عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية من عدم التجانس الخلوية من الدماغ ضروري للتحقيق في دورها في كل الظروف الفسيولوجية والمرضية. هذا البروتوكول يصف العزلة الميكانيكية والمختلطة تقنية زراعة الخلايا التي توفر عائدات عالية ونقاء عالية، وقابلة للحياة خلايا دبقية صغيرة الرئيسي لل في المختبر الدراسة والتطبيقات المصب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية المختلطة من زراعات الخلايا الغروية من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تشكل الخلايا الدبقية الصغيرة حوالي 12% من إجمالي عدد الخلايا في دماغ الثدييات. وبينما تُعتبر الخلايا العصبية والخلايا النجمية الأنواع الخلوية الرئيسية في الجهاز العصبي، تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة دوراً هاماً في الفسيولوجيا الطبيعية للدماغ من خلال مراقبة الأنسجة بحثاً عن الحطام والمسببات المرضية، والحفاظ على التوازن الداخلي في النسيج الحشوي عبر النشاط البلعمي 1,2. يتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة خلال العديد من حالات الإصابة والمرض، بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية، وإصابات الدماغ الرضحية، وعدوى الجهاز العصبي 3. وفي ظل ظروف التنشيط هذه، تزيد الخلايا الدبقية الصغيرة من نشاطها البلعمي، وتخضع لتغيرات شكلية وتكاثرية، وتفرز بنشاط أنواع الأكسجين والنيتروجين التفاعلية، والكيموكينات والسيتوكينات المحفزة للالتهابات، مما يؤدي غالباً إلى تنشيط حلقة إفرازية جنيبة أو ذاتية 4-6. وبما أن هذه الاستجابات للخلايا الدبقية الصغيرة تساهم في إمراضية الأمراض في الحالات العصبية، فإن الأبحاث التي تركز على الخلايا الدبقية الصغيرة تعد ضرورية.
نظراً للتغاير الخلوي في الدماغ، فمن الصعب تقنياً الحصول على كمية كافية من عينات الخلايا الدبقية الصغيرة بنقاوة عالية خلال التجارب in vivo. وتتطلب الأبحاث الحالية حول الوظائف الواقية للأعصاب والسامة للأعصاب للخلايا الدبقية الصغيرة طريقة تقنية روتينية لإنتاج خلايا دبقية صغيرة نقية وسليمة وبإنتاجية كافية للدراسة بشكل مستمر. ونقدم هنا، نصاً وفيديو، بروتوكولاً لعزل خلايا دبقية صغيرة أولية نقية من مستنبتات دبقية مختلطة لمجموعة متنوعة من التطبيقات اللاحقة. وباختصار، تستخدم هذه التقنية أنسجة دماغية مفككة من صغار الجرذان حديثي الولادة لإنتاج مستنبتات خلايا دبقية مختلطة. وبعد وصول المستنبتات الدبقية المختلطة إلى مرحلة الاندماج، يتم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية ميكانيكياً من المستنبت عن طريق الرج لفترة وجيزة. ثم يتم زرع الخلايا الدبقية الصغيرة بنقاوة عالية لإجراء الدراسات التجريبية.
لقد وُصف مبدأ وبروتوكول هذه المنهجية في الأدبيات العلمية 7,8. بالإضافة إلى ذلك، فإن المنهجيات البديلة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية موصوفة جيدًا 9-12. يمكن فصل أنسجة الدماغ المتجانسة عن طريق الطرد المركزي بتدرج الكثافة للحصول على خلايا دبقية صغيرة أولية 12. ومع ذلك، فإن عملية الطرد المركزي تستغرق وقتًا متوسطًا (45 min) وقد تسبب تلفًا وتنشيطًا خلويًا، بالإضافة إلى إنتاج خلايا دبقية صغيرة مخصبة ومجموعات خلوية أخرى. وقد استُخدم بروتوكول آخر لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية عن طريق الرج المطول (16 hr) أثناء الزرع 9-11. وبعد الرج، يتم طرد السائل الطافي في الوسط مركزيًا لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة. قد تؤدي طريقة العزل هذه المكونة من خطوتين والأكثر طولاً أيضًا إلى اضطراب وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة وتنشيطها. نحن نعتمد بشكل أساسي بروتوكول عزل الخلايا الدبقية الصغيرة التالي في مختبرنا لعدة أسباب: (1) تحاكي الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية البيولوجيا in vivo بدقة أكبر من الخطوط الخلوية للخلايا الدبقية الصغيرة الخالدة في القوارض، (2) يقلل التفكيك الميكانيكي الاسمي من احتمالية حدوث خلل وظيفي خلوي أو تنشيط، و(3) يمكن الحصول على إنتاجية كافية دون الحاجة إلى تمرير مزارع الخلايا الدبقية المختلطة.
