1. خلفية
ويرد على البيوتين إلى السطح من هذه الأجهزة من خلال عملية بسيطة من ثلاث خطوات، (الشكل 1). أولا، علينا تنظيف السطح وملء مع مجموعات الهيدروكسيل من خلال تعريض الأجهزة إلى بلازما الأوكسجين أو حل سمكة البيرانا. الثانية، ونحن نستخدم ترسيب البخار تولي وكيل اقتران silane إنهاء مع الأمينات الأولية للمجموعات الهيدروكسيل من خلال رد فعل التحلل المائي والتكثيف. الثالثة، ونحن نعلق البيوتين إلى السطح عن طريق N-hydroxysuccinimide (NHS) كيمياء استر. نوجه القارئ المهتم في عملنا السابق لمزيد من المعلومات عن تطور هذه التقنيات، وكذلك شرحا لدينا الدافع لاختيار هذه التقنيات. 8
ويمكن تقييم نجاح هذه التفاعلات من خلال المجهر الضوئي ومضان بعد إضافة لأمين الابتدائية، وكذلك بعد إضافة البيوتين. بينما بصري مويمكن استخدام icroscopy لتحديد ما إذا البروتوكولات functionalization سطح أدى إلى الأضرار التي لحقت سطح microsphere، أو حتى التلوث، وتستخدم مضان المجهري للتحقق من جودة والتوحيد من تغطية سطح جزيء البيوتين، وكذلك قدرة على البيوتين السطح لربط مع (strept) أفيدين. لتقييم تغطية الأمينات على السطح، كنا فلوريسئين الفصيلة (FITC) صبغة الفلورسنت، والتي تتفاعل مع الأمينات الأولية لتشكيل مستقرة، والربط ثيويوريا التساهمية إلى microsphere. وتستخدم تكساس الاحمر صبغة الفلورسنت التي كانت مترافق إلى أفيدين لتسمية المجموعات البيوتين على السطح من خلال التفاعل البيوتين أفيدين. في كلتا الحالتين، تم اختيار الأصباغ التي يمكن أن تتفاعل (من خلال التفاعلات مستقبلات يجند أو الرابطة التساهمية) مع المجموعات الوظيفية على السطح.
هنا، وكيل اقتران silane، التي لديها ثلاث مجموعات وترك مجموعة واحدة وظيفية، ويوفر جسر الرهانوين سطح العضوية وغير العضوية جزيء التحقيق. وظيفة أمين الابتدائية يتفاعل كميا مع استرات NHS على شكل سندات أميد مستقر. في هذه الحالة، ونحن نستخدم جزيء التحقيق البيوتين الذي valeric سلسلة الجانب تم تعديل مع مجموعة استر NHS. واقعيا، لا يمكن تحقيق أي الجزيء الذي يمكن إضافة مجموعة استر NHS إلى السطح باستخدام البروتوكولات التالية. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه البروتوكولات هي عامة، ويمكن استخدامها لfunctionalize أي سطح جهاز السيليكا مع البيوتين.
التحدي الرئيسي مع هذه البروتوكولات ليست في الواقع في الكيمياء حد ذاته، بل في طريقة التعامل مع السيليكا المجهرية. يرجى ملاحظة أن، في جميع أنحاء البروتوكولات، وينبغي التعامل مع المجهرية بواسطة grapsing جذوعهم بخفة مع حادة ذات الرؤوس ملاقط. هذا يحافظ على ملاقط بعيدا عن المجهرية أنفسهم، ويسمح لسهولة النقل بين الخطوات. صممت خصيصا العديد من الخطوات في هذا البروتوكول دون التصدي لهذه الحقيقةأو.
2. Microsphere تلفيق
- بناء مساكن للتخزين المجهرية.
- باستخدام سكين exacto، قطع ¼ في قطعة سميكة من الورق المقوى إلى 1 في × 1 في مربع، وهذا الشريط على شريحة زجاجية بحجم عادي، ونعلق 1 في قسم من لاصق شفاف، مع أهدافها تلبية لتشكيل لفة ، على الورق المقوى.
- وهذا يخلق المنصة التي يمكن أن تكون مرتفعة في microsphere وعزله عن البيئة المحيطة بها، ويمنع الضرر على سطحها.
