مقالة منهجية

الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي

14.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/4007

⸱

يونيو 28, 2012

 ,  , 
1Department of Entomology, Virginia Tech

في هذه المقالة

ملخص

عادة ما تكون تجميعات الجينوم القائمة على تقنيات تسلسل الحمض النووي المتوازي الضخم مجزأة للغاية. ويمكن لتطوير الخرائط الكروموسومية الفيزيائية أن يحسن تجميعات الجينوم بشكل محتمل. ونحن نوضح هنا مناهج مبتكرة لتحضير الكروموسومات، والتهجين الموضعي الفلوري in situ، والتصوير، مما يزيد بشكل كبير من إنتاجية تطوير الخريطة الفيزيائية.

الملخص

من المتوقع أن يتم تنفيذ مشاريع للحصول على تسلسلات الجينوم الكامل لـ 10,000 نوع من الفقاريات1 و 5,000 نوع من الحشرات ومفصليات الأرجل ذات الصلة2 على مدار السنوات الخمس القادمة. على سبيل المثال، يجري حالياً تسلسل جينومات 15 نوعاً من بعوض الملاريا باستخدام منصة Illumina3,4. وتضم مجموعة أنواع Anopheles هذه كلاً من النواقل وغير النواقل للملاريا. وعندما تصبح تجميعات الجينوم متاحة، ستتاح للباحثين فرصة فريدة لإجراء تحليل مقارن لاستنتاج التغيرات التطورية ذات الصلة بالقدرة على نقل العدوى. ومع ذلك، فقد ثبتت صعوبة استخدام قراءات تسلسل الجيل القادم لإنشاء تجميعات جينوم عالية الجودة من نوع de novo5. علاوة على ذلك، فإن تجميعات الجينوم الحالية لـ Anopheles gambiae، رغم الحصول عليها باستخدام طريقة Sanger، لا تزال تحتوي على فجوات أو مجزأة4,6.

سيكون نجاح تحليلات الجينوم المقارنة محدوداً إذا تعامل الباحثون مع العديد من القطع المتصلة (contigs) من التسلسل، بدلاً من تجميعات جينومية قائمة على الكروموسومات. تسبب التسلسلات المجزأة وغير المحددة المواقع مشاكل في التحليلات الجينومية لأن: (1) الفجوات غير المحددة تؤدي إلى تعليق توضيحي (annotation) غير صحيح أو غير مكتمل للتسلسلات الجينومية؛ (2) التسلسلات غير المحددة المواقع تؤدي إلى خلط بين الجينات المتوازية (paralogous genes) والجينات القادمة من أنماط فردانية (haplotypes) مختلفة؛ و(3) غياب التعيين الكروموسومي وتحديد اتجاه القطع المتصلة من التسلسل لا يسمح بإعادة بناء فيلوجيني إعادة الترتيب ودراسة تطور الكروموسومات. إن تطوير خرائط فيزيائية عالية الدقة للأنواع ذات الجينومات التي تم تسلسلها حديثاً يعد استثماراً ملائماً من حيث التوقيت وفعالاً من حيث التكلفة، مما سيسهل عملية التعليق التوضيحي للجينوم، والتحليل التطوري، وإعادة تسلسل الجينومات الفردية من المجموعات الطبيعية7,8.

نقدم هنا مناهج مبتكرة لتحضير الكروموسومات، والفلورية في الموضع التهجين الموضعي المتألق (FISH)، والتصوير التي تسهل التطوير السريع للخرائط الفيزيائية. باستخدام *An. gambiae* كمثال، نوضح أن تطوير الخرائط الكروموسومية الفيزيائية يمكن أن يؤدي إلى تحسين تجميعات الجينوم، وبالتالي تحسين جودة التحليلات الجينومية. أولاً، نستخدم طريقة الضغط العالي لتحضير مستعرضات الكروموسومات العملاقة. هذه الطريقة، التي طُورت في الأصل لـ ذبابة الفاكهة (Drosophila)9، تتيح للمستخدم تصور تفاصيل أكثر في الكروموسومات مقارنة بتقنية الهرس المعتادة10ثانياً، يُستخدم نظام أمامي مؤتمت بالكامل لتقنية التهجين الموضعي المتألق (FISH) لرسم الخرائط الفيزيائية عالية الإنتاجية للجينوم. حيث يقوم نظام صبغ الشرائح المؤتمت بتشغيل فحوصات متعددة في وقت واحد، مما يقلل بشكل كبير من الوقت اللازم للعمل اليدوي.11ثالثاً، يقوم نظام تصوير فلوري آلي، يتضمن منصة شرائح بمحرك، بمسح وتصوير الكروموسومات الملونة تلقائياً بعد إجراء التهجين الموضعي الفلوري (FISH).12يعد هذا النظام مفيداً بشكل خاص لتحديد وتصوير عدة لوحات صبغية على الشريحة نفسها. بالإضافة إلى ذلك، تتيح عملية المسح الحصول على نتائج تهجين فلوري في الموقع (FISH) أكثر تجانساً. وبشكل عام، فإن بروتوكول رسم الخرائط الفيزيائية الآلي عالي الإنتاجية أكثر كفاءة من البروتوكول اليدوي القياسي.

البروتوكول

1. تحضير الكروموسومات العملاقة (Polytene Chromosome) تحت ضغط عالٍ من الخلايا المغذية في المبيض

  1. قم بتشريح إناث Anopheles نصف الحاملة بعد 25 ساعة من التغذية على الدم باستخدام مجهر التشريح، وثبت المبيضين في محلول كارنوي (Carnoy's solution) المعدل الطازج باستخدام الميثانول (ميثانول 100%: حمض الخليك الثلجي، 3:1). في هذه المرحلة، تكون المبايض في مرحلة التطور الثالثة حسب تصنيف كريستوفر (Christophers' III stage)، حيث تتخذ الجريبات شكلاً بيضاوياً، وتكون المنطقة الشفافة التي تحتوي على الخلايا المغذية داخل الجريبات ذات شكل دائري13. ضع مبايض ما يقرب من خمس إناث في 500 μl من محلول كارنوي المعدل في أنبوب Eppendorf سعة 1.5 ml، واحفظها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. ثم انقل المبايض إلى درجة حرارة -20 °C للتخزين طويل الأمد.
  2. حضّر محلول كارنوي المعدل باستخدام الإيثانول (إيثانول 100%: حمض الخليك الثلجي، 3:1) وحمض البروبيونيك بتركيز 50% مباشرة قبل تحضير الشرائح. ضع زوجاً واحداً من المبايض على شريحة خالية من الغبار في قطرة واحدة من محلول كارنوي المعدل. قسّم المبايض إلى حوالي 6 أقسام باستخدام إبر التشريح، وضعها في قطرات من حمض البروبيونيك بتركيز 50% على شرائح نظيفة تحت مجهر ستيريوميكروسكوب MZ6 Leica للتشريح. استخدم شريحة منفصلة لكل قسم.
  3. افصل الجريبات عن طريق التشريح باستخدام الإبر، وامسح الأنسجة المتبقية باستخدام ورق ترشيح أو مناديل ورقية تحت مجهر التشريح. أضف قطرة جديدة من حمض البروبيونيك بتركيز 50% إلى الجريبات واتركها لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع غطاء الشريحة (coverslip) فوق قطرة حمض البروبيونيك بتركيز 50%، واترك الشريحة لمدة دقيقة واحدة تقريباً.
  4. غلف الشريحة بورق ترشيح وبلاستيك. باستخدام أداة Dremel 200 الدوارة مع ملحق Flex-Shaft ورأس بلاستيكي ناعم مضبوط بين 3000-5000 RPM، قم بفرد الجريبات عن طريق تدوير الرأس في دوائر والضغط الخفيف على غطاء الشريحة لتوزيع النوى بالتساوي. يجب أن تستغرق هذه الخطوة حوالي دقيقة واحدة. تحقق من جودة الفرد باستخدام مجهر Olympus CX41 Phase باستخدام عدسة شيئية 20x.
  5. جهز "ساندويتش" من خلال وضع غطاء شريحة إضافي بجانب الغطاء الذي يغطي الكروموسومات، ثم غطِّهما بشريحة مجهرية ثانية. يقلل هذا من احتمالية تحطم الشريحة في المنجلة. غلف الشرائح بلفافة بلاستيكية (من تلك التي تأتي في حاويات الشرائح الزجاجية) وورق ترشيح لتثبيت هذا التركيب وحماية الشريحة من الخدش الناتج عن المنجلة.
  6. طبق الضغط على الشرائح باستخدام منجلة ميكانيكية. يعد ضغط يتراوح بين 85-120 inch-lbs كافياً، ويتم تحقيقه باستخدام مفتاح عزم الدوران. هذه الخطوة ضرورية لبسط الكروموسومات قدر الإمكان.
  7. أزل الشريحة المجهرية الثانية وغطاء الشريحة الإضافي. سخن الشريحة مع الغطاء الذي يغطي الكروموسومات إلى 55 °C في نظام مسخ/تهجين الشرائح لمدة 10-15 دقيقة لمزيد من بسط الكروموسومات. اغمس الشريحة في النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية على الأقل، وعندما يتوقف التفقيع، ابدأ بسرعة في إزالة غطاء الشريحة باستخدام شفرة حلاقة. ضع الشرائح فوراً في إيثانول بارد بتركيز 50% لمدة 5 دقائق. جفف الشرائح في إيثانول بتركيزات 70% و90% و100% لمدة 5 دقائق لكل تركيز. اترك الشرائح لتجف في الهواء.

2. تقنية التهجين الموضعي المتألق (FISH) باستخدام نظام آلي لتلوين الشرائح

يتم إعداد البرنامج باستخدام نظام Xmatrx الآلي لصب الشرائح لتنفيذ الخطوات التالية، باستثناء وسم المسبار. تم وصف بروتوكول وسم "نقل الشق" (nick-translation) بالتفصيل