من مجاري الهواء كوفييه بواسطة إبرة غيض من الجانب الظهري للجنين (الشكل 1B) . أدخل الإبرة في نقطة البداية من القناة كوفييه ظهري فقط إلى الموقع حيث يبدأ توسيع القناة على الكيس المحي وحقن 100-200 بكتيريا (NL 1-3). الحقن هو الصحيح وإذا كان حجم داخل قناة يوسع مباشرة بعد نبض وليس تمزق الكيس المحي. أما بالنسبة للحقن وريد عجزي (انظر 5.7)، يمكن تنفيذ عمليات الحقن عدة متتالية دون استخراج الإبرة.
  2. الدماغ المؤخر حقن البطين: يصطف الأجنة تخدير (32 HPF) على طبق مسطح الاغاروز 1٪ عن طريق الحقن مثل أن يتم وضع الأجنة مع جانبهم ظهري باتجاه رأس إبرة. أدخل الإبرة في البطين من الدماغ المؤخر موقف الأمامي دون لمس neuroepithelium (الشكل 1C) وحقن البكتيريا 20-100 (0.5-1 NL). لممارسة هذا الإجراء، واستخدام صبغة الفلورسنت (مثل تكساس الأحمر ديكستران) كما هو موضح في مقال آخر فيديو 13.
  3. ذيل حقن العضلات: الأجنة موقف تخدير (1-2 DPF) أما بالنسبة للحقن وريد عجزي (انظر 5.6). ضبط micromanipulator مع الإبرة المحملة على زاوية 65 درجة تقريبا فيما يتعلق حقن سطح اللوحة. حقن تعليق البكتيرية (0.5-1 NL) التي تحتوي على 20 حتي 50 وت في عضلة أعلى افتتاح البولي التناسلي (1D الشكل) دون التسبب في الأضرار التي لحقت الحبل الظهري أو الأوعية الدموية.
  4. أذني حقن حويصلة: الأجنة موقف تخدير (2-3 DPF) أما بالنسبة للحقن وريد عجزي (انظر 5.6). ضبط micromanipulator مع الإبرة المحملة على زاوية 65 درجة تقريبا فيما يتعلق حقن سطح اللوحة. ضخ ما يقرب من 20 البكتيريا (0.5 NL) في الحويصلة الأذنية (الشكل 1E) مع الصحافة منخفضلدى عودتهم إلى تجنب تمزق النسيج المحلية.
  5. الحبل الظهري حقن: يصطف الأجنة تخدير (1-2 DPF) على طبق مسطح الاغاروز 1٪ عن طريق الحقن مثل أن يتم وضع الأجنة مع ذيلها مشيرا بعيدا عن طرف الإبرة. أدخل الإبرة من خلال الذيل الأنسجة العضلية في الحبل الظهري (الشكل 1F) وحقن ما يقرب من 20-50 البكتيريا (القصوى 0.5 NL). والحرص على عدم ضخ حجم أكثر من اللازم لتجنب تمزق الحبل الظهري.
  6. صفار حقن: تحتوي على بيض موقف الأجنة في مرحلة الخلية 16-1000 على طبق من ذهب الاغاروز 1٪ عن طريق الحقن مع قنوات مستطيلة أو على شكل V مع صنع قالب قناة 12 أو على الانترنت في http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . تخترق إبرة من خلال المشيماء في وسط صفار البيض (الشكل 1G) وحقن البكتيريا 20-40 (1-2 NL). استخدام محلول 2٪ الناقل PVP40 لتعليق البكتيرية (انظر الخطوة 3.5)المهم لمنع انتشار المرض الجرثومي في وقت مبكر في جنين.

7. ستيريو التصوير من العدوى

  1. تخدير الأجنة المصابة في صحن الاغاروز 1٪ بيتري الطبقات مغطى بالمياه التي تحتوي على البيض Tricaine (انظر 4.5).
  2. محاذاة الأجنة في الموضع الصحيح للتصوير تحت المجهر مضان ستيريو مع الشعر أداة حلقة (الشكل 2). قبل المثانة السباحة قد تضخمت (1-5 DPF)، فإن الأجنة شقة تقع على جنوبهم تمكين الأطراف التصوير الشخصي.
  3. إذا كنت بحاجة لموقف مختلف من وجهة النظر الجانبي، وتركيب والأجنة في السليلوز الميثيل بنسبة 1.5٪. التلاعب في الجنين في موقف المطلوبة مع الشعر أداة حلقة (الشكل 2).
  4. إرجاع الأجنة إلى المياه البيض بعد التصوير.