من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول يستخدم أنسجة دماغية من صغار الجرذان حديثي الولادة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة، وأن استخدام جرذان أكبر سناً لعزل هذه الخلايا يمكن أن يؤثر بشكل كبير على كمية الحصيلة، وحالة التنشيط، والخصائص الوظيفية للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة. وهناك أدلة تشير إلى أن الشيخوخة مرتبطة بخلل في وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة، وزيادة الالتهاب العصبي، والاعتلالات العصبية التنكسية، لذا استخدمت دراسات سابقة الخلايا الدبقية الصغيرة البالغة المستخلصة ex vivo لفهم دور هذه الخلايا بشكل أفضل في الأمراض التنكسية العصبية التي تعد الشيخوخة فيها عاملاً مهماً. ومع ذلك، لا يمكن الحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة المستخلصة ex vivo في المزارع الخلوية لفترات زمنية طويلة. وبناءً على ذلك، ورغم أن هذا البروتوكول يطيل عمر الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في المزرعة، يجب ملاحظة أن هذه الخلايا تسلك سلوكاً مختلفاً عن الخلايا الدبقية الصغيرة البالغة، وينبغي توخي الحذر عند تعميم نتائج الدراسات التي أجريت in vitro على البيئة الحية in vivo.
البروتوكول
1. تشريح من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ
- البرد ليبوفيتز لL-15 وسائل الإعلام مكيفة (ليبوفيتز L-15 + 0.1٪ BSA + 1٪ القلم / بكتيريا) إلى 4 درجة مئوية. وسائل الإعلام ثقافة الدافئة (DMEM + 10٪ + 1٪ FBS البنسلين / الستربتومايسين عقار) إلى 37 درجة مئوية. إعداد 4 60x15 ملم أطباق بتري مع مل 4-5 من وسائل الإعلام L-15 مكيفة على الجليد. تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع الإيثانول بنسبة 100٪.
- شطف P2 الجراء الراب الوليد مع الايثانول 70٪. (ويمكن استخدام الفئران الوليدة حديثي الولادة الذين تتراوح أعمارهم بين P1-P5 في هذا البروتوكول.)
- قطع رأس بسرعة فأر الجرو مع مقص حاد عقيم وإسقاط رئيس فورا إلى إيثانول 70٪. تكرار لما مجموعه الفئران الوليدة 5 ثم نقل إلى رؤساء محلول ملحي.
- إزالة دماغ كامل من رؤساء ومكان في طبق بيتري مع 4-5 مل L-15 حل (ليبوفيتز L-15 + 0.1٪ BSA + 1٪ القلم / بكتيريا) على الجليد.
- كرر الإجراءات 1،2-1،4 لالجراء المتبقية في القمامة.
- إزالة السحايا من الدماغ ونقل قصرired أنسجة المخ (أي القشرة، المخيخ والمخ كله، وما إلى ذلك) في طبق بيتري جديد مع مل 4-5 من حل-15 L (ليبوفيتز L-15 + 0.1٪ BSA + 1٪ القلم / بكتيريا) على الجليد.
2. إعداد المختلطة السكان الخلايا الغروية
- بدون نسيج الدماغ مع مقص أو شفرة 1، نقل الأنسجة مع ماصة 10 مل إلى 50 مل أنبوب معقم مخروطي.
- منبذة المخروطية في 2500 إطار التعاون الإقليمي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نضح طاف. إضافة مل 4-5 من وسائل الإعلام L-15 الطازجة (ليبوفيتز L-15 + 0.1٪ + 1٪ BSA القلم / بكتيريا).
- ماصة النسيج صعودا ونزولا 10 مرات مع ماصة معقمة 10 مل.
- وضع مصفاة الخلية (مسام ميكرون 100) على أنبوب جديد 50 مل مخروطي. ماصة النسيج صعودا وهبوطا مرة واحدة مع ماصة معقمة و 5 مل مع ماصة مطاردة لمصفاة الخلية، والاستغناء عن المواد من خلال مصفاة الخلية في أنبوب مخروطي الشكل.
