الفحص تخليص الظهارية وصفها هنا يستفيد من خلايا fluorescently المسمى والوقت الفاصل بين الفحص المجهري لتصور فيديو وكميا قياس التفاعلات بين الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض المتعددة الخلايا الظهارية وmonolayers الخلية. طرازا هذا الفحص الخطوات في وقت مبكر من ورم خبيث سرطان المبيض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يُعد سرطان المبيض السبب الخامس الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في الولايات المتحدة1. وعلى الرغم من الاستجابة الأولية الإيجابية للعلاجات، فإن 70 إلى 90 بالمائة من النساء المصابات بسرطان المبيض يصبهن نقائل سرطانية جديدة، وغالباً ما يكون هذا التكرار مميتاً2. لذا، من الضروري فهم كيفية نشوء النقائل الثانوية من أجل تطوير علاجات أفضل لسرطان المبيض في المراحل المتوسطة والمتأخرة. تحدث نقائل سرطان المبيض عندما تنفصل الخلايا الخبيثة عن موقع الورم الأولي وتنتشر في جميع أنحاء التجويف البريتوني. ويمكن لهذه الخلايا المنتشرة أن تشكل تجمعات متعددة الخلايا، أو كرويات، والتي إما أن تظل غير ملتصقة، أو تزرع نفسها في الأعضاء الموجودة داخل التجويف البريتوني3 (الشكل 1، الفيديو 1).
تُبطن جميع الأعضاء الموجودة داخل التجويف البريتوني بطبقة واحدة مستمرة من الخلايا الميزوثيلية4-6 (الشكل 2). ومع ذلك، تغيب الخلايا الميزوثيلية من تحت الكتل الورمية البريتونية، كما كشفت دراسات الصور المجهرية الإلكترونية لمقاطع من أنسجة الأورام البشرية المستأصلة3,5-7 (الشكل 2). ويشير هذا إلى أن الخلايا الميزوثيلية تُستبعد من أسفل الكتلة الورمية عبر عملية غير معروفة.
أظهرت التجارب السابقة in vitro أن خلايا سرطان المبيض الأولية تلتصق بالمصفوفة خارج الخلوية بكفاءة أكبر من التصاقها بالخلايا الميزوثيلية8، وأظهرت دراسات أحدث أن الخلايا الميزوثيلية الصفاقية الأولية تشكل في الواقع حاجزاً أمام التصاق خلايا سرطان المبيض وغزوها (مقارنة بالالتصاق والغزو على ركائز غير مغطاة بالخلايا الميزوثيلية)9,10. وهذا يشير إلى أن الخلايا الميزوثيلية تعمل كحاجز ضد انتشار سرطان المبيض. أما الآليات الخلوية والجزيئية التي تخترق من خلالها خلايا سرطان المبيض هذا الحاجز وتزيح الميزوثيليوم، فقد ظلت غير معروفة حتى وقت قريب.
نصف هنا المنهجية الخاصة بمقايسة in vitro تحاكي التفاعل بين الكريات الخلوية لسرطان المبيض والخلايا الميزوثيلية in vivo (الشكل 3، الفيديو 2). تم تكييف البروتوكول الخاص بنا من طرق وُصفت سابقاً لتحليل تفاعلات خلايا أورام المبيض مع الطبقات أحادية الخلايا الميزوثيلية8-16، ووُصف لأول مرة في تقرير أظهر أن خلايا أورام المبيض تستخدم تنشيط الميوزين وقوة السحب المعتمدة على الإنتغرين لتعزيز استبعاد الخلايا الميزوثيلية من تحت الكرية الورمية17. يعتمد هذا النموذج على مجهر الفلورة بنظام التصوير الزمني لمراقبة المجموعتين الخلويتين في الوقت الفعلي، مما يوفر معلومات مكانية وزمنية حول هذا التفاعل. تعبر خلايا سرطان المبيض عن البروتين الفلوري الأحمر (RFP) بينما تعبر الخلايا الميزوثيلية عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP). تلتصق كريات خلايا سرطان المبيض التي تعبر عن RFP بالطبقة أحادية الخلايا الميزوثيلية التي تعبر عن GFP. تنتشر هذه الكريات وتغزو وتدفع الخلايا الميزوثيلية جانباً مما يؤدي إلى تكوين ثقب في الطبقة أحادية الخلايا. ويظهر هذا الثقب كفراغ سلبي (أسود) في صورة GFP. يمكن بعد ذلك قياس مساحة الثقب لتحليل الاختلافات في نشاط الإخلاء كمياً بين المجموعات الضابطة والتجريبية لخلايا سرطان المبيض و/أو الخلايا الميزوثيلية. لا تتطلب هذه المقايسة سوى عدد قليل من خلايا سرطان المبيض (100 خلية لكل كرية × 20-30 كرية لكل حالة)، لذا فمن الممكن إجراء هذه المقايسة باستخدام عينات ثمينة من الخلايا الورمية الأولية. علاوة على ذلك، يمكن تكييف هذه المقايسة بسهولة لغرض الفرز عالي الإنتاجية.
