الهدف العام من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تنفيذ حقن الشبكية المستهدفة و في البيضة electroporation من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي يبني في شبكية العين كتكوت الجنينية في هامبورغ وهاملتون مرحلة 22-23، وهي عبارة عن يوم الجنينية 4 (E4). هذه التقنية مفيدة جدا لدراسة التعبير الجيني، تنظيم الجينات، والتغيير الصرفي في تطوير شبكية العين الفرخ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في Electroporation OVO في شبكية العين الفرخ الجنينية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
شبكية العين الدجاج الجنينية هو أداة ممتازة لدراسة تطوير شبكية العين في الفقاريات العليا. بسبب الحجم الكبير والتنمية الخارجية، فمن السهل جدا نسبيا لمعالجة شبكية العين كتكوت الجنينية باستخدام المؤتلف DNA / RNA التكنولوجيا. Electroporation من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في البنى الشبكية الجنينية تتمتع بميزة كبيرة لدراسة تنظيم الجينات في الخلايا الجذعية / السلف في شبكية العين خلال تطوير شبكية العين. لا يمكن أن يؤديها نوع مختلف من فحوصات مثل فحص الجينات المراسل، جين الافراط في التعبير، والجينات بهدم (shRNA) وما إلى ذلك باستخدام تقنية electroporation. هذا الفيديو يشرح حقن في شبكية العين، واستهدفت في electroporation البيضة في شبكية العين كتكوت الجنينية في هامبورغ وهاملتون مرحلة 22-23، وهي عبارة عن يوم الجنينية 4 (E4). هنا نعرض سريعة ومريحة في تقنية electroporation البيضة حيث يتم تسليمها مباشرة البلازميد التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) كعلامة فيكتكوت الجنينية الفضاء تحت الشبكية وتليها نبضات كهربائية لتسهيل امتصاص الحمض النووي عن طريق الخلايا الجذعية / السلف في شبكية العين. طريقة جديدة للحقن في شبكية العين وelectroporation في E4 يسمح التصور من جميع أنواع الخلايا في شبكية العين، بما في ذلك الخلايا العصبية في وقت متأخر من مواليد 1، والتي كان من الصعب مع الأسلوب التقليدي للحقن وelectroporation في E1.5 2.
البروتوكول
منذ يتم تنفيذ بعض أجزاء من بروتوكول كما هو موضح سابقا في أشرطة الفيديو وغيرها [جوف] 2 و 3 ورقات مع تعديلات طفيفة لن نناقش هذه بالتفصيل هنا.
1. التعامل مع البيض وتحضير الإبرة
- ويمكن تخزين البيض في النبيذ برودة في درجة مئوية حوالي 13 لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع. إذا كانت درجة الحرارة مرتفعة جدا، وسوف تبدأ الأجنة لوضع غير طبيعي، في حين أن انخفاض درجة الحرارة يؤدي ارتفاع معدل الوفيات. ذات مرة كنت على استعداد لاحتضان اخراج البيض من برودة النبيذ ووضع البيض عموديا مع أكبر في نهاية المطاف. الحفاظ على البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 2 ساعة قبل وضعها في الحاضنة 37.5 درجة مئوية.
- احتضان البيض ل96-100 ساعة وهي عبارة عن يوم الجنينية 4 للحصول على الأجنة التي هي في هامبورغ وهاميلتون 22 مرحلة 4-5.
- تعد الإبر micropipette من أنابيب زجاجية وسحبت شعري وكسر طرف في إطار الجزئي تشريحالنطاق مع ملاقط للحصول على افتتاح قمة حوالي 0.1 ميكرون في القطر، وتفتق 20 ملم. الإبر مع أكبر نصائح يجدون صعوبة في اختراق الغشاء المحي في حين أن أصغر نصائح يجدون صعوبة في التحميل وتقديم حل الحمض النووي.
- إرفاق الإبرة إلى 0.1 مل حقنة Gastight هاملتون التي شنت على micromanipulator. استخدام قطعة صغيرة من أنبوب السيليكون Masterplex لربط الإبرة إلى حقنة. منذ اتصالات ضيقة لا حاجة لإضافة الزيوت المعدنية لاغلاق هذا المرفق.
- خلط 2 ميكرولتر من حل مراسل البلازميد مع تركيز تتراوح 3-6 ميكروغرام / ميكروليتر و 0.2 ميكرو لتر من أخضر سريع (0.025٪) على قطعة من parafilm. سوف سريع الخضراء صبغ تساعد على تصور الحقن. ببطء، تحميل إبرة مع الخليط.
