يوصف ثقافة الخلية الدورية نظام يسمح الخلايا الظهارية في النمو في ظل الظروف الفسيولوجية الناتجة في 3 مد تشكيل مجموع الخلوية. ولدت المجاميع العرض في الجسم الحي مثل الخصائص التي لم تشاهد في نماذج الثقافة التقليدية، ويكون بمثابة نموذج نظام عضوي النمط أكثر دقة للعديد من التحقيقات العلمية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المستمدة زراعة والتطبيقات تناوب الحائط تفاعلات الاحيائية سفينة 3D نماذج الخلايا الظهارية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتعرض الخلايا والأنسجة في الجسم لظروف بيئية تؤثر على بنيتها، واتصالاتها البينية، ووظائفها العامة. ولكي تحاكي نماذج الزراعة الخلوية in vitro النسيج المستهدف بدقة، يعد بيئة نمو المزرعة جانبًا بالغ الأهمية يجب مراعاته. وتعمل أنظمة الزراعة الخلوية التقليدية الشائعة على تكثير الخلايا الظهارية على أسطح مسطحة غير نفاذة ثنائية الأبعاد (2-D). ورغم أنه تم تعلم الكثير من أنظمة الزراعة الخلوية التقليدية، إلا أن العديد من النتائج لا يمكن إعادة إنتاجها في التجارب السريرية البشرية أو المستنبتات النسيجية، ويرجع ذلك على الأرجح إلى غياب بيئة دقيقة ذات صلة فسيولوجيًا.
نصف هنا نظام استزراع يتجاوز العديد من قيود ظروف الاستزراع في مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد (2-D)، وذلك باستخدام تقنية المفاعل الحيوي المبتكرة بوعاء الجدار الدوار (RWV). لقد أثبتنا وأثبت آخرون أن النماذج المشتقة من الـ RWV والشبيهة بالأعضاء يمكنها محاكاة البنية والوظيفة والاستجابات البشرية الحقيقية للمؤثرات الخارجية بشكل مشابه للأنسجة البشرية المستأصلة 1-6. يُعد المفاعل الحيوي RWV نظام استزراع معلق يسمح بنمو الخلايا الظهارية تحت ظروف إجهاد قص سائلي فيزيولوجية منخفضة. يتوفر المفاعل الحيوي بتنسيقين مختلفين: وعاء دوار عالي النسبة الباعية (HARV) أو وعاء جانبي بطيء الدوران (STLV)، ويختلفان في مصدر التهوية. تُضاف الخلايا الظهارية إلى المفاعل الحيوي المختار بالتزامن مع حبيبات حاملة دقيقة مسامية مغطاة بالكولاجين (Figure 1A). وتستخدم الخلايا هذه الحبيبات كسقالة نمو أثناء السقوط الحر المستمر داخل المفاعل الحيوي (Figure 1B). تتيح البيئة الدقيقة التي يوفرها المفاعل الحيوي للخلايا تكوين تجمعات ثلاثية الأبعاد (3-D) تظهر خصائص شبيهة بما تكون عليه in vivo، والتي غالباً لا تُلاحظ في ظروف الاستزراع القياسية ثنائية الأبعاد (2-D) (Figure 1D). وتشمل هذه الخصائص الروابط المحكمة، وإنتاج المخاط، والتوجيه القمي/القاعدي، وتمركز البروتين in vivo، وخصائص إضافية محددة لنوع الخلايا الظهارية.
يختلف التدرج من طبقة أحادية من الخلايا الظهارية إلى تجمعات ثلاثية الأبعاد متمايزة تماماً بناءً على نوع الخلية1, 7-13. وتسمح عملية أخذ العينات الدورية من المفاعل الحيوي بمراقبة تكوين التجمعات الظهارية، وعلامات التمايز الخلوي، والحيوية (الشكل 1D). وبمجرد ترسيخ التمايز الخلوي وتكوين التجمعات، يتم حصاد الخلايا من المفاعل الحيوي، ويمكن تطبيق فحوصات مماثلة لتلك التي تُجرى على الخلايا ثنائية الأبعاد على التجمعات ثلاثية الأبعاد مع مراعاة بعض الاعتبارات (الشكل 1E-G). في هذا العمل، نصف الخطوات التفصيلية لكيفية زراعة تجمعات الخلايا الظهارية ثلاثية الأبعاد في نظام المفاعل الحيوي RWV ومجموعة متنوعة من الفحوصات والتحليلات المحتملة التي يمكن تنفيذها باستخدام التجمعات ثلاثية الأبعاد. وتشمل هذه التحليلات، على سبيل المثال لا الحصر، التحليل البنيوي/المورفولوجي (المجهر البؤري، والمجهر الإلكتروني الماسح والنافذ)، وإفراز السيتوكينات/الكيموكينات وتأشير الخلايا (تحليل مصفوفة الخرزات القياسية وتحليل لطخة ويسترن)، وتحليل التعبير الجيني (تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي)، والتحليل السمومي/الدوائي وتفاعلات المضيف والممرض. إن استخدام هذه الفحوصات يضع الأساس لدراسات أكثر عمقاً وتوسعاً مثل الميتابولوميات، والترانسكريبتوميات، والبروتيوميات وغيرها من التطبيقات القائمة على المصفوفات. هدفنا هو تقديم وسيلة غير تقليدية لزراعة الخلايا الظهارية البشرية لإنتاج نماذج ثلاثية الأبعاد نمطية عضوية تحاكي الأنسجة البشرية in vivo، وذلك ضمن نظام سهل ومتين يمكن استخدامه من قبل الباحثين ذوي الاهتمامات العلمية المتنوعة.