البروتوكول
1. المبيض خلية سرطان تشكيل الجسم الشبه الكروي
- تستزرع طلب تقديم العروض في التعبير عن خلايا سرطان المبيض في قاعدة متوسطة 10٪ (ثقافة الخلية المخصصة المتوسطة التي تحتوي على خليط 50:50 من 199 وMCDB105، المعطل الجنين بنسبة 10٪ مصل بقري و 1٪ من ركلة جزاء، بكتيريا). للتعبير عن طلب تقديم العروض في غير المسماة خلايا سرطان المبيض، transfect الخلايا مع طلب تقديم العروض 1 تحتوي على البلازميد وحدد لخلايا معربا عن طلب تقديم العروض. بدلا من ذلك، يمكن استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن عابر البروتينات الفلورية، أو خلايا يمكن أن تكون مرحلة ما قبل احتضان ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في "الفحص التخليص الظهارية" المعروضة هنا يستخدم الوقت الفاصل بين المجهري لرصد تفاعلات الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض المتعددة الخلايا والخلايا الظهارية monolayers، في رائعة من التفصيل المكاني والزماني. سابقا، كانت عدة مجموعات تستخدم 8-14 المقايسات نقطة النهاية لإظهار أن خلايا سرطان المبيض ونعلق على غزو الخلايا الظهارية في monolayers. هذا الفحص هو فريد من نوعه من حيث أنه يستخدم خلايا fluorescently المسمى لتمييز الخلايا السرطانية من الخلايا الظهارية، بحيث يم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا ما يكشف.
شكر وتقدير
نود أن نشكر التصوير نيكون المركز في كلية الطب بجامعة هارفارد، ووترز على وجه التحديد جينيفر، لارا Petrak والسلمون ويندي، لتدريب واستخدام المجاهر timelapse بهم. ونود أيضا أن نشكر روزا نج وبيسير أكيم لإجراء مناقشات ذات قيمة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة جرانت 5695837 (إلى م. Iwanicki) وGM064346 إلى JSB، عن طريق منحة من ميريام والدكتور شيلدون اديلسون زاي للبحوث الطبية مؤسسة (لJSB).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الكاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| OVCA433 خلايا سرطان المبيض | هدية من الدكتور دنيس سلامون | ||
| ZT الخلايا الظهارية | هدية من الدكتور تان اينس | ||
| متوسط 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | خلية تطبيقات شركة | 117-500 | |
| FBS حرارة المعطل | Gibco | 10082 | |
| القلم بكتيريا | Gibco | 15070 | |
| 96 لوحات جيدة | كورنينج Costar | 3799 | |
| هيدروكسي إيثيل ميثاكريليت (بولي HEMA) | سيجما ألدريتش | 192066-25G | لبولي HEMA حل حل 6mg بولي HEMA مسحوق في 1ml من EtOH 95٪ |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | تمييع إلى 95٪ في DH 2 0 |
| خلية ثقافة غطاء محرك السيارة | Nuaire | NU-425-300 | |
| نسيج الثقافة الحاضنة | الحرارية العلمية | 3110 | |
| حاضنة للبولي HEMA لوحات | آلات Labline | الامبراطورية الثالث 305 | |
| منضدية الطرد المركزي | هيراوس | 75003429/01 | |
| 6 كذلك الزجاج قاع طبق | ماتيك كورب. | P06G-1.5-20-F | |
| فبرونيكتين | سيغما | F1141-1MG | |
| برنامج تلفزيوني | Cellgro | 21-040-CV | |
| Timelapse المجهر: | |||
| مجهر | نيكون | TI-E بمحركات الإسفار معكوس الوقت الفاصل بين مجهر المتكاملة مع نظام التركيز مثالي | |
| عدسة | نيكون | 20X-0.75 apeture العددية | |
| الهالوجين transilluminator | نيكون | 0.52 NA مسافة العمل الطويلة مكثف | |
| الإثارة وانبعاث مرشحات | صفاء مرشحات مرور واحد في السكن نيكون | GFP تحويلة 480/40، إم 525/50 RFP-mCherry تحويلة 575/50 إم 640/50 | |
| أحال وEpifluoresce مسار الضوء | سوتر | ذكي مصاريع | |
| خطي ترميز مرحلة بمحركات | نيكون | ||
| كاميرا جهاز تبريد مشحونة، بالإضافة | هاماماتسو | ORCA-AG | |
| مجهر غرفة حضانة مع تحكم في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 | مبنية خصيصا | ||
| اهتزاز العزلة طاولة | TMC | ||
| شيكل، عناصر البرنامج | نيكون | الإصدار 3 |
المراجع
- Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. Available from: http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005 (2007).
- Burleson, K. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
