مقالة منهجية

طرق الفحص ذبابة الفاكهة سلوك

DOI:

10.3791/3795

⸱

مارس 7, 2012

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Genetics, Louisiana State University Health Sciences Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو وراثيا وسلوكيا نظام نموذج قابل للطرق التي استخدمت لفهم الأساس الجزيئي والخلوي من العديد من العمليات البيولوجية الهامة لأكثر من قرن 1. ذبابة الفاكهة قد تم استغلالها بشكل جيد للحصول على نظرة ثاقبة الأساس الجيني للسلوك الذباب.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت ذبابة الفاكهة السوداء البطن، ذبابة الفاكهة، لدراسة الآليات الجزيئية لمجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية المختلفة 1. وقد الأمثل نحن المقايسات سلوكية بسيطة وقوية لتحديد تنقل اليرقات، البالغ قدرة تسلق (فحص RING)، والسلوكيات التودد من ذبابة الفاكهة. هذه المقايسات سلوكية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة دور العوامل الوراثية والبيئية على سلوك الذباب. ويمكن استخدام اليرقات القدرة الزحف موثوق بها لتحديد التغيرات في مرحلة مبكرة قدرات الزحف من يرقات ذبابة الفاكهة، وأيضا لدراسة تأثير الأدوية أو الجينات الأمراض التي تصيب البشر (في الذباب المعدلة وراثيا) في تحرك لهم. الفحص الزحف اليرقات ويصبح أكثر قابلية للتطبيق في حالة التعبير أو إلغاء الجين يسبب الفتك في مراحل العذراء أو الكبار، حيث أن هذه الذباب لا البقاء على قيد الحياة إلى سن البلوغ حيث أنها على خلاف ذلك يمكن تقييم. هذا الأساسية 1ويمكن أيضا ssay استخدامها جنبا إلى جنب مع الضوء الساطع أو الضغط لدراسة الاستجابات السلوكية إضافية في يرقات ذبابة الفاكهة. وقد المغازلة على نطاق واسع للتحقيق في الأساس الجيني للسلوك الجنسي، ويمكن أن تستخدم أيضا لدراسة نشاط والتنسيق، فضلا عن التعلم والذاكرة. ذبابة الفاكهة المغازلة ينطوي على تبادل للتنمية مداركه الحسية المختلفة بما في ذلك البصرية والسمعية، وإشارات حسي كيميائي بين الذكور والإناث التي تؤدي إلى سلسلة معقدة من التصرفات الحركية تتميز بشكل جيد وبلغت ذروتها في جماع ناجح. المقايسات الكبار التقليدية التسلق (انجذاب بالجاذبية السلبية) هي شاقة، تتطلب عمالة مكثفة، وتستغرق وقتا طويلا، مع تفاوت كبير بين التجارب المختلفة 2-4. السريع تكرارية انجذاب بالجاذبية السلبية (RING) فحص 5 مزايا كثيرة اكثر من البروتوكولات المستخدمة على نطاق واسع أكثر، وتوفير نهج الإنتاجية استنساخه، الحساسة، وارتفاع لتحديد الحركي الكبار والسلبية ب انجذاب بالجاذبيةehaviors. في مقايسة RING، ويمكن اختبار المورثات أو عدة أدوية في وقت واحد باستخدام عدد كبير من الحيوانات، مع اقتراب عالية الإنتاجية مما يجعلها أكثر قابلية للتجارب الفرز.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. الفحص اليرقات الزحف

1. اليرقات مجموعة

  1. انشاء زجاجة اوقية (الاونصة) 8 من الذباب (10-15 ذكور + إناث 10-15).
  2. اسمحوا الذباب تضع بيضها لمدة 24 ساعة، ثم زجاجة واضح من الذباب. (نقل من البالغين في زجاجة جديدة، وكرر حسب الضرورة).
  3. احتضان زجاجة لمدة 3-4 أيام، أو حتى 3 يرقات الطور مرئية.
  4. إضافة 50 - في زجاجة مع يرقات 100 مل من السكروز بنسبة 20٪ والسماح للجلوس لمدة 20 دقيقة. واليرقات تطفو الى الاعلى.
  5. قطع جمع اليرقات باستخدام ماصة 25 مل المصلية مع طرف باتجاه آخر، والمكان الى سلة شبكية.
  6. غسل اليرقات في سلة شبكة مرتين مع منزوع الأيونات O. 2 H اليرقات هي الآن جاهزة للتجارب.