- باستخدام مقص، وقطع الباب 3 بوصة من الألياف البصرية من بكرة من الألياف البصرية.
- باستخدام متجرد من الألياف لا، نيك، تجريد طلاء واقية البوليمرية من 0.5 بوصة الأخيرة من نهاية قطعة قطع من الألياف، وترك مجرد نواة السيليكا. قم بتنظيف السطح من أي البوليمر المتبقي مع Kimwipe مع الميثانول بواسطة المسح برفق الألياف مع Kimwipe.
- باستخدام الألياف الساطور العارية، وتقليم نهاية جردت حتى السابعةفي حوالي 1 ملليمتر فقط من الألياف جردت يبقى على نهاية الألياف.
- وضع حد تجريده من الألياف البصرية في طريق ليزر CO 2، مع الحرص على محاذاة عموديا على الألياف مثل أن نهايته تجريد لأسفل.
- بدوره على ليزر CO 2، وتوجيهها إلى السطح في نهاية تجريده من الألياف البصرية. سوف تذوب في نهاية الليزر تجريده من الألياف في مجال استخدام الطاقة ما يقرب من 3.5٪ في 2 ثانية.
- باستخدام الملقط، بعناية فهم الجذعية (الجزء غير تجريده من الألياف البصرية) من microsphere. نعلق الجذعية للفة الشريط على السكن microsphere. ويمكن لشريحة زجاجية نفسها المخزنة في طبق بيتري. وهذا يسمح للتخزين الآمن للmicrosphere.
3. ملء السطح مع مجموعات الهيدروكسيل
- باستخدام حل سمكة البيرانا:
- في قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف، يعد حل سمكة البيرانا (70:30 بواسطة حجم دخن H 2 SO 4: H 2 O 2 (30٪ بالوزن)) وذلك بإضافة 5 مل من بيروكسيد الهيدروجين على القارورة، يليه بنسبة 11.6 مل من حمض الكبريتيك دخن. تنبيه: ارتداء أحمضة قفازات.
- نقل الشريحة الزجاجية، وعقد لا يقل عن 1 microsphere، إلى القارورة. يجب أن microsphere تكون على اتصال مع السائل، ولكن السائل لا ينبغي أن تلمس الورق المقوى. ضبط مستوى الصوت من الحل إذا لزم الأمر.
- إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وأدخلها في آخر قنينة بلاستيكية تحتوي على DDI H 2 O. السماح لعينات من الجلوس في حل لمدة 5 دقائق.
- إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، ووضعه في الفرن 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق حتى يجف السطح.
- باستخدام الأوكسجين علاج البلازما:
- نقل الشريحة الزجاجية التي تحتوي على واحد على الأقل microsphere إلى الأكسجين غرفة البلازما.
- ضبط ضغط الأكسجين إلى 200 mTorr، والقوة إلى 120 دبليو تعرض العينة إلى بلازما الأوكسجين عن 2 ميلnutes.
- إزالة شريحة زجاجية من غرفة البلازما.
4. ربط وكلاء اقتران silane إلى السطح
- وضع شريحة زجاجية، التي تحتوي على واحد على الأقل microsphere، في مجفف فراغ في غطاء الدخان.
- أيضا في غطاء محرك السيارة دخان، فتح وكيل اقتران silane زجاجة (في هذه الحالة، كان يستخدم aminopropyltrimethoxysilane (APTMS))، ووضع زجاجة افتتح في مجفف.
- استبدال غطاء على مجفف فراغ، وإرفاق المنفذ منفذ إلى الشافطة أو منزل خط فراغ.
- بدوره على فراغ منزل أو خط المياه، وإخلاء مجفف فراغ. بمجرد تشكيل ختم فراغ بين غطاء وقاعدة، تبدأ توقيت رد فعل. وهذه الودائع وكيل اقتران silane على السطح باعتبارها طبقة رقيقة.
- بعد 15 دقيقة، وإيقاف فراغ، وفتح الميناء ببطء للسماح للهواء في مجفف. لهذا وكيل اقتران، 15 دقيقة كافية لتشكيل unifoRM أحادي الطبقة على السطح. عن وكلاء اقتران أخرى، ربما يكون الوقت هناك حاجة الى تعديلها.