8. مبائر التصوير من العدوى

  1. ضع قطرة من منخفض الانصهار الاغاروز نقطة (Lonza شركة، 1.5٪ (W / V) في الماء البيض) على الجزء السفلي من الزجاجWillCo، طبق (WillCo ويلز، GWSt-5040) إذا تم استخدام مجهر مقلوب مبائر، أو على شريحة تجويف الاكتئاب واحد (العلمي آجار، L4090) إذا تم استخدام مجهر تستقيم مبائر.
  2. وضع الجنين في تخدير قطرة الاغاروز مع كمية محدودة من المياه البيض والتلاعب في الجنين في الموقف مع الشعر أداة حلقة (الشكل 2). عند استخدام المجهر المقلوب من المهم أن منطقة جنين لمصلحة مسطح ضد أسفل الزجاج الطبق التصوير. ويمكن استخدام مجهر تستقيم في تركيبة مع غمر المياه لمسافات طويلة أو أهداف الجافة وينبغي وضع الجنين مثل تلك المنطقة من اهتمام هو أقرب إلى الهدف ممكن.
  3. السماح للالاغاروز يصلب وغمر انخفاض الاغاروز في المياه التي تحتوي على البيض Tricaine (انظر 4.5). إذا تم استخدام مجهر تستقيم، ضع زلة غطاء زجاجي على أعلى من تجويف الاكتئاب (لا تسمح لتشكيل فقاعات الهواء).
  4. اكتساب بالتسلسل انفلونزاorescence والصور انتقال.
  5. إزالة بعناية الاغاروز من الجنين مع ملاقط غرامة ووضع الجنين مرة أخرى إلى المياه بيضة إذا كان ذلك مطلوبا لتجارب أخرى.

9. ممثل النتائج

حقن من السالمونيلا التيفية الفأرية أو بكتيريا المتفطرة البحرية في جزيرة دم الأجنة في النتائج DPF 1 في البلعمة السريع بواسطة الضامة. وقد تم مؤخرا في الجينات التي تم تحديدها MPEG1 كعلامة المؤمنين من الضامة الجنينية، colocalizing مع csf1r راسخة علامة البلاعم (FMS) وعدم التداخل مع علامات العدلة مثل MPX (MPO) وlyz 4 و 14. للتصوير حي لالبلعمة البكتيرية استخدمنا خطوط المعدلة وراثيا في المروج التي MPEG1 يدفع فلوري بروتين تعبير في الضامة 14. هذه الخطوط المعدلة وراثيا لديها إما و مروج MPEG1استخدامها مباشرة لهذا الجين GFP، أو استخدام نظام يتألف من عنصر حيث المروج MPEG1 يقود التعبير عن عامل النسخ خميرة Gal4 أن ينشط التحوير الثاني مع تسلسل اعتراف Gal4 (UAS، وتفعيل المنبع تسلسل) منصهر إلى الجين Kaede الذي. عندما حقن جزيرة الدم (بروتوكول 5؛ الشكل 1A) يتم تنفيذها بشكل صحيح، فإن البكتيريا بالتدفق على الفور من خلال الدورة الدموية وينتشر في جميع أنحاء جنين. نشر S. DS-RED فلوري كبيرة نسبيا والزاهية المسمى ولا يمكن تصوير البكتيريا التيفية الفأرية مباشرة مع مجهر مضان ستيريو (الشكل 3A)، والتصوير مبائر في المعارض HPI 2 أن يتم phagocytosed العديد من أنواع البكتيريا بواسطة البلاعم فلوري (الشكل 3B-C). ضخ ما لا يزيد عن 25 وت س. النوع البري والبكتيريا التيفية الفأرية يؤدي الى عدوى قاتلة، في حين أن جرعة مماثلة من البكتيريا من ليالي عديم الفوعةيمكن أن يتم مسح القطار، مثل رع، من قبل النظام المناعي 3 الجنينية. تم استخدام حقن جرعة من 250 وت م لتحديد استجابات النسخي إلى س. أظهرت عدوى التيفية الفأرية في الجنين الزرد وتحريض قوية موالية للالتهابات الجينات استجابة التعبير 15. في المقابل، فإن الحقن في الوريد من م. marinum البكتيريا لا يستحضر القوية المؤيدة للالتهابات وردا على ذلك، بل يؤدي إلى التهاب مستمر حيث الضامة المصابة تشكيل المجاميع الضيقة التي تعتبر في المراحل الأولى من حبيبية، والتي هي السمة المميزة لمرض السل 2. مبائر التصوير من مجموع هذه الحبيبي، وكأنه في تيراغرام (MPEG1: EGFP) gl22 السطر 14 في 5 نقطة في البوصة ويبين نمو الخلايا من mCherry المسمى م. بكتيريا marinum داخل الضامة في الفلورية الخضراء (الشكل 3D-E).