2. لعلاج اليرقات مع المخدرات

  1. استخدام فرشاة لنقل العدد المرغوب فيه من اليرقات إلى دورق 5 مل تحتوي على السكروز حل 5٪ + المخدرات.
  2. اسمحوا تتغذى اليرقات على الأقل 15 دقيقة.
  3. صب المخدرات بمبيدات اليرقات في سلة شبكة والشطف. وهم الآن على استعداد لاستخدام.

3. (سافر قياس المسافة الإجمالية أو تقلصات جدار الجسم) الفحص الحركي

  1. استخدام فرشاة لنقل يرقة الفردية إلى:
    1. 15 طبق بيتري سم تحتوي على الاغاروز 2٪ (صب سابقا وسمح لتتصلب) على ورقة الرسم البياني مع شبكة 0.2 2 سم.
      1. عد عدد من خطوط الشبكة عبرت في 1 دقيقة.
    2. كذلك من وعاء زجاجي يحتوي على تشريح عجينة الخميرة تمييع الحل.
      1. عد تقلصات التمعج (الأمامي الكامل لحركة الخلفي = 1 تقلص) في دقيقة واحدة مع مراعاة تشريح تحت المجهر.
  2. كرر حتى يتم احتساب الأرقام المرجوة من اليرقات.

باء سريع متكررة انجذاب بالجاذبية السلبية (RING) البروتوكول

وكان دي أصلا هذا الاختبارscribed بواسطة جارجانو وآخرون 5.

  1. جمع ظهرت حديثا الذباب الذكور البالغين تحت تخدير خفيف CO 2 ومكان في المواد الغذائية التي تحتوي على قنينة معيار (أو الغذاء + المخدرات).
  2. الحفاظ على الذباب في درجة حرارة الغرفة (على رأس مقاعد البدلاء. ~ 22 درجة مئوية) لمدة 2-3 أيام للسماح للانتعاش من CO 2 (وتراكم مستويات الدواء الحالة المستقرة إذا كان ذلك مناسبا).
  3. نقل حوالي 25 الذباب دون التخدير إلى قارورة البوليسترين المعدة.
  4. جمع قارورة مع الذباب في جهاز RING (الشكل 1).
  5. السماح للذباب حتى يتأقلم مع البيئة، دون عائق، لمدة 15-20 دقيقة.
  6. خلال هذه الكاميرا الرقمية مكان وقت ~ 1 متر أمام جهاز (على منصة وإذا كان ذلك ضروريا لتحقيق المواءمة بين مركز العدسة في منتصف ارتفاع من قوارير)، تركيز وتكبير الكاميرا على الجهاز، وتحديد توقيت ل 3.0 ثانية.
  7. تأخذ بعناية عقد لجهاز خاتم مع يدك اليسرى، حتى لا حيURB الذباب، واجراء موقت مع يدك اليمنى.
  8. الاستفادة بشكل كبير من جهاز إلى أسفل على السطح من على مقاعد البدلاء ثلاث مرات، وضمان أن الحنفية ما يكفي من الصعب أن نهدم جميع الذباب على الجزء السفلي من قنينة.
  9. بالتزامن مع الانتهاء من الصنبور الثالث، يبدأ العد التنازلي 3 2.
  10. في ثلاث ثوان التقاط صورة.
  11. إعادة تعيين مؤقت لمدة 1 دقيقة وتبدأ. خلال هذا الوقت إعادة كاميرا، والتركيز على الجهاز، ووضع قناة أخرى من الموقت لمدة ثلاث ثوان.
  12. بعد 1 دقيقة، كرر الخطوات من 1،7-1،10
  13. بعد ما مجموعه 5-6 المحاكمات، وتحميل الصور على جهاز كمبيوتر واستخدام المشاهد المفضلة لديك صورة لفتح، ويسجل ارتفاع متوسط ​​قفز عن كل قارورة.
  14. لتحليل احصائى على مجموعات مختلفة الخاص مقارنة ارتفاع متوسط ​​ارتفع.