- شطف مصفاة مع خلية 4-5 مل من وسائل الإعلام L-15 الطازجة (ليبوفيتز L-15 + BS 0.1٪قلم + 1٪ / بكتيريا).
- منبذة مخروطي مع خلايا توتر في 2500 إطار التعاون الإقليمي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
3. طلاء وصيانة مختلط زراعات الخلايا الغروية
- لكل دماغ الفئران الجرو معالجتها، وإعداد 1 T-75 قارورة معقمة وذلك بإضافة 12 مل من وسائل الإعلام ثقافة (DMEM + 10٪ + 1٪ FBS البنسلين / الستربتومايسين عقار) في كل قارورة.
- نضح طاف من الخلايا مكعبات وإضافة 5-6 مل من وسائل الإعلام ثقافة لبيليه الخلية. ماصة صعودا ونزولا 10 مرات مع ماصة 10 مل.
- نقل حجم مساو من التعليق على كل قارورة خلية T-75.
- احتضان القوارير في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 5٪ عند 37 درجة مئوية ليصبح المجموع 1-3 أسابيع.
- وينبغي أن قوارير حضنت 1 لمدة 5 أيام، و في اليوم الخامس، تحل محل وسائل الإعلام في ثقافة كل قارورة مع 12 مل من وسائل الإعلام الجديدة والعودة إلى الحاضنة. ثم، كل 3 أيام، تحل محل وسائل الإعلام مكيفة في كل قارورة مع 12 مل من وسائل الإعلام الجديدة لتحقيق التقاء. يجب أن يكون هذا فعلشمال شرق بعناية فائقة دون لمس الجزء السفلي من القوارير حيث الخلايا تعلق.
4. العزلة والتصفيحات من الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية
- بعد الثقافات الدبقية المختلطة هي متكدسة تماما، وإزالة قوارير من الحاضنة وتغطية مباراة دولية مع قارورة parafilm لمنع تبادل الغازات مع الهواء البيئية.
- هز قوارير في 100 RPS (معمل رفيق SI-600، Jeio تك) لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
- جمع وسائل الاعلام من كل قوارير مع ماصة 10 مل دون تعطيل طبقة نجمية على سطح القارورة. وضع وسائل الإعلام في أنابيب مخروطية 50 مل. إضافة وسائط جديدة للقوارير ودوارق العودة إلى الحاضنة.
- منبذة أنابيب مخروطية الشكل في 2500 إطار التعاون الإقليمي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نضح طاف من جميع الأنابيب المخروطية. الكريات الخلية مرتفعة الخلايا الدبقية الصغيرة نقاء. Resuspend الكريات في 1 مل من الخلايا الدبقية الصغيرة الطلاء وسائل الاعلام (FES DMEM + 10٪ + 1٪ البنسلين / الستربتومايسين عقار).
- حساب كثافة خلية في وسائل الإعلام باستخدام معلق1 عدادة الكريات.
- إضافة حجم مناسب من وسائل الإعلام تصفيح الخلايا الدبقية الصغيرة لتحقيق 2 × 10e5 الخلايا في كثافة مل. لوحة بالشكل المناسب لتحليل تجريبي.
- تسمح الخلايا الدبقية الصغيرة لنعلق بين عشية وضحاها.
5. ممثل النتائج
وصف بروتوكول أعلى نتائج في الثقافات نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية عالية. على النحو الذي يحدده المناعية لخلايا البلاعم علامة / الخلايا الدبقية الصغيرة الخاصة (Iba1)، مطلي الثقافات الخلايا الدبقية الصغيرة هي> نقي بنسبة 90٪ (الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك، وتلطيخ لعلامات خلية نجمية، oligodendrocyte والخلايا العصبية محدد يوضح الحد الأدنى من التلوث (الشكل 2). بعد تأسيس مختلط الثقافات الخلية الدبقية، يمكن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة التي تهز تصل إلى 4 مرات متتالية. وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية تعطي ما يقرب من 2.2 X 106 خلية / مل أو حوالي 9 ملايين الخلايا لكل 10 قوارير والعائد المتوقع يتناقص مع كل شاء المتعاقبةكه. وقد استخدمت الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بواسطة هذه الطريقة بنجاح لتحقيق القدرة البلعمة، وظيفة مثل انتاج اكسيد النتريك، والسمية العصبية (الشكل 3) 13-14.