البروتوكول
يجب أن يتم تنفيذ كل الخطوات تحت BSL-2 الأوضاع في تدفق رقائقي غطاء محرك السيارة.
1. إعداد تفاعلات الاحيائية STLV
- تجميع مفاعل حيوي STLV وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وتنفيذ بروتوكول لضمان إزالة السموم عقم من مفاعل حيوي. تغطية المنافذ المفتوحة مع قبعات luer وملء STLV مع الايثانول 95٪ لمدة 24 ساعة.
- إزالة الإيثانول وملء STLV مع الماء المقطر المعقم لمدة 24 ساعة.
- كرر الخطوة 1.2 م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قد الاستفادة من تكنولوجيا مفاعل حيوي RWV المقدمة هنا توفر للباحثين لديها القدرة على دفع ثقافتهم خلية النظام الحالي لأكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة عضوي النمط ثقافة نموذج الخلية. الخلية مفاعل حيوي RWV نظام ثقافة يوفر المكروية القص المنخفض التي تمكن الخلايا لتشكيل المجاميع الخلوية 3-D في الجسم الحي مع مثل الخصائص، بما في ذلك منعطفات ضيقة، وإنتاج الميوسين، والعمليات خارج الخلية (أي زغيبات)، وقطبية الخلوية. غالبية البيانات والأمثلة المقدمة هنا تستخدم الخلايا الظهارية ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر بروك هيلم لخبرتها التقنية وأندرو لارسن لتحليل البروتين له. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من مؤسسة أبحاث التنمية البدائل (MMHK) غرانت والمعاهد الوطنية للصحة المعدية الأمراض المنقولة جنسيا ومضادات الجراثيم الموضعية التعاونية مركز البحوث IU19 AI062150-01 (MMHK). نحن الامتنان بيولوجيا التكاثر لإعادة استخدامها من الشخصيات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| اليكسا فلور 488 | إينفيتروجن | A21131 | يستخدم في تخفيف 1:500 |
| FACSDiva | دينار بحريني | تدفق عداد الكريات | |
| β-tublin الأضداد | Calbiochem | 654162 | يستخدم في تخفيف 1:5000 |
| الحيوي الصفيف 2000 | BioRad | 171-000205 | V5 البرمجيات |
| مفاعل حيوي ومكونات | Synthecon | المراكز المناخية الإقليمية-4 | |
| خلية مصفاة | دينار بحريني الصقر | 352340 | حجم المسام 40μm |
| مخروطي أنبوب (50mL) | كورنينج | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR | 48366067 | |
| مجموعات خلوى مجموعة خرزة | BioRad | الإنسان عدة مخصصة | |
| الخرز Cytodex | سيغما | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | سيغما | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic حامض |
| الأجسام المضادة المحددة الظهارية (ESA) | Chemicon | CBL251 | تستخدم في الساعة 1:50 تخفيف |
| الجنين المصل البقري (FBS) | Gibco | 10438 | المعطل الحرارة |
| حارف (نيكل) | Synthecon | D-405 | |
| حامض الهيدروكلوريك | سيغما | 258148 | 37٪ |
| Involucrin الأضداد | سيغما | أنا 9018 | |
| مجهر الشرائح | VWR | 16004-368 | |
| MTT الكاشف | النائب Biomedicals، ذ م م | 194592 | 3 - (4،5-Dimethylthiazolyl 1-2) بروميد Tetrazolium -2،5-ثنائي الفينيل |
| MUC1 الأجسام المضادة (المجهر) | سانتا كروز | SC-7313 | تستخدم في الساعة 1:50 تخفيف |
| MUC1 الأجسام المضادة (التدفق الخلوي) | دينار بحريني Pharmingen | 559774 | كما دعا CD227، استخدم 20μL لكل اختبار |
| بارافورمالدهيد | علوم المجهر الإلكتروني | 15710 | المخفف الى 4٪ في DPBS |
| طبق بيتري (صغير) | دينار بحريني الصقر | 353002 | |
| أنبوب البوليسترين مع فلتر | دينار بحريني الصقر | 352235 | |
| أنبوب تدفق البوليستيرين | دينار بحريني الصقر | 352058 | |
| العلاقات العامة الأضداد | DAKO | M3569 | يستخدم في تخفيف 1:100 |
| إطالة الذهب | إينفيتروجن | P36931 | تزايد وسائل الاعلام مع دابي |
| RNeasy البسيطة كيت | QIAGEN | 74903 | |
| الصوديوم دوديسيل كبريتات | سيغما | 71725 | |
| التعقيم الحقيبة | VWR | 11213-035 | |
| الصمامات (في اتجاه واحد) | MEDEX | MX5061L | |
| حقنة (10ML) | دينار بحريني | 309604 | Luer قفل غيض |
| حقنة (5mL) | دينار بحريني | 309603 | Luer قفل غيض |
| زرقة التريبان | إينفيتروجن | T10282 | |
| Vp5 الأضداد | سانتا كروز | SC-13525 | HSV-2 استنساخ الضد 6F10، وتستخدم في تخفيف 1:5000 |
المراجع
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
