الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي في الموقع التهجين

Phillip George; Maria V. Sharakhova; Igor V. Sharakhov

doi:10.3791/4007

مقالة منهجية

الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي في الموقع التهجين

DOI:

10.3791/4007

⸱

يونيو 28, 2012

Phillip George¹ , Maria V. Sharakhova¹ , Igor V. Sharakhov¹

¹Department of Entomology, Virginia Tech

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عادة ما تكون مجموعات الجينوم

تجميعات الجينوم القائمة على تقنيات تسلسل الحمض النووي المتوازية بشكل كبير مجزأة للغاية. يمكن أن يؤدي تطوير خرائط الكروموسوم الفيزيائية إلى تحسين تجميعات الجينوم. هنا ، نعرض طرقا مبتكرة لإعداد الكروموسوم ، والتهجين الفلوري في الموقع ، والتصوير الذي يزيد بشكل كبير من إنتاجية تطوير الخريطة المادية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المتوقع أن تتم مشاريع للحصول على تسلسل الجينوم الكامل ل 10,000 نوع من الفقاريات¹ و 5,000 من أنواع الحشرات والمفصليات ذات الصلة² على مدى السنوات الخمس المقبلة. على سبيل المثال ، يتم حاليا تسلسل الجينوم ل 15 نوعا من بعوض الملاريا باستخدام منصة Illumina^3،4. تشمل مجموعة أنواع الأنوفيليس هذه كلا من نواقل الملاريا وغير ناقلة. عندما تصبح تجميعات الجينوم متاحة ، ستتاح للباحثين فرصة فريدة لإجراء تحليل مقارن لاستنتاج التغييرات التطورية ذات الصلة بقدرة المتجه. ومع ذلك ، فقد ثبت أنه من الصعب استخدام قراءات تسلسل الجيل التالي لإنشاء تجميعات جينوم دي نوفو عالية^{الجودة 5}. علاوة على ذلك ، فإن تجميعات الجينوم الموجودة ل Anopheles gambiae ، على الرغم من الحصول عليها باستخدام طريقة Sanger ، هي فجوة أو مجزأة^4،6.

سيكون نجاح التحليلات الجينومية المقارنة محدودا إذا تعامل الباحثون مع العديد من contigs التسلسل ، بدلا من تجميعات الجينوم القائمة على الكروموسوم. تخلق التسلسلات المجزأة غير المعينة مشاكل للتحليلات الجينومية للأسباب التالية: (أنا) تتسبب الفجوات غير المحددة في تعليق توضيحي غير صحيح أو غير مكتمل للتسلسلات الجينومية. (2) تؤدي التسلسلات غير المعينة إلى الخلط بين الجينات والجينات المبارقة من أنماط فردانية مختلفة ؛ و (ثالثا) لا يسمح عدم وجود تخصيص للكروموسوم وتوجيه contigs التسلسل بإعادة بناء نسالة إعادة الترتيب ودراسة تطور الكروموسومات. يعد تطوير خرائط فيزيائية عالية الدقة للأنواع ذات الجينومات المتسلسلة حديثا استثمارا في الوقت المناسب وفعال من حيث التكلفة من شأنه تسهيل التعليق التوضيحي للجينوم والتحليل التطوري وإعادة تسلسل الجينومات الفردية من التجمعات الطبيعية^7،8.

هنا ، نقدم طرقا مبتكرة لتحضير الكروموسوم ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، والتصوير الذي يسهل التطوير السريع للخرائط المادية. باستخدام An. gambiae كمثال ، نوضح أن تطوير خرائط الكروموسوم الفيزيائية يمكن أن يحسن تجميعات الجينوم ، وبالتالي جودة التحليلات الجينومية. أولا ، نستخدم طريقة الضغط العالي لتحضير انتشارات كروموسوم البوليتين. تسمح هذه الطريقة ، التي تم تطويرها في الأصل ل ذبابة الفاكهة⁹ ، للمستخدم بتصور المزيد من التفاصيل حول الكروموسومات أكثر من تقنية السحق العادية¹⁰. ثانيا ، يتم استخدام نظام أمامي مؤتمت بالكامل ل FISH لرسم خرائط الجينوم الفيزيائي عالي الإنتاجية. يقوم نظام تلطيخ الشرائح الآلي بإجراء فحوصات متعددة في وقت واحد ويقلل بشكل كبير من وقت التدريب^{العملي 11}. ثالثا ، يقوم نظام التصوير الفلوري الأوتوماتيكي ، الذي يتضمن مرحلة انزلاق آلية ، تلقائيا بمسح وتصوير الكروموسومات المسماة بعد FISH¹². هذا النظام مفيد بشكل خاص لتحديد وتصور لوحات كروموسومية متعددة على نفس الشريحة. بالإضافة إلى ذلك ، تلتقط عملية المسح نتيجة FISH أكثر اتساقا. بشكل عام ، يعد بروتوكول رسم الخرائط المادي الآلي عالي الإنتاجية أكثر كفاءة من البروتوكول اليدوي القياسي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فئة