جيم تودد والفحص التزاوج

  1. أول شيء في الصباح، واضح تماما المنتجة للزجاجات FLIلاستخدامها وفاق.
  2. على مدار اليوم (كل 3-4 ساعات)، وجمع ظهرت حديثا من الذكور والإناث ساذج عن طريق الاتصال الجنسي:
    1. وضع الذكور على حدة في قوارير أو أنابيب مع المتوسط.
    2. 5-6 تضع الإناث معا في قارورة / أنبوب.
    3. عزل الذباب التي تم جمعها في 25 درجة مئوية تحت ضوء الموارد البشرية 12 / مظلم لمدة 5 أيام.
    4. نقل امرأة واحدة في غرفة من عجلة التزاوج.
    5. نقل واحد من الذكور في غرفة عجلة التزاوج.
    6. مراقبة الزوج تحت المجهر لتشريح المشكلات التالية:
      1. توجه (وبتوجيه من الذكور نحو الإناث)
      2. التنصت (من الذكور والإناث الصنابير)
      3. الجناح أغنية (من الذكور ويهتز يمتد جناح واحد)
      4. لعق (ويلعق من الذكور والإناث الأعضاء التناسلية)
      5. الشباك (الذكر تجعيد الشعر البطن بموجب نفسه)
      6. محاولة الجماع (الشباك النشاط أثناء محاولة تحميل والإناث)
  3. مراقبة لمدة 10 دقائق أو حتى الجماع ناجحة، مشيرا الى ان الوقت الذي كل السلوك (كمون)، وإجمالي الوقت تشارك في المغازلة حتى الجماع (لحساب مؤشر المغازلة)، فضلا عن عدد من أزواج التي تؤدي بنجاح سلوك معين ( تردد). وسوف 100٪ من أزواج نوع البرية تتزاوج عادة في غضون 5 دقائق.
  4. حساب أمضى مؤشر المغازلة (CI) من خلال تقسيم الوقت في التودد مقسوما على مجموع الوقت حتى الجماع. لأزواج النوع البري هذا يتراوح عادة بين 0،6-0،8.

D. الممثل النتائج

الزحف مقايسة

وطبيعي يرقة نوع البرية يهيمون على وجوههم ~ 3 سم / دقيقة، ومعرض ~ 40-50 تقلصات جدار الجسم في دقيقة واحدة. وقد وضعنا مؤخرا نموذجا ذبابة الفاكهة من التصلب الفتح / TLS ذات الصلة الجانبي الذي يظهر اليرقات عيب الزحف، عمر مخفضة والكبار التسلق ضعف 6. نحن استهدفت التعبير سأداء و نوع البرية وأشكال متحولة من الفتح / TLS إلى الخلايا العصبية الحركية (OK-371-gal4 سائق) وفحص الزحف اليرقات. كما هو مبين أدناه، البرية يرقات نوع الزحف تصل إلى 12 سم، في حين أن التعبير عن الفتح نوع البرية انخفضت قدرة اليرقات الزحف إلى ما يقرب من 6 سم. الحيوانات معربا عن R521C تحور المرض تسبب في الفتح / TLS يبرهن على وجود ضعف شديد جدا في حركة الزحف على (الشكل 1)، والزحف نحو 1 سم فقط / دقيقة.