بعد التمديدطرق العدوى لها هي مفيدة لأغراض مختلفة. ويمكن حقن البكتيريا إلى البطين الدماغ المؤخر في 32 HPF (الشكل 1C)، وهي مقصورة خالية من الضامة. حقن من 20-100 mCherry المسمى م. بكتيريا marinum في هذه المقصورة يؤدي إلى تسلل السريع من قبل الضامة أن يبلعم البكتيريا الشكل (4A). طريقة أخرى لدراسة الهجرة الموجهة من خلايا المناعة الفطرية هي حقن البكتيريا في عضلة الذيل (1D الشكل). ومع ذلك، والحقن العضلي ذيل أيضا أن يسبب تلف الأنسجة الذي في حد ذاته يثير بعض جاذبية من الكريات البيض. ويمكن تجنب مثل هذه الاستجابة اصابة عندما حقن بعناية حجم صغير (0.5-1 NL) في الحويصلة الأذنية (الشكل 1E). كما هو موضح هنا باستخدام تيراغرام (MPX: EGFP) i114 خط 16، ضخ حوالي 20 وت س. التيفية الفأرية في الحويصلة الأذنية يؤدي إلى جذب العدلات في 3 HPI ( الشكل 4D)، في حين لم يلاحظ هذا الرد في برنامج تلفزيوني مراقبة حقن (4E الشكل). والحبل الظهري، والتي يبدو أن مقاومة للتسلل من قبل كريات الدم البيضاء، وهي مقصورة متساهل لنمو م. المسوخ marinum التي هي الموهن بقوة عند حقنه في الأنسجة الأخرى (7)؛ (4F الشكل). أخيرا، والحقن في وقت مبكر من م. marinum في صفار البيض من الأجنة ويوفر طريقة بديلة لتحقيق العدوى النظامية. نقوم عموما هذه الحقن في جميع أنحاء مرحلة الخلية 16 (الشكل 1G)، ولكن يمكن أيضا حقن البكتيريا في صفار البيض أن يؤديها في مراحل لاحقة (حتى مرحلة خلية 1000)، أو في وقت سابق من (1 إلى 8 مرحلة الخلية) لاشتراكهما في الحقن مع morpholinos 8. بعد حقن صفار من جرعة من 20-40 وت، م. بكتيريا marinum موزعة على عدة أيام في الأنسجة الجنينية وشكل الركام الحبيبي مثل مشابهة لتلك التي لوحظت على التقليديةطريقة الحقن في الوريد 8؛ (4G الشكل). طريقة الحقن صفار البيض ليست مناسبة للس. التيفية الفأرية عدوى، وذلك لأن النمو السريع في صفار البيض يسبب الفتك في وقت مبكر. طريقة العدوى صفار البيض عن م. وسوف marinum عدوى تكون مفيدة لتطبيقات عالية الإنتاجية منذ يمكن أن يكون آليا باستخدام الروبوت حقن 8.