1. تحضير كروموسوم البوليتين عالي الضغط من خلايا ممرضة المبيض

قم بتشريح إناث الأنوفيليس نصف الحمل بعد 25 ساعة من الرضاعة بالدم تحت مجهر تشريح وإصلاح المبايض في محلول كارنوي المعدل حديثا بالميثانول (100٪ ميثانول: حمض الخليك الجليدي ، 3: 1). في هذه المرحلة ، يكون المبيضان في مرحلة كريستوفر الثالثة من التطور عندما يكون للبصيلات شكل بيضاوي ومنطقة شفافة بها خلايا ممرضة داخل البصيلات يكون لها شكل دائري¹³. ضع المبايض من خمس إناث تقريبا في 500 ميكرولتر من محلول كارنوي المعدل في أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. نقل المبايض إلى -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
قم بإعداد محلول كارنوي المعدل بالإيثانول (100٪ إيثانول: حمض الخليك الجليدي ، 3: 1) و 50٪ حمض البروبيونيك قبل عمل الشرائح. ضع زوجا واحدا من المبايض على شريحة خالية من الغبار في قطرة واحدة من محلول كارنوي المعدل. قم بتقسيم المبايض إلى حوالي 6 أقسام باستخدام إبر تشريح وضعها في قطرات من حمض البروبيونيك بنسبة 50٪ على شرائح نظيفة تحت مجهر مجهر مجسم MZ6 Leica. استخدم شريحة منفصلة لكل قسم.
افصل البصيلات التي يتم تشريحها باستخدام الإبر وامسح الأنسجة المتبقية بورق ترشيح أو منشفة ورقية تحت مجهر التشريح. أضف قطرة جديدة من حمض البروبيونيك بنسبة 50٪ إلى البصيلات واتركها لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع غطاء فوق قطرة حمض البروبيونيك بنسبة 50٪. دع الشريحة تقف لمدة 1 دقيقة تقريبا.
لف الشريحة بورق الترشيح والبلاستيك. باستخدام أداة دوارة Dremel 200 مع ملحق Flex-Shaft وطرف بلاستيكي ناعم بين 3000-5000 دورة في الدقيقة ، عبر عن البصيلات عن طريق تدوير الطرف في دوائر والضغط برفق على الغطاء لتوزيع النوى بالتساوي. يجب أن تستغرق هذه الخطوة حوالي 1 دقيقة. تحقق من جودة السبريد باستخدام مجهر Olympus CX41 Phase باستخدام هدف 20x.
قم بإعداد شطيرة عن طريق وضع غطاء إضافي بجوار الغطاء الذي يغطي الكروموسومات ، وقم بتغطيتها بشريحة مجهرية ثانية. هذا يقلل من فرصة سحق الشريحة في الملزمة. لف الشرائح بورقة بلاستيكية تأتي في حاويات منزلقة زجاجية وورق ترشيح لتثبيت الساندويتش ولحماية الشريحة من الخدش بسبب الملزمة.
اضغط على الشرائح عبر ملزمة ميكانيكية. ضغط 85-120 بوصة رطل كاف ويتم تحقيقه باستخدام مفتاح عزم الدوران. هذه الخطوة ضرورية لتسطيح الكروموسومات قدر الإمكان.
قم بإزالة شريحة المجهر الثانية والغطاء الإضافي. قم بتسخين الشريحة مع غطاء يغطي الكروموسومات إلى 55 درجة مئوية على نظام تمسخ / تهجين منزلق لمدة 10-15 دقيقة لتسطيح الكروموسومات بشكل أكبر. اغمس الشريحة في النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية على الأقل ، وعندما تتوقف الفقاعات ، استمر في إزالة الغطاء بسرعة بشفرة حلاقة. ضع الشرائح على الفور في الإيثانول البارد بنسبة 50٪ لمدة 5 دقائق. تجفيف الشرائح في 70٪ ، 90٪ ، 100٪ إيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما. شرائح جافة في الهواء.

< p class = "jove_title" >2. FISH باستخدام نظام تلطيخ الشرائح الآلي تم إعداد برنامج

مع نظام تلطيخ الشرائح الآلي Xmatrx لتشغيل الخطوات التالية ، باستثناء وضع العلامات على المسبار. تم وصف بروتوكول وضع العلامات التفصيلي على ترجمة النيك في الوثائق المقدمة مع بوليميراز الحمض النووي من Fermentas.