سلبي فحص انجذاب بالجاذبية RING

وينبغي أن الذباب الشباب البالغين من النوع البري لديها ارتفاع متوسط ​​التسلق من 4-5 سم ~ في فترة زمنية 3-2 (يمكن تعديلها في وقت من 3 ثوان لاستيعاب سلالات مختلفة أو مستويات النشاط لتحديد ارتفاع متوسط ​​نظرا لمعطى توتر / العلاج). يتم تعيين الذباب التي لا تزال في اسفل قيمة 0. لا ينصح باستخدام أكثر من 25 الذباب في قارورة لأنه عندئذ يصبح من الصعب تحديد موقع كل فرد ذبابة لقياس الارتفاع. N وقد لوحظ س الحساسية في ما يصل الى 6 محاكمات متتالية متباعدة 1 دقيقة باستثناء أننا قد استخدمت. فمن الأهمية بمكان ليس لإعادة استخدام قوارير اختبار البوليسترين في هذا الاختبار بعد غروب الأولي للبيانات يتم جمعها بسبب الذباب الجديدة التي وضعت في قارورة استخدمت لن يصعد الى حد ذاته كما هو الحال في قوارير جديدة.

figure-protocol-1
الشكل 1. الإعداد لفحص RING. يتم وضع كاميرا رقمية ~ 1 متر في الجبهة من الأجهزة التي تحتوي على الذباب في قوارير البولي ستايرين، والتركيز، والتكبير الكاميرا على الجهاز، وتحديد توقيت إلى 3.0 ثانية.

figure-protocol-2

بيانات الممثل الشكل 2. من فحص الزحف يرقات الذباب باستخدام تعبير ectopically UAS-WT الفتح، وUAS-FUS R521C تحت سيطرة سائق الخلايا العصبية الحركية (OK371-gal4).

الطبقة = "jove_content">

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وينظم بإحكام ذبابة الفاكهة السلوك بعوامل وراثية وبيئية. لقد كنا، وغيرها، وسبق للفحوصات وصفها هنا لجمع البيانات لدراسة الجينات المرتبطة بالطيران السلوكيات وأمراض الاعصاب على غرار الإنسان في ذبابة الفاكهة 5-19. لفحص الزحف، واختيار دقيق من 3 يرقات العمر الثالث هو خطوة حاسمة. إذا علاج بعقار، وسوف يستغرق 10-15 دقيقة (أو أكثر تبعا لنوع وطبيعة الدواء) لتحقيق أقصى تأثير إذا كان لديه القابلية للذوبان جيد. ولذلك، فإننا إطعام بشكل روتيني الذباب الدواء ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر Astha Maltare لتوليد البيانات الزحف اليرقات. نود أن نشكر الدكتور نيكولاس Lanson الابن لإعطاء تعليقاته على المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المركز باكارد روبرت لALS في جامعة جونز هوبكنز (لUBP) وتصلب جانبي ضموري جمعية (UBP)، وR01MH083689 من المعاهد الوطنية للصحة العقلية (كندي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد
سكر القصب فيشر العلمية S5-500
الاغاروز إينفيتروجن 16500-500
6 زجاجة أوقية ذبابة الفاكهة جينيسي العلمية 32-130
فرشاة الدهان (# 1) تيد بيلا، شركة 11859
يطير المكونات الغذائية
دقيق الذرة فيشر العلمية NC9109741
أجار جينيسي العلمية 66-104
دبس السكر فيشر العلمية NC9349176
حامض البروبيونيك Acros 14930-0010
Tegosept قمة 20-258
الإيثانول الصيادعلمي BP2818-4
خميرة جينيسي العلمية 62-107