figure-protocol-1
الشكل 1. وتجرى عمليات الحقن في الوريد محة عامة عن طرق الحقن المستخدمة لإنشاء الالتهابات الجهازية أو المحلية في الأجنة الزرد. (AB) لإقامة عدوى السريعة الشاملة في الوريد الذيلية في جزيرة دم الخلفي في 1 DPF (A) أو في القناة كوفييه في 2-3 DPF (B). (CE) يتم تنفيذ الحقن محلي لدراسة البلاعم والعدلات الكيميائي إلى البطين الدماغ المؤخر في 1 DPF (C)، والعضلات في ذيل 1-2 DPF (D) أو حويصلة في أذني 2-3 DPF (E). (F) يتم تنفيذ الحقن لخلق وجود عدوى لا يمكن الوصول إليها على ما يبدو لالبالعات في الحبل الظهري في 1-2 DPF. (G) حقن لخلق وجود عدوى في وقت مبكر النظامية مع بطء نمو البكتيريا مثل م. لا يمكن أن يؤديها marinum في صفار البيض في مرحلة الخلية 16-1000. وقد اتخذت جميع الصور مع M165C لايكا، PLANAPO 1.0X متصلة كاميرا لايكا DFC420 (لايكا 10446307 0.8x).

figure-protocol-2
الشكل 2. حلقة الشعر أداة. يتم إدخال قطعة من الشعر البشري باعتباره حلقة في افتتاح ماصة باستير وثابتة في مكانها مع الصمغ السوبر أو مع تيب السابقين. هذا يوفر أداة مناسبة لمعالجة بلطف الأجنة الزرد الهشة.

figure-protocol-3
الشكل 3. حقن في الوريدأحمر فلوري التيفية الفأرية السالمونيلا والمتفطرة البحرية. S. DS-RED-المسمى التيفية الفأرية SL1027 بكتيريا (AC) وmCherry المسمى م. تم حقن marinum Mma20 بكتيريا (DE) في جزيرة دم TG (MPEG1: Gal4-VP16) gl24؛ تيراغرام (UAS-E1b: Kaede الذي) s1999t (AC) أو تيراغرام (MPEG1: EGFP) الأجنة gl22 الزرد (DE) في 28 HPF. (أ) صورة التراكب ستيريو ومضان ومشرق في الميدان تظهر نشر س. التيفية الفأرية في الدورة الدموية في HPI 2 (لايكا MZ16FA مجهر لايكا مع DFC420C الكاميرا). (قبل الميلاد) متحد البؤر Z-كومة التوقعات تظهر أحمر س. بكتيريا التيفية الفأرية phagocytosed بواسطة الضامة الخضراء في HPI 2 (لايكا TCS SPE، HCX APO هدف 40X 0.8 NA). ويمكن أيضا أن البكتيريا التي لا تزال خارج الخلية يتعين مراعاتها. (D) متحد البؤر Z-كومة إسقاط يظهر مجموع الحبيبي مثل التي تحتوي على م. الضامة marinum Mma20 المصابة وغير المصابة في 5 نقطة في البوصة (لايكا TCS SPE، HCX APO 40X0.8 NA). الضامة في الخضراء والبكتيريا باللون الأحمر. (E) متحد البؤر Z-كومة الإسقاط من البلاعم الفردية (الأخضر) مع م. بين الخلايا بكتيريا marinum (الحمراء). تم تصوير منطقة صورت في D من المستطيل الأبيض مع هدف تضخم أعلى (لايكا TCS SPE، HCX PL APO 63x 1.2 NA). Scalebars: 20 ميكرون.