- لتحرير الغشاء المحي من الغشاء الداخلي تدوير البيض بلطف نحو 180 درجة، وانتظر بضع دقائق ثم تناوب على العودة الى الموقف الأصلي وضعه لelectroporation.
- مسح forcالعائد على السهم والبيض قذيفة مع الايثانول 70٪ لتجنب العدوى إلى الجنين.
- جعل ثقب صغير في البويضة مباشرة فوق الخلية الهواء مع زوج من حجم AA ملقط. يجب الحرص على عدم كسر قشرة البيضة. إزالة قطع صغيرة في وقت واحد لجعل نافذة صغيرة. إزالة الغشاء الداخلي بعناية باستخدام ملقط دون لمس الغشاء المحي.
2. الحقن وElectroporation
- لمنع تلف في الدماغ أو القلب، وموقف مضاد إبرة الوحشي على حزمة رئيسية من الأوعية الدموية التي تدخل العين ومشيرا نحو منقار.
- بيرس من خلال الغشاء المحي، الصلبة، شبكية العين والفكاهة زجاجي بواسطة الضغط معتدل المفاجئ للإبرة. إذا كانت إبرة يثقب من خلال الطرف الآخر من العين يجب أن تكون على ما يرام ما لم يضر أي وريد الدم الرئيسية.
- سحب ببطء مرة أخرى الإبرة على حافة فتح ووضعه المماس تقريبا على الجدار الخارجي من مقلة العين.
- Inserتي الإبرة في الفضاء في شبكية العين الفرعية بين الصلبة والشبكية.
- حقن الحمض النووي حتى تتمكن من تصور حل أخضر سد جانب من مقلة العين، ودفع إلى الداخل شبكية العين عن طريق إنشاء انتفاخ.
- إذا الطرح الخاص إبرة لا يصح عندئذ سترى الحل الحمض النووي الانتشار داخل النكتة زجاجي يملأ وسط كرة العين. أيضا، إذا كنت تلف شبكية العين أكثر من اللازم بعد ذلك سوف ترى حل الحمض النووي هو الخروج من مقلة العين.
- إزالة الإبرة ببطء ووضعها فورا الأقطاب في مواز داخل البويضة بعد تمرغ في برنامج تلفزيوني. دفع بانخفاض الأقطاب إلى غمر في السائل الذي يحيط بالجنين في طريقة بحيث يقع في العين حقن بين الأقطاب الكهربائية. تجنب لمس أي الأوعية الدموية الكبرى أو القلب مع الأقطاب في حين وضعها. ينبغي أن يكون من القطب السالب إلى جانب حقن بحيث يمكن نقل هذا الحمض النووي من مساحة الشبكية الفرعية في شبكية العين باتجاه القطب الموجب. كهرباءporate الشبكية مع 5 نبضات من 15V لمدة 50 مللي مع فترات MS 950.
- إزالة بعناية الأقطاب وختم نافذة من البيض مع قطعة من لاصق شفاف واضح.
- التسمية وحتى الآن حقن البويضة قبل إعادته إلى الحاضنة. عادة، يستغرق حوالي 3 إلى 5 دقائق لإتمام عملية electroporation كله.
- ويمكن رؤية GFP التعبير في أقرب وقت بعد 8 ساعات electroporation. ومع ذلك، قد تنتظر حتى يصل إلى مرحلة الجنين المطلوب قبل الحصاد.
3. ممثل النتائج
في دراستنا، ونحن نستخدم بنيات بلازميد مختلفة لدراسة تنظيم التعبير الجيني التي تنطوي على تطوير خلية شبكية العين. في هذا الفيديو تم استخدام pCAG-GFP (مراقبة ترنسفكأيشن) لمتابعة حقن ناجحة وelectroporation. ومع ذلك، يمكن استخدام أي بناء البلازميد مع الجينات مراسل (GFP، طلب تقديم العروض وغيرها). ويمكن أن ينظر إليه على الرغم من GFP التعبير في أقرب وقت 8 ساعات بعد ايلىctroporation، ونحن عادة ما تبدأ حصاد البيض في يوم 6 (E6) وما بعده. تم تشريح Electroporated شبكية العين من الجنين وتحليلها تحت مجهر تشريح فلوري قبل دمج وباجتزاء. عادة، يمكن أن ينظر مراسل التعبير الجيني في ما لا يقل عن ربع شبكية العين بعد electroporation الناجحة (الشكل رقم 1). وقد تم تحليل مزيد من أنسجة الشبكية من خلال transfected باجتزاء لتصور واضح للmorphologies الخلية. المناعية باستخدام علامات نوع من الخلايا المحددة (Brn3a، Pax6 الخ) توصيف سمح التعبير GFP خلية محددة (الشكل رقم 2).