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  2. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature Mar. 23 (6776), 394-398 (2000).
  3. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nat. Med. 8 (11), 1185-1186 (2000).
  4. Whitworth, A. J., Theodore, D. A., Greene, J. C., Benes, H., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Increased glutathione Stransferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (22), 8024-8029 (2005).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Lanson, N. A., Maltare, A., King, H., Smith, R., Kim, J. H., Taylor, J. P., Lloyd, T. E., Pandey, U. B. A Drosophila model of FUS-related neurodegeneration reveals genetic interaction between FUS and TDP-43. Hum. Mol. Genet. 20 (13), 2510-2523 (2011).
  7. Batlevi, Y., Martin, D. N., Pandey, U. B., Simon, C. R., Powers, C. M., Taylor, J. P., Baehrecke, E. H. Dynein light chain 1 is required for autophagy, protein clearance, and cell death in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (2), 742-747 (2010).
  8. Sang, T. K., Chang, H. Y., Lawless, G. M., Ratnaparkhi, A., Mee, L., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Krantz, D. E., Jackson, G. R. A Drosophila model of mutant human parkin-induced toxicity demonstrates selective loss of dopaminergic neurons and dependence on cellular dopamine. J. Neurosci. 27 (5), 981-992 (2007).
  9. Stacey, S. M., Muraro, N. I., Peco, E., Labbé, A., Thomas, G. B., Baines, R. A., van Meyel, D. J. Drosophila glial glutamate transporter Eaat1 is regulated by fringe-mediated notch signaling and is essential for larval locomotion. J. Neurosci. 30 (43), 14446-14457 (2010).
  10. Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
  11. Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
  12. Nedelsky, N. B., Pennuto, M., Smith, R. B., Palazzolo, I., Moore, J., Nie, Z., Neale, G., Taylor, J. P. Native functions of the androgen receptor are essential to pathogenesis in a Drosophila model of spinobulbar muscular atrophy. Neuron. 67 (6), 936-952 (2010).
  13. Lorenzo, D. N., Li, M. G., Mische, S. E., Armbrust, K. R., Ranum, L. P., Hays, T. S. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell Biol. 189 (1), 143-158 (2010).
  14. Wang, J. W., Brent, J. R., Tomlinson, A., Shneider, N. A., McCabe, B. D. The ALS-associated proteins FUS and TDP-43 function together to affect Drosophila locomotion and life span. J. Clin. Invest. , (2011).
  15. Choi, J. K., Jeon, Y. C., Lee, D. W., Oh, J. M., Lee, H. P., Jeong, B. H., Carp, R. I., Koh, Y. H., Kim, Y. S. A Drosophila model of GSS syndrome suggests defects in active zones are responsible for pathogenesis of GSS syndrome. Hum. Mol. Genet. 19 (22), 4474-4489 (2010).
  16. Ruan, H., Wu, C. F. Social interaction-mediated lifespan extension of Drosophila Cu/Zn superoxide dismutase mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (21), (2008).
  17. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
  18. Becnel, J., Johnson, O., Luo, J., Nässel, D. R., Nichols, C. D. The serotonin 5-HT7 Dro receptor is expressed in the brain of Drosophila, and is essential for normal courtship and mating. PLoS One. 6 (6), e20800(2011).
  19. Johnson, O., Becnel, J., Nichols, C. D. Serotonin 5-HT(2) and 5-HT(1A)-like receptors differentially modulate aggressive behaviors in Drosophila melanoga- ster. Neuroscience. 158 (2), 1292-1300 (2009).
  20. Bastock, M., Manning, A. The Courtship of Drosophila Melanogaster. Behaviour. , 85-111 (1955).
  21. Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. Courtship in Drosophila. Annu. Rev. Genet. 34, 205-232 (2000).
  22. Villella, A., Hall, J. C. Neurogenetics of courtship and mating in Drosophila. Adv. Genet. 62, 67-184 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila BehaviorLarval Crawling AssayRING AssayCourtship AssayNegative GeotaxisMotor Function AnalysisGenetic FactorsEnvironmental FactorsDrug Treatment EffectsFly Locomotion

مقالات ذات صلة