figure-protocol-4
الشكل 4. طرق بديلة للإصابة الأجنة الزرد. (A) mCherry المسمى م. تم حقن marinum Mma20 البكتيريا إلى البطين الدماغ المؤخر في 32 HPF. مضان ونقل صورة التراكب تظهر البكتيريا mCherry المسمى phagocytosed بواسطة الضامة في 5 HPI (لايكا TCS SPE، HCX PL FLUO TAR 40.0x 0.7 NA). (B) س. تم حقن التيفية الفأرية في عضلة الذيل في 1 DPF. ويظهر جاذبية للخلايا الدم النخاعي في موقع الحقن (أبيض دائرة) في 3 و بواسطة HPIluorescent في التهجين في الموقع 4، (C) في حين أنه في الأجنة uninjected هناك عادة أي خلايا الدم النخاعي في هذا الموقع الصرفي. على الرغم من أن الأجنة لا تحتوي على العدلات الناضجة في هذه المرحلة، يمكن التمييز بين السكان من خلايا الدم النخاعي، واحد يعبر عن علامة بلعم mfap4 (الحمراء) واحد يعبر عن علامة العدلة MPX (الأخضر) (لايكا TCS SPE، HC PL FLUOTAR 10.0x 0.3 NA). ضاع مضان من البكتيريا بعد في إجراء التهجين في الموقع. (D) DS-RED-المسمى S. تم حقن البكتيريا التيفية الفأرية في الحويصلة الأذنية من تيراغرام (MPX: EGFP) i114 الزرد في 2 DPF. تراكب الصور ستيريو ومضان ومشرق في الميدان تبين أن MPX: تنجذب EGFP المسمى العدلات الخلايا لحويصلة في أذني المصابة (القطع الناقص منقط) في 3 HPI، (E)، في حين حقن السيطرة على برنامج تلفزيوني في الحويصلة الأذنية من تيراغرام (MPX: EGFP ) i114 الزرد لا تظهر جذب العدلات إلى اشتركوا في أذني غير مصابsicle (القطع الناقص منقط) (لايكا MZ16FA مع كاميرا لايكا DFC420C). (F) mCherry المسمى م. تم حقن البكتيريا marinum من eccCb1 E11 الموهن :: تينيسي سلالة متحولة 17 في الحبل الظهري في 1 DPF. تم تصوير الانتشار داخل الحبل الظهري في 5 نقطة في البوصة (لايكا MZ16FA المجهر مع DC500 الكاميرا). (G) mCherry المسمى م. تم حقن marinum البكتيريا E11 في صفار البيض من 16 خلية الأجنة الزرد مرحلة من مراحل (fli1a: EGFP) تيراغرام الخط الذي يعبر عن GFP في الخلايا البطانية من الدم والأوعية اللمفاوية. وقد لوحظ تشكيل الحبيبي، مثل تجمعات من الخلايا المصابة في منطقة الذيل في 5 نقطة في البوصة (مجهر MZ16FA لايكا مع كاميرا لايكا DFC420C؛ صورة من 8).

المناقشة

وكثيرا ما تستخدم أساليب العدوى المذكورة في هذه المقالة لدراسة وظيفة الجينات المضيف المناعة الفطرية أو الجينات الفوعة الجرثومية 1. وتستخدم عن طريق الحقن الدقيقة حقن أساليب (بروتوكولات 5 و 6.1) في أغلب الأحيان لمثل هذه الدراسات. على المنوال الذيلية في جزيرة دم الخلفي هو الموقع الأكثر ملاءمة للحقن في الوريد من 1 يوما الأجنة. كما الوريد الذيلية يصبح أكثر صعوبة في اختراق في مراحل لاحقة، ونحن نفضل القناة كوفييه وموقع الحقن في الوريد للأجنة في 2-3 DPF. في جميع الحالات فإن من الأهمية بمكان لحقن الأجنة مع أرقام متناسقة من البكتيريا، التي يجب أن يتم التحقق من قبل قائح حقن تصفيح لفرز وت. ويجب النظر في الجوانب التالية لتحقيق حقن استنساخه. أولا، من الضروري أن يكون عالي الجودة من الزجاج حقن الإبر microcapillary. إذا كان رأس إبرة كبيرة جدا، فإن حقن خلق ثقب ثقب كبيرة بما يكفي لحدوث نزيف وفإن البكتيريا حقن تتدفق من الدورة الدموية. ثانيا، لا بد من حقن البكتيريا مباشرة في الدورة الدموية. إذا كان رأس إبرة ليس داخل الوريد أو في حال انتشار السوائل الحقن في تمديد الكيس المحي، لا بد من التخلص من الجنين من هذه التجربة. ثالثا، وذلك باستخدام PVP40 باعتبارها الناقل لحقن م. وسوف marinum مساعدة في منع البكتيريا من الغرق في إبرة الزجاج. PVP40 يحسن تجانس التعليق، مما أدى إلى قائح أكثر استنساخه طوال مدة الحقن. ويمكن أيضا أن تستخدم لPVP40 س. حقن التيفية الفأرية، ولكن هنا هو أقل أهمية، لأن حجم أكبر ومضان مشرق من البكتيريا يسمح للمراقبة البصرية على حقن اللقاح خلال التجارب. لممارسة حقنا من المستحسن استخدام صبغ أحمر الفينول (1٪ V / V) أو 1 ميكرومتر فلوري المجالات المتاحة في مختلف الألوان (إينفيتروجن). بمجرد يتقن هذه التقنية، فإنه يأخذ ما يقرب من 30 minutوفاق لحقن 50-100 الأجنة، بما في ذلك الوقت اللازم لمواءمة الأجنة على لوحات الاغاروز وضبط حجم حقن البكتيريا.