5. ربط البيوتين إلى السطح
- ما يقرب من ساعة واحدة قبل ربط البيوتين، ويعد حل 10 ملم من N-hydroxylsuccinimide البيوتين (NHS-البيوتين) في dimethylsulfoxide اللامائية (DMSO) في قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف.
- إذا كان قد تم تخزين NHS-البيوتين الباردة، وتسمح لها تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة قبل حشد من ذلك.
- يصوتن الحل لمدة 1 ساعة إلى حل بشكل كامل مسحوق NHS-البيوتين في المذيب.
- نقل الشريحة الزجاجية التي تحتوي على microsphere إلى آخر قنينة بلاستيكية، مع المجهرية في الجزء السفلي، وينطلق في الجزء العلوي من القارورة.
- نقل، وذلك باستخدام الماصة البلاستيكية، وحجم مناسب من الحل NHS-البيوتين أسفل الجانب من القارورة، وراء الشريحة الزجاجية (وبالتالي فإن الحل لا تلمس microsphere كما يتم إضافته إلى القارورة). ADD حل بما يكفي لتغطية سطح microsphere.
- ضع قارورة تحتوي الآن على المجهرية وNHS البيوتين في حل DMSO على حاضنة هزاز (علبة الخيمة) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع سرعة وزاوية الميل في الساعة 5 دورة في الدقيقة ودرجة 5 على التوالي.
- إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وحرك برفق إلى آخر قنينة مليئة 2 DDI O. H وضع قنينة على علبة الخيمة لمدة 10 دقيقة في نفس السرعة وزاوية الميل كما كان من قبل. كرر هذه الخطوة مرتين مع المياه العذبة في كل مرة. هذا يساعد على إزالة DMSO الزائدة من على سطح الأرض، ويزيل أي البيوتين بدنيا، كثف التي لم الكسب غير المشروع في الواقع إلى السطح.
- إزالة شريحة زجاجية من القارورة، ووضعه في الفرن على 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، أو حتى يتم إزالة جميع قطرات الماء من على سطح الأرض.
6. فلوري توسيم أمين منتهية السيليكا
- لتسمية المجموعات أمين الحالي بعد treatmوالأنف والحنجرة مع APTMS، وإعداد حل FITC في غرفة مظلمة عن طريق إذابة 1 ملغ FITC في 1 DMSO اللامائية مل.
- تمييع الحل في 6.1 بإضافة 50 ميكرولتر من الحل FITC إلى 1 مل من 0،1 M الصوديوم بيكربونات العازلة.
- وضع الحل في قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف، وحرك بلطف المجهرية أمين منتهية، يضم مرة أخرى على شريحة زجاجية، في قارورة.
- وضع قنينة في حمام الثلج، والسماح للعينة تتفاعل مع الحل FITC مدة لا تقل عن 4 ساعات في الظلام.
- إزالة fluorophore الزائدة من خلال اثنين من يشطف 10، دقيقة من المجهرية في عازلة كربونات الصوديوم. كما كان من قبل، وملء قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف مع المخزن المؤقت، وحرك بلطف الشريحة الزجاجية الى حل، مع الحرص على أن الحل لا يغطي سوى microsphere، وليس على السكن من الورق المقوى. تغطية قارورة مع رقائق الألومنيوم، ووضع قنينة على صينية الخيمة التي وضعت في 5 درجات، ودورة في الدقيقة 5، كما كان من قبل.
- إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وحرك برفق إلى آخر قنينة مليئة 2 DDI يا H ومغطاة بورق الألومنيوم. وضع قنينة على علبة الخيمة لمدة 10 دقيقة في نفس السرعة وزاوية الميل كما كان من قبل. كرر هذه الخطوة مرتين مع المياه العذبة في كل مرة. هذا يساعد على إزالة الصبغة الزائدة من على سطح الأرض.
- إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وجاف في فرن حدد في 80 م لمدة 10 دقائق قبل التصوير.
7. فلوري وضع العلامات من البيوتين منتهية السيليكا
- مخزنة يعد حل 10 ميكروغرام / مل من تكساس الأحمر أفيدين في الفوسفات المالحة.