قبل FISH ، قم بإعداد مجسات الفلورسنت عن طريق تسمية الحمض النووي الجيني BAC باستخدام فلوروكروم باستخدام بروتوكول ترجمة النك. امزج 1 ميكروغرام من الحمض النووي ، و 0.05 ملي مولار لكل من dATP ، و dCTP ، و dGTP غير المسمى و 0.015 ملي مولار dTTP ، و 1 ميكرولتر Cy3- أو Cy5-dUTP ، و 0.05 مجم / مل BSA ، و 5 ميكرولتر من 10x المخزن المؤقت لترجمة النك ، و 20 وحدة من بوليميراز الحمض النووي I ، و 0.0012 وحدة من DNase I ، والماء الخالي من النوكلياز إلى 25 ميكرولتر. يتم اختيار نسبة بوليميراز الحمض النووي I / DNase I تجريبيا للحصول على مجسات يتراوح حجمها من 300 إلى 500 نقطة أساس. احتضن المزيج عند 15 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
ضع الشرائح والكواشف في نظام تلطيخ الشرائح الآلي Xmatrx وابدأ البرنامج لتشغيل الخطوات التالية. ضع 800 ميكرولتر من 1x PBS لمدة 20 دقيقة. انفخ الشرائح بالهواء. قم بإجراء تثبيت الفورمالين عن طريق تطبيق 450 ميكرولتر من 4٪ فورمالين في 1x PBS لمدة دقيقة واحدة متبوعا بغسل بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة ثانية واحدة مرتين ولمدة دقيقتين مرة واحدة. انفخ الشرائح بالهواء.
ينزلق الحرارة عند 45 درجة مئوية لمدة دقيقتين لتجنب الفقاعات عند تطبيق المجسات. ضع 20 ميكرولتر من مجسات الحمض النووي ، وأضف قطرات من الزيت المعدني لتجنب تبخر محلول التهجين ، وضع غطاء في الأعلى. قم بتفكيك الكروموسومات ومجسات الحمض النووي عن طريق تسخين الشرائح عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
للتهجين ، احتضان الشرائح عند 42 درجة مئوية لمدة 14 ساعة مع غطاء أغطية. يتكون محلول التهجين من 2x SSC ، و 100 ملي مولار فوسفات الصوديوم ، و 1x محلول Denhardt ، و 100 ميكروغرام / مل من أزيد الصوديوم ، و 10٪ كبريتات ديكستران في الفورماميد.
للغسيل الصارم ، قم بتسخين الشرائح عند 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، وقم بإزالة أغطية الغطاء ، واغسل الشرائح في 2x SSC لمدة 1 ثانية 4 مرات. انفخ الشرائح بالهواء. ضع 800 ميكرولتر من 0.4x SSC عند 42 درجة مئوية لمدة 10 دقائق 2 مرات. اغسل الشرائح في 2x SSC عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
قم بإجراء تلطيخ الكروموسوم عن طريق تطبيق 50 ميكرولتر من 1 ميكرومتر YOYO-1 في 1x PBS. ضع قطرات من الزيت المعدني لتجنب تبخر محلول التلوين ، وضعي أغطية ، وحتضنيها عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة أغطية الغطاء، واغسل الشرائح في 2x SSC لمدة 1 ثانية 4 مرات. انفخ الشرائح بالهواء. ضع 15 ميكرولتر من كاشف ProLong Gold المضاد للبهتان. ارتدي أغطية.

3. قراءة الشرائح باستخدام نظام التصوير الفلوري التلقائي

يوضح هذا القسم تفاصيل استخدام برنامج Duet، الذي يأتي بشكل قياسي مع نظام المسح الآلي ACCORD PLUS. تبدأ التعليمات بعد التشغيل بهذا الترتيب: مصدر طاقة Olympus U-RFL-T لمبة هالوجين ، كمبيوتر Dell precision T3500 ، مجهر أوليمبوس BX61 مع كاميرا متصلة Olympus U-CMAD3.