في حين هي الأكثر شيوعا الحقن في الوريد في جزيرة الدم (بروتوكول 5) أو في قناة كوفييه (بروتوكول 6.1)، أثبتت طرق بديلة للعدوى الموضحة في هذه المقالة الفيديو مفيدة لدراسة البلاعم والعدلات الكيميائي (بروتوكولات 6.2، 6.3 ، و 6.4)، لدراسة نمو سلالات بكتيرية الموهن (بروتوكول 6.5)، وتكييف نموذج للعدوى الزرد عالية الإنتاجية التطبيقات (بروتوكول 6.6) 4-8. ويمكن أيضا وصف الدقيقة حقن أساليب تطبيقها لحقن من الفيروسات 18 و 19 و الجراثيم الفطرية 14، 20 أو طفيليات الأوالي (ماريا Forlenza، اتصال شخصي). إضافة مفيدة لإجراءات الحقن الموصوفة في هذه المقالة الفيديو هو إجراء وصف مؤخرا للحقن تحت الجلد من البكتيريا في zebrالأجنة عفيش 21. تم تطبيق هذا الإجراء لدراسة البلعمة من قبل العدلات من البكتيريا، التي عثر على بكتيريا تبتلع بكفاءة على أسطح الأنسجة ولكن، على النقيض من الضامة، وكانت عمليا غير قادر على يبلعم البكتيريا على الحقن في الدم أو في تجاويف الجسم مملوءة بسائل. للأجنة حقن تحت الجلد يتم وضع مماثل بالنسبة للحقن عضلة ذيل الموضحة في هذه المقالة الفيديو، ولكن تم إدخال إبرة تحت الجلد لحقن البكتيريا أكثر من الجسيدة.

من المهم أن نعتبر أن حقن الجزئي هو في جوهره طريقا الاصطناعي للعدوى. ومع ذلك، الأجنة في وقت مبكر من مقاومة عالية للتعرض الخارجي لمسببات الأمراض البكتيرية. في الواقع، المقايسات الغمر، حيث استحم الأجنة في تعليق البكتيرية، لا يمكن استنساخه في أيدينا 22. في حين أن بعض الأجنة يمكن أن يصاب على الغمر، وقد لاحظنا تفاوت كبير في معدلات وفيات و في التعبير عنايون من الجينات علامة التهابات بين الأجنة فرد في هذه المقايسات. طرق حقن الصغيرة الموضحة في هذه المقالة تحقيق التهابات متكررة ومفيدة بشكل خاص لدراسة التفاعلات البكتيرية مع الخلايا المضيفة المناعة الفطرية. وهو نهج فعال لتحديد العدوى البكتيرية في الأجنة الفردية هو تحليل الصور فلوري من الأجنة المصابة مع حسب الطلب، مخصصة بكسل البرامج الكمي 17 و 23. وقد تبين أن هذا النهج أنها تتطابق جيدا مع نتائج عمليات العد وت بعد طلي من الأجنة المصابة. وبالمثل، تم كميا التغيرات النسبية في أعداد الكريات البيض في الجنين بواسطة تحليل الصور الرقمية المعدلة وراثيا في خطوط الكريات البيض مراسل fluorophore، وهذا النهج من شأنه أن تكون قابلة للتطبيق لقياس استجابة المضيف leukopoietic إلى إصابة 24.

يمكن أن يتم التحقيق في وظيفة الجينات المضيف المناعة الفطرية بكفاءة في الجسم الحي من خلال الجمع بين نماذج عدوى صفهامع morpholino ضربة قاضية. [أليغنوكليوتيد] Morpholinos هي العقاقير الاصطناعية التي تستهدف RNAs ومحددة والحد من التعبير عن منتجات الجين عند حقنه في 1-خلية الأجنة الزرد مرحلة كما هو مبين في المادتين الفيديو وغيرها في هذه المجلة 10، 25. في دراسات ضربة قاضية morpholino، فإنه من الأهمية بمكان أن يتم عرض هذه الحفلات لجميع الفئات الجنين يمكن مقارنتها بشكل صحيح قبل حقن البكتيريا. هذا مهم بشكل خاص لأن الأجنة النامية لديها نظام المناعة الذي يصبح المختصة على نحو متزايد مع مرور الوقت.