الشكل 1. تم حقن electroporation ناجحة للتعبير مراسل نتائج إيجابية GFP البلازميد. الدجاج الجنينية شبكية العين وelectroporated في يوم الجنينية (4) وتحصد في يوم الجنينية 6. وكان transfected بنجاح ما لا يقل عن 25٪ من شبكية العين (وجهة نظر = الأعلى، B= عرض القاع). جدول المحامين = 1MM.
الشكل 2. توصيف GFP معربا عن خلايا الشبكية باستخدام المناعية. GFP معربا عن الأنسجة الشبكية في E7 مرحلة كانت ثابتة ومقطوع. ثم تم صبغ هذه المقاطع مع علامات خلية مختلف محددة. وقد استخدم Brn3a لتحديد خلايا العقدة (أ) في حين كان يستخدم لتحديد Pax6 أفقي، عديم الاستطالات وخلايا العقدة (B). شريط النطاق = 50 ميكرون.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
استهدفت حقن في شبكية العين وelectroporation البيضة في شبكية العين في المرحلة الجنينية E4 يمكن أن تستهدف على وجه التحديد الخلايا الاصلية في شبكية العين مما يؤدي إلى القدرة على تصور كل خلية شبكية العين 6 أنواع رئيسية على مستوى خلية واحدة. في electroporation البيضة في HH10 (~ E1.5) التي تستهدف الحويصلة البصرية قادرة على transfect الخلايا التي تضع لتشكيل العين. ومع ذلك، وهذه الخلايا لها دوران عالية جدا في هذا الوقت وهذه الطريقة ليست محددة لخلايا الشبكية. قد ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد وافق كل من التجارب على الحيوانات من قبل رعاية الحيوانات المؤسسية واللجنة المرافق في جامعة روتجرز.
شكر وتقدير
نود أن نشكر السيد معاذ أنور لاستخدام كاميرا HD له (كانون VIXIA HFS100). وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (EY018738)، نيو جيرسي جنة البحوث الحبل الشوكي (08-3074-SCR-E-0 و 10-3091-SCR-0-E)، وبوش جائزة بحوث الطبية الحيوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| المخصبة الخالية من العوامل الممرضة (SPF) دجاج البيض الأبيض ليفورنو | مزارع شروق الشمس (الكاتسكل، نيويورك) | ||
| بيضة دجاجة حاضنة | GQF التصنيع، سافانا، GA | نموذج-1550 | لتعيين نسبة الرطوبة 60٪ و 37.5 درجة مئوية. |
| أنابيب زجاجية الشعرية | العالم آلات دقيقة شركة | TW150F-4 | |
| 0.1 مل حقنة | هاميلتون شركة رينو، نيفادا | Gastight 1710 | ويمكن استخدام المحاقن 1ml بدلا من ذلك أيضا |
| Masterflex سيليكون (بيروكسيد) الأنابيب | كول، Parmer | HV-96400-13 | قطع قطعة صغيرة (1 سم) لربط الإبرة زجاج إلى المحقنة |
| ملاقيط | دومون | AA | |
| Micromanipulator | العالم آلات دقيقة شركة | M3301-M3 | |
| بلازميد الحمض النووي | وقد اقترضت pCAG-GFP من الدكتور كوني Cepko | ||
| سريع الأخضر FCF | سيغما الدريخ | F7252 | تمييع ل0.025٪ مع برنامج تلفزيوني |
| نبض مولد | جهاز هارفارد، MA | BTX ECM 830 | مربع موجة مولد |
| الأقطاب الكهربائية | جهاز هارفارد، MA | BTX طراز 514 | كانت متباعدة أقطاب لدينا 3-5 ملم بعيدا |
| كاميرا رقمية أحادية اللون | زييس، ألمانيا | Axiocam MRM | |
| فلوري تشريح مجهر | لايكا مايكروسيستمز، ألمانيا | لايكا MZ16FA | |
| الإسفار مجهر تستقيم | زييس، ألمانيا | زييس محوري تصوير A1 |
المراجع
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