لإعداد 10x Pre-Scan، افتح برنامج Duet في نظام المسح الآلي ACCORD PLUS. انقر فوق الزر "عبر الإنترنت". أدخل معرف حالة جديد وقم بتعيين معرف شريحة. انقر فوق النقطة المسماة "BF". هذا هو خيار brightfield. قم بتعيين خيار المسح الضوئي إلى "10x Prescan". استخدم "دائرة 2500x" أو "دائرة 10000x" أو "مستطيل". انقر فوق "ضبط وتشغيل" للمسح المسبق 10x.
انقر فوق الزر "موافق" لتشغيل 10x Pre-Scan. اتبع التعليمات لضبط المسح الضوئي بشكل صحيح. انقر فوق "إنهاء" لبدء الفحص. اضغط على علامة التبويب "رئيسي" للعودة إلى الشاشة الرئيسية. انقر فوق الزر "غير متصل". ابحث عن معرف الحالة ومعرف الشريحة الذي تم تعيينه وانقر على "المسح دون اتصال". في المربع الأسود في الجزء العلوي الأيسر ، انقر فوق سهم وحدد "10x Prescan". باستخدام الأسهم (< || Δ > المعروف أيضا باسم أزرار "الرجوع" و "الإيقاف المؤقت" و "التشغيل" و "الأمام") ، انتقل إلى الصور الممسوحة ضوئيا.
بعد العثور على صورة مثيرة للاهتمام ، انقر نقرا مزدوجا على الشاشة في منتصف المنطقة المستهدفة واضغط على "Snap". سيستهدف هذا صورة ليتم التقاطها لاحقا. بعد تحديد جميع الأهداف ، انقر فوق "تصنيف". حدد "10x Prescan". انقر بزر الماوس الأيمن فوق صورة واحصل على فرصة لتصنيف الصور. حدد "Polytene".
قم بإعداد 40x Pre-Scan في برنامج Duet. انقر فوق "رئيسي" للعودة إلى القائمة الرئيسية. حدد "متصل" مرة أخرى. حدد شريحة. قم بتغيير "BF" إلى "FL". قم بتغيير اسم المهمة إلى "إعادة المراجعة-X40-RG". قم بتغيير القسم أسفل الإعداد الأخير مباشرة إلى "إعادة الزيارة بالكل". انقر فوق "تعيين وتشغيل". اضغط على "موافق". اتبع المطالبات مرة أخرى لإعداد التشغيل التلقائي. انقر فوق الزر "بدء مطابقة طرق العرض" لمطابقة الصور بمعدل 10x و 40x. انقر فوق "إنهاء" لبدء الفحص. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقر فوق "تصنيف" وانظر إلى الصور.

4. النتائج التمثيلية

يوضح الشكل 1 بيانيا مخطط تحضير الكروموسوم عالي الضغط. تتضمن هذه الخطوة عملية سحق الكروموسومات وتسطيحها باستخدام أداة Dremel والملزمة الميكانيكية ، بالإضافة إلى تصور الكروموسوم باستخدام مجهر تباين الطور. يوضح الشكل 2 تهجين مسبار مصنف بالفلورسنت لاستهداف الحمض النووي على مستحضرات شريحة الكروموسوم باستخدام نظام تلطيخ منزلق آلي ، واستخدام مجهر مسح آلي لتصور ورسم خرائط المجسات بعد تجربة FISH ، ووضع السقالات الجينومية وتوجيهها على الكروموسومات.

مستحضرات كروموسومات البوليتين لخلايا الممرضة المبيضية من إناث An. تم إجراء gambiae باستخدام تقنية الضغط العالي. هذه الطريقة لا تلحق الضرر أو تغير معظم بنية الكروموسوم (الشكل 3). إنه يسطح الكروموسومات المنحنية ، وبالتالي يكشف عن شرائط دقيقة مخفية لا ترى في الاستعدادات المنتظمة (الشكل 4).

المجسات المستخدمة في هذا البروتوكول هي استنساخ BAC DNA الجينومية التي تم الحصول عليها من مكتبة ND-TAM BAC التي تم إنشاؤها من An. gambiae PEST سلالة الحمض النووي. تم استخراج الحمض النووي الجيني لهذه المكتبة من يرقات الطور الأول التي فقست حديثا من كلا الجنسين. يوضح الشكل 5 نتائج FISH باستخدام استنساخ BAC المهجنة إلى كروموسومات البوليتين من An. gambiae. تم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام نظام تلطيخ الشرائح الآلي Xmatrx. باستخدام خريطة ضوئية وراثية خلوية ل An. gambiae¹⁰ ، تم توطين اثنين من استنساخ BAC ، 102B24 (GenBank: BH372701 ، BH372694) و BAC 142O19 (GenBank: BH368703 ، BH368698) ، في التقسيمات الفرعية 16C و 16D من ذراع 2R ، على التوالي. ومع ذلك ، فإن بحث BLAST مقابل An. gambiae PEST سلالة AgamP3 المجموعة ¹⁴ حدد التسلسلات المتماثلة مع 102B24 و 142O19 في التقسيمات الفرعية 16B و 17A من ذراع 2R ، على التوالي (الجدول 1). لذلك ، يمكن الآن تعديل المراسلات بين الإحداثيات الجينومية والتقسيمات الفرعية الوراثية الخلوية وفقا لبيانات الخرائط الخاصة بنا. بحث BLAST مقابل An. وجدت تجميعات الجينوم من شكل M. و S أن استنساخ BAC يقعان في contigs مختلفة ، ولكن في نفس السقالات داخل كل نموذج (الجدول 1). يمكن الآن ربط contigs المحددة بمواقع كروموسومية محددة. علاوة على ذلك ، يمكن الآن توجيه السقالات المحددة بشكل صحيح ضمن التقسيمات الفرعية الخلوية 16CD. ومن المثير للاهتمام أن المسافات بين تسلسلات 102B24 و 142O19 في السقالات هي 1،892،981 نقطة أساس ، و 1،658،391 نقطة أساس ، و 1،688،426 نقطة أساس في سلالة PEST ، وشكل M ، و S-form ، على التوالي. نظرا لأن سلالة PEST عبارة عن هجين بين الشكلين M و S ، فمن المحتمل أن يكون هذا الاختلاف بسبب التجميع غير الصحيح لجينوم PEST.