- إضافة إلى حل قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف، وحرك بلطف الشريحة الزجاجية التي تحتوي على البيوتين microsphere منتهية إلى الحل، بحيث يتم تغطية سوى microsphere بواسطة الحل.
- رد فعل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- إزالة fluorophore الزائدة من خلال اثنين و 10 دقيقة شطفق من المجهرية في العازلة في برنامج تلفزيوني.
- كما كان من قبل، وملء قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف مع المخزن المؤقت، وحرك بلطف الشريحة الزجاجية الى حل، مع الحرص على أن الحل لا يغطي سوى microsphere، وليس على السكن من الورق المقوى.
- تغطية قارورة مع رقائق الألومنيوم، ووضع قنينة على صينية الخيمة التي وضعت في 5 درجات، ودورة في الدقيقة 5، كما كان من قبل.
- إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وحرك برفق إلى آخر قنينة مليئة 2 DDI يا H ومغطاة بورق الألومنيوم. وضع قنينة على علبة الخيمة لمدة 10 دقيقة في نفس السرعة وزاوية الميل كما كان من قبل. كرر هذه الخطوة مرتين مع المياه العذبة في كل مرة. هذا يساعد على إزالة الصبغة الزائدة من على سطح الأرض.
- إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وجاف في فرن وضعت في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل التصوير.
8. ممثل النتائج
functionalized بشكل صحيح microsphereويمكن تحديد الصورة من خلال المجهر الضوئي ومضان. إذا تتم functionalization سطح بشكل صحيح، فإنه ينبغي أن يؤدي إلى تغطية كثيفة بشكل موحد من جزيئات البيوتين على السطح، والسطح يجب أن يبقى عيب، وخالية من الملوثات بعد functionalization من أجل الحفاظ على الحساسيات العالية خلال التجارب التي كشف. ويمكن استخدام المجهر الضوئي للتحقيق في هذه الأخيرة، في حين فلوري المجهر يمكن تحقيق الجودة والاتساق في تغطية السطح. في الشكل 2، وتبين لنا أمثلة من المجهرية functionalized بشكل صحيح. هذه الصور تبين أنه لا يوجد أي ضرر أو تلوث سطح بسبب functionalization (الشكل 2A)، وتبين أن المجهرية موحد، والتغطية تتفق الجماعات أمين إما (الشكل 2B) أو مجموعات البيوتين (الشكل 2C) على السطح .
إذا لم يتم المجهرية functionalized بشكل صحيح، والصور الضوئية microsphere وايسوف يحمل تلوث السطح، وتغطية تكتل أو غير موحدة، والعيوب الواضحة في السطح، مثل الشقوق السطحية (الشكل 3). هنا، ونحن نرى من الأمثلة الشائعة من التلوث السطحي، والناجمة عن تكتل من الكواشف على السطح.

الشكل 1. 3-الخطوة رد فعل مخطط لربط جزيئات مسبار على سطح المجهرية السيليكا. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2. المجهرية السيليكا. 1 صورة مجهرية) بصري من microsphere السيليكا ملؤها مع مجموعات الهيدروكسيل عن طريق التعرض للبلازما الأوكسجين ب) مجهرية نيون من microsphere السيليكا ملؤها مع الأمينات الأولية وصفت مع صبغ FITC ج) صورة مجهرية نيون مي السيليكاcrosphere ملؤها مع البيوتين وصفت مع تكساس الأحمر أفيدين المتقارن. أعيد طبعها بإذن من Soteropulos، CE، هانت، هونج كونج وأرماني، صباحا تحديد حركية ملزم باستخدام يهمس microcavities وضع معرض. تطبيق ورقة. فيز. بادئة رسالة. 99، 103703-103703 (2011). حقوق الطبع والنشر 2011، المعهد الأمريكي للفيزياء (17).

الشكل 3. صورة مجهرية من المجال البصري functionalized بشكل غير صحيح. هنا، يمكنك ان ترى الغبار على سطح اعلى اليمين، فضلا عن تلوث تمتد من السطح. بالإضافة إلى ذلك، الجانب الأيمن من microsphere بصري يظهر و divot صغيرة على السطح.