هناك العديد من خطوط مراسل المعدلة وراثيا المتوفرة حاليا للتمييز بين مجموعات فرعية رئيسية المناعة الفطرية، الضامة والعدلات، في الأجنة الزرد. استخدمت MPX والمروجين lyz لتوليد خطوط مراسل العدلة 16، 26، 27، واستخدمت csf1r (FMS) والمروجين MPEG1 لانتاج صحفيين بلعم 14، 28. في حين CSFوأعرب بالإضافة إلى ذلك 1R (FMS) في xanthophores، MPEG1 التعبير هي حصرا في الضامة. كما هو موضح في هذا المقال الفيديو، وضعت مؤخرا خطوط مراسل MPEG1 مفيدة للغاية لالبلعمة التصوير البكتيرية بواسطة الضامة.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أشكر تشاو تسوى، الطابق دي كورت، ستوب استير وكارفاليو رالف لصور في الشكل 4، Nehrdich أولريك وديفي دي ويت لرعاية الأسماك، وغيرها من أعضاء مختبر لاجراء مناقشات مفيدة. ويدعم هذا العمل الذي يقوم به برنامج ميكس الذكية من وزارة الشؤون الاقتصادية الهولندية ووزارة التعليم والثقافة والعلوم، والمفوضية الأوروبية مشروع الإطار 7 ZF-الصحية (الصحة-F4-2010-242048) والاتحاد الأوروبي وماري كوري، التدريب الأولي شبكة FishForPharma (PITN-GA-2011-289209)، والتي NHMRC استرالي (637394). يتم اعتماد الأسترالي التجديدي معهد الطب من المنح المقدمة من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكاشف المزود فهرس العدد
الفينول الأحمر سيغما P0290
الغليسيرول سيغما الدريخ 228210
Difco أجار Middlebrook 7H10 بيكتون، ديكنسون، وشركة 262710
BBL التخصيب Middlebrook OADC بيكتون، ديكنسون، وشركة 211886
Difco Middlebrook 7H9 حساء بيكتون، ديكنسون، وشركة 271310
BBL التخصيب Middlebrook ADC بيكتون، ديكنسون، وشركة 211887
توين 80 سيغما الدريخ P1754
بوفيدون (PVP40) Calbiochem، ميرك KGaA 529504
N </ EM-> الفنيل (PTU) سيغما الدريخ P7629
إيثيل 3-أمينوبنزوات methanesulfonate الملح (Tricaine) سيغما الدريخ A5040
الميثيل السليلوز سيغما الدريخ M0387
SeaPlaque الاغاروز (الأقل ذوبان نقطة الاغاروز) Lonza المؤتمر الوطني العراقي. 50100
FluoSpheres (1.0 ميكرون، أحمر فلوري (580/605)) إينفيتروجن F8821
FluoSpheres (1.0 ميكرون، أصفر، أخضر فلوري (505/515)) إينفيتروجن F8823

المراجع

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  3. vander Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  4. Zakrzewska, A. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, 1-11 (2010).
  5. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
  7. Alibaud, L. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
  8. Carvalho, R. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).
  9. van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).
  13. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).
  14. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 49-56 (2011).
  15. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
  16. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  17. Stoop, E. J. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
  18. Levraud, J. P. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
  19. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
  20. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  21. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
  22. van Soest, J. J. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).
  23. Adams, K. N. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
  24. Ellett, F. L., Lieschke, G. J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. , (2011).
  25. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).
  26. Mathias, J. R. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).
  28. Gray, C. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عدوى بكتيريةتقنية الحقن المجهريبكتيريا فلوريةالمجهر البؤريالمناعة الفطريةالتفاعل بين المضيف والمسبب المرضيSalmonella TyphimuriumMycobacterium Marinumالتموضع داخل الخلايا
إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.