بكالوريوس
(انضمام) سلالة الآفات
AgamP3
< / > احداثيات M-form
contigs
< / > احداثيات M-form
السقالات
< / > احداثيات شكل S
contigs
< / > احداثيات شكل S
السقالات
< / > احداثيات 102B24
(BH372694) 2R: AAAB0100
8844_26 (16 ب) < / > < / > 43,681,342-
43,681,874 ABKP020247
53.1< / > < / > 32,513-
33,045 ريال EQ090167.1< / > < / > 1,858,377-
1,858,909 ABKQ010123
32.1
< / > 4,299-< /> 4,832 EQ099711.1
< / > 215,891-
216,424 102B24
(BH372701) 2R: AAAB0100
8844_28 (16 ب) < / > < / > 43,788,213-
43,788,969 ABKP020247
51.1< / > < / > 24,816-< /> 25,575 EQ090167.1,< / > < / > 1,772,683-
1,773,442 ABKQ010123
35.1< / > < / > 27,782-
28,540 EQ099711.1,< / > < / > 305,514-< /> 306,272 ريال 142O19
(BH368698) 2R: AAAB0100
< / > 8805_5 (17 أ) < / > 45,428,580-
45,429,264 ABKP020247
01.1< / > < / > 2,499-
3,185 EQ090167.1< / > < / > 315,806-
316,492 ريال ABKQ010123
76.1< / > < / > 49,242-
49,942 EQ099711.1
< / > 1,791,625-
1,792,325 142O19
(BH368703) 2R: AAAB0100
8805_8 (17 أ) < / > < / > 45,560,099-
45,574,323 ABKP020220
17.1< / > < / > 30,971-< /> 32,469 EQ090167.1< / > 200,518-< / > 202,016 ريال ABKQ010123
79.1< / > < / > 27,760-
28,508 ريال EQ099711.1
< / > 1,903,569-
1,904,317 < p class = "jove_content" > الجدول 1. نتائج BLAST لتسلسلات نهاية BAC مقابل تجميعات الجينوم ل An. gambiae.

figure-protocol-1
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لإعداد الكروموسوم عالي الضغط. تظهر مبيض البعوض في المرحلة الصحيحة من التطور.

< p class = "jove_content" > figure-protocol-2

الشكل 2. مخطط يمثل FISH الآلي ، ومسح الشرائح ، ورسم خرائط الكروموسومات للسقالات الجينومية

figure-protocol-3
الشكل 3. انتشار كروموسوم البوليتين 3 من An. gambiae تم الحصول عليه باستخدام تقنية الضغط العالي. 3L و 3R يحددان الذراعين الأيمن والأيسر عند التيلوميرات. يشير الرقم الهيدروجيني و IH إلى الكروماتين المتغاير حول المركز وبين الكروماتين ، على التوالي.

figure-protocol-4
الشكل 4. مقارنة بين An. gambiae polytene كروموسومات المحضرة باستخدام التقنية التقليدية (العلوي) والضغط العالي (السفلي). يغطي الصور تقسيمات فرعية 29A-30E من سلاح 3R (A) و 43D-46D من سلاح 3L (B).