الشكل 1. نظرة عامة على بروتوكول لإعداد مختلط الثقافات الخلية الدبقية وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية.
الشكل 2. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عالية النقاء النحو الذي تتحقق منه تحليل المناعى باستخدام الخلايا الدبقية الصغيرة (إيبا-1، الحمراء)، نجمية (GFAP والأخضر)، الخلايا العصبية (NeuN، أحمر) وoligodendrocyte (CC1، أحمر) بعلامات محددة. ويظهر أيضا لتلطيخ الحمض النووي للخلايا في ثقافة بواسطة دابي (الأزرق).
الشكل 3. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة في طريقة descriوقد استخدمت سرير في عدد من الفحوص، بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، فحوصات البلعمة، المقايسات وظيفة والدراسات العصبية. في هذه الدراسات، وجدنا أن الخلايا الدبقية الصغيرة (إيبا-1 إيجابي، والأخضر)، عند تعرضها للسيطرة على (A) أو LPS (B) وسائل الاعلام المعالجة، وزيادة البلعمة بهم من الخرز اللاتكس fluorescently المسمى (الحمراء)، التي يمكن قياسها كميا ( C). كذلك، يمكن أن LPS (1ng/ml) علاج زيادة انتاج اكسيد النيتريك في الخلايا الدبقية الصغيرة (D). أخيرا، عبر كل من transwell إدخالها وفصل أو مباشرة الثقافات الخلايا الدبقية الصغيرة، الخلايا العصبية، فقد وجدنا أن الخلايا الدبقية الصغيرة حضنت مع LPS يمكن أن تحفز الخلايا العصبية موت الخلايا التي تقاس الديهيدروجينيز اللاكتات (LDH) اطلاق سراح (E، F).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في حين يستخدم بصورة روتينية على هذا البروتوكول لإنتاج الخلايا الدبقية الصغيرة نقية وصحية للتجارب البحثية، وإمعان النظر في الجوانب الفنية خلال المراحل الحاسمة من الإجراء الحد من التقلبات في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة. الأول، أثناء تشريح أنسجة الدماغ من الفئران الوليدة حديثي الولادة، والعمل في الوقت المناسب أمر ضروري للحد من الأضرار الدماغية ونقص الأوكسجين للأنسجة. ومع ذلك، فمن المهم أيضا أن إزالة الغطاء سحائي من الدماغ خلال تشريح، لأن وجود السحايا سوف يسهم في تلوث الليفية كبي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
بتمويل من برنامج جماعية في جامعة الخدمات النظامية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| 60 مم × 15 مم أطباق بتري | فيشر العلامة التجارية | 0875713A | |
| مقص حاد تشريح | أدوات العلم غرامة | 14094-11 | |
| دومون # 7B ملقط القياسية نصائح، منحنية، 11cm | أدوات العلم غرامة | 11270-20 | |
| دومون # 5 ملقط القياسية نصائح، على التوالي، 11 سم | أدوات العلم غرامة | 11251-10 | |
| 50 مل من أنابيب الطرد المركزي مخروطي | VWR | 89039-656 | |
| 5 الماصات مل المصلية | جرينير بيو واحد | 606180 | |
| 10 مل الماصات المصلية | جرينير بيو واحد | 607180 | |
| 100 ميكرون خلية النايلون معقم مصفاة | صقر | 35-2360 | |
| 75 سم 2 قوارير زراعة الأنسجة | كورنينج | 430641 | |
| Dulbecco والمتوسطة الأساسية الدنيا (DMEM) | Gibco (إينفيتروجن) | 31053-028 | |
| ليبوفيتز لL-15 متوسطة | Gibco (إينفيتروجن) | 11415064 | |
| مصل بقري جنيني | Gibco (إينفيتروجن) | 16000-036 | |
| الجنين فرسي المصل | الصياد | SH3007402 | |
| البنسلين الستربتوميسين | Gibco (إينفيتروجن) | 15140163 | |
| 100٪ الإيثانول | شركة وارنر جراهام | 64-17-5 | |
| مخزنة فوسفات حل، 10X المالحة، ودرجة الحموضة 7.4 | جودة البيولوجي، المؤتمر الوطني العراقي. | 119-069-131 | 1X في الماء، ومعقم مقطر |
| أكياس واقية | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser العلمية | 1492 | |
| 6 كذلك لوحات ثقافة الخلية مع سطح cellBIND | كورنينج | 3335 |
المراجع
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17(2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