figure-protocol-5
الشكل 5. أسماك استنساخ BAC إلى كروموسومات البوليتين من An. gambiae. أ) تهجين 102B24 (إشارة حمراء) بذراع 2R. ب) سمكة ثنائية اللون من 102B24 (إشارة حمراء) و 142O19 (إشارة زرقاء) إلى التقسيمات الفرعية 16C و 16D من ذراع 2R الممتد ، على التوالي. تشير الأسهم إلى إشارات تهجين استنساخ BAC المسمى ب Cy3 (أحمر) و Cy5 (أزرق). ج- المنطقة الوسطى. يظهر a / + انعكاس 2La المتغاير الزيجوت. تم تلطيخ الكروموسومات بالفلوروفور YOYO-1.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوة الأكثر أهمية في إجراء الضغط العالي هي السحق السليم لخلايا ممرضة المبيض المعزولة في المرحلة الثالثة من نمو المبيض¹³. يمكن أن يؤدي السحق غير السليم إلى انتشار الكروموسومات بشكل غير كاف ، مما قد يسبب مشاكل عند محاولة تحديد مواقع المسبار بعد FISH. إذا تم سحق الكروموسومات بشكل مفرط ، فيمكن أن تصبح مكسورة أو ممدودة لدرجة فقدان أنماط النطاقات. يجب أن يؤدي إنتاج شرائح متعددة إلى الاتساق عند محاولة سحق الشرائح باستخدام أداة Dremel ، مما سيزيد من كفاءة إنتاج الشرائح الإجمالية. تم تطوير تقنية الضغط العالي لأول مرة للغدد اللعابية المعزولة حديثا من D. melanogaster⁹. ومع ذلك ، يتم حفظ مبيض البعوض بشكل روتيني في محلول كارنوي المثبت المعدل (3 ميثانول: 1 حمض الخليك الجليدي من حيث الحجم) قبل استخدامها في مستحضرات الكروموسومات. لذلك ، قمنا بتعديل بروتوكول الضغط العالي الحالي لجعله مناسبا لكروموسومات البوليتين لخلية الممرضة الممرضة الثابتة لبعوض الملاريا An. gambiae. نظرا لأن الضغط العالي يتم تطبيقه باستخدام ملزمة دقيقة تمتلك سطح عمل متوازي للغاية للشريحة بأكملها ، فإن تحضير القرع الكروموسوم يستغرق وقتا أقل بكثير من استخدام تقنية التنصت التقليدية باستخدام ممحاة قلم رصاص.

تشمل الخطوات المهمة الأخرى نقع البصيلات بشكل كاف في حمض البروبيونيك بنسبة 50٪ وتسخين الشريحة. كلتا الخطوتين ضروريتان للمساعدة في تسطيح الكروموسومات. إذا تم إهمالها ، يمكن أن تظهر الكروموسومات لامعة بعد الجفاف ، مما قد يؤدي إلى وفرة مفرطة من الخلفية يمكن الخلط بينها وبين إشارة في FISH. تعمل تقنية التكسير عالي الضغط أيضا بشكل جيد باستخدام نفس المحاليل عند صنع مستحضرات الكروموسوم الانقسامي. يساعد الانتشار والتسطيح الإضافي على التعبير عن الكروموسومات بشكل أفضل من نواتها. يجب أن تؤدي إضافة ضغط متساو إلى تسطيحها وفقا لذلك للسماح بالقياسات وربما دقة أفضل للعصابات المرئية من التلوين. التفاصيل حول عزل الكروموسومات الانقسامية عن البعوض مذكورة في مكان آخر¹⁵. على الرغم من أن مستحضرات القرع المنتظمة كافية للعديد من الأغراض بما في ذلك FISH ¹⁶ و Immunonostaining¹⁷ ، إلا أن طريقة الضغط العالي لا تقلل فقط من التباين المحتمل من شريحة إلى أخرى ، ولكنها تزيد أيضا من جودة الكروموسوم الإجمالية ، مما يؤدي إلى تفاصيل أعلى عند رسم خرائط الكروموسومات. يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لإعداد شرائح غشاء كروموسوم البوليتين للتشريح المجهري لالتقاط الليزر.

تشمل القيود المفروضة على طريقة الضغط العالي كسر الشريحة وتمدد الكروموسومات بشكل مفرط. من الممكن حدوث كسر الشريحة الناجم عن وضع الكثير من الضغط على الشريحة عبر الملزمة ، ولكنه محدود باستخدام الضغوط الموضحة في المقالة. بالنسبة للتمدد المفرط للكروموسومات ، إذا تم تطبيق أداة Dremel على الشريحة لفترة طويلة من الزمن ، فهناك احتمال أن تصبح الكروموسومات ممتدة للغاية وتفقد الدقة. يمكن علاج ذلك عن طريق تطبيق الأداة لفترة وجيزة من الزمن ، والفحص تحت المجهر ، وتطبيق المزيد من الوقت باستخدام أداة Dremel إذا كانت الكروموسومات غير منتشرة بشكل كاف.

يتضمن بروتوكول FISH التقليدي عددا من خطوات الغسيل والحضانة ، والتي عادة ما تكون مدتها من 5 إلى 20 دقيقة وتتطلب اهتماما كاملا تقريبا من الباحث طوال مدة التجربة. علاوة على ذلك ، عادة ما يقتصر عدد الشرائح التي يمكن التعامل معها يدويا على بضع شرائح في تجربة معينة. في المقابل ، يقوم نظام تلطيخ الشرائح الآلي بتنفيذ جميع الخطوات (بما في ذلك الغسيل ، والحضانة ، وتطبيق المسبار ، والتمسخ ، والتهجين ، وتطبيق الغطاء والإزالة) تلقائيا. هذا يحرر ما يصل إلى 6-8 ساعات عمل للباحث في تجربة FISH. علاوة على ذلك ، يمكن لنظام FISH الآلي أن يزيد بشكل كبير من الإنتاجية. على سبيل المثال ، نظام Xmatrx قادر على معالجة ما يصل إلى 40 فحصا على شرائح تحضير فردية وما يصل إلى 80 فحصا على شرائح التحضير المزدوجة في وقت واحد. من بين قيود هذا النظام أنه غير فعال لعدد قليل من تجارب FISH لأنه يتطلب إعداد كميات كبيرة من الحلول. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتطلب بروتوكول FISH المبرمج في النظام تعديلات وتعديلات للتطبيقات الجديدة.

نظام مسح الشرائح هو نسخة آلية من مجهر الفلورسنت. تعمل الحركة الآلية للمرحلة ولوحة التحكم المجهرية البسيطة على توفير وقت الباحث وجعل تشغيل المجهر أمرا بسيطا للغاية. على سبيل المثال ، يسمح البرنامج الموجود في نظام المسح الضوئي ACCORD PLUS بالتقاط قنوات مضانة متعددة بسهولة ، وسهولة إدارة الحصول على الصور. مثال على ذلك هو إدراج التقاط z-stack ، بدلا من التقاط صورة واحدة. يلتقط البرنامج مجموعة Z-Stack قابلة للتكوين من الصور لضمان بقاء صورة واحدة على الأقل في بؤرة التركيز. على الرغم من أن هذا النظام مصمم بشكل أكبر للحصول على صور متعددة (الكثير من الخلايا على شريحة واحدة) ، إلا أنه لا يزال يجعل العثور على الكروموسومات على الشريحة أسهل بكثير من التنقل عبر الشريحة يدويا.

يتم استخدام كل من نظام تلطيخ الشرائح الآلي ونظام المسح بشكل روتيني لتشخيص FISH لتشوهات الكروموسومات في الخلايا البشرية بواسطة عيادات علم الوراثة الخلوية. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول يستخدم هذه الأنظمة الآلية لتطبيق بحث أساسي. يمكن أن يسهل بروتوكول رسم الخرائط المادية الآلي عالي الإنتاجية التطوير السريع لخرائط الكروموسومات المادية لأي نوع من الأنواع ذات الأهمية. على الرغم من أننا استخدمنا في هذا التقرير كروموسومات البوليتين لرسم الخرائط الفيزيائية ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام الكروموسومات الانقسامية مع هذه الأنظمة. سيكون من المفيد تعديل البروتوكول مع الكروموسومات الانقسامية لأن غالبية الكائنات الحية لا تطور كروموسومات بوليتين قابلة للقراءة. ومع ذلك ، يمكن أن توفر كروموسومات البوليتين ، عند توفرها ، معلومات مفيدة حول مراسلات مجالات الجينوم الوظيفية مع بنية الكروموسوم بأعلى دقة. تم مؤخرا تشبيه المبادئ التنظيمية لكروموسومات البوليتين ، مثل أنماط النطاقات والنطاقات البينية ، بتلك الخاصة بالكروموسومات العادية غير البوليتين (الطور البيني)¹⁸. لذلك ، فإن رسم الخرائط الفيزيائية التفصيلية الذي يتم إجراؤه على مستحضرات الكروموسومات عالية الضغط لديه القدرة على ربط تسلسل الحمض النووي بهياكل كروموسومات محددة مثل العصابات ، والنطاقات البينية ، والنفث ، والسنتروميرات ، والتيلوميرات ، والكروماتين المتغاير ؛ وبالتالي ، إنشاء تجميعات جينوم قائمة على الكروموسومات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة 1R21AI094289 إلى إيغور ف. شاراخوف. تم شراء نظام تلطيخ الشرائح الآلي Xmatrx ونظام المسح الآلي ACCORD PLUS بمساعدة برنامج الصندوق الاستئماني للمعدات ، ومعهد Fralin لعلوم الحياة ، وقسم علم الحشرات ، وقسم الكيمياء الحيوية في Virginia Tech.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أغطية مجهر مقاس 22 × 22 مم	فيشر	12-544-10
أغطية مجهر 18 × 18 مم	فيشر	12-553-402
حمض الخليك	فيشر	A491-212
ميثانول	فيشر	A412-4
أداة دوارة حمض البروبيونيك	سيجما ألدريتش	402907
Dremel 200 مع عمود مرن مرفق	راند		3 "مطحنة مقاعد بدلاء صغيرة متعددة الأغراض (مع محدد معدل)
مصممة خصيصا 200 مو ؛ ل نصائح بلاستيكية (حواف بلاستيكية مطرزة) لأداة Dremel	Pipetman	F171300	قطع وتسخين نهاية الدهون من أطراف الماصة
القصدير الملزمة السريعة المطلية ب	Avenger Gold	Toolmaker MTC-200-1	مربع أرضي دقيق ومتوازي في حدود 0.00025
مفتاح عزم الدوران	الحرفي	44593
نظام تمسخ / تهجين الشرائح ThermoBrite	أبوت الجزيئي	30-144110
شرائح حاجز 25 مم أبوت	الجزيئية	XT108-SL
25 مم أغطية أبوت	الجزيئية	XT122-90X
Xmatrx نظام تلطيخ الشرائح الآلي	أبوت الجزيئي	08L46-001
MZ6 مجهر مجسم	لايكا	VA-OM-E194-354	استخدام مجهر مجسم مختلف
أوليمبوس CX41 مجهر المرحلة	أوليمبوس	CX41RF-5	يمكن استخدام مجهر طور مختلف
المسح الآلي ACCORD PLUS	BioView (الولايات المتحدة الأمريكية)	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10٪ NBF (فورمالين محايد مخزن)	سيجما ألدريتش	HT501128
99٪ فورماميد	فيشر ساينتفيك	BP227500
ديكستران كبريتات الصوديوم ملح الصوديوم	Sigma	D8906
20x SSC عازلة	Invitrogen	AM9765
فوسفات الصوديوم	Sigma-Aldrich	S3264
50x محلول Denhardt	Sigma-Aldrich	D2532
أزيد الصوديوم	Sigma-Aldrich	S2002
1 ملي مولار يوديد يوديد (491/509) محلول في DMSO	Invitrogen	Y3601
كاشف ProLong Gold المضاد للبهتان	Invitrogen	P36930
dATP و dCTP و dGTP و dTTP	Fermentas	R0141 و R0151 و R0161 و R0171
Cy3-dUTP و Cy5-dUTP و GE	Healthcare	PA53022 و PA55022
BSA	Sigma	A3294
DNA polymerase I	Fermentas	EP0041
DNase I	Fermentas	EN0521

يمكن نظام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species. J. Hered. 100, 659-674 (2009).
Robinson, G. E., et al. Creating a Buzz About Insect Genomes. Science. 331, 1386-1386 (2011).
Project description at Broad Institute [Internet]. , The Eli and Edythe L. Broad Institute of Harvard and MIT. Cambridge, MA. Available from: http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/ (2012).
Besansky, N. Genome Analysis Of Vectorial Capacity In Major Anopheles Vectors Of Malaria Parasites. White Paper. , 1-15 (2008).
Alkan, C., Sajjadian, S., Eichler, E. E. Limitations of next-generation genome sequence assembly. Nature. 8, 61-65 (2011).
Sharakhova, M. V., et al. Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly. Genome Biol. 8, R5(2007).
Lewin, H. A., Larkin, D. M., Pontius, J., O'Brien, S. J. Every genome sequence needs a good map. Genome Res. 19, 1925-1928 (2009).
Bhutkar, A., et al. Chromosomal rearrangement inferred from comparisons of 12 Drosophila genomes. Genetics. 179, 1657-1680 (2008).
Novikov, D., Kireev, I., Belmont, A. S. High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution. Nature. 4, 483-485 (2007).
George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-resolution cytogenetic map for the African malaria vector Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 19, 675-682 (2010).
FISH Complete Automation [Internet]. , Abbott Laboratories. Abbott Park, IL. Available from: http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html (2012).
The ACCORD system [Internet]. , BioView Ltd. Billerica, MA. Available from: http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332 (2012).
Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes: Development, Nutrition and Reproduction. , Chapman & Hall. (1992).
BLAST @ VectorBase.org [Internet]. , VectorBase.org. Notre Dame, IN. Available from: http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/ (2012).
Sharakhova, M. V., et al. Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e10(2011).
Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis. J. Vis. Exp. (48), e2570(2011).
Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling. J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).
Vatolina, T. Y., et al. Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 6, (2011).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Anopheles gambiae

الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي في الموقع التهجين

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

البروتوكول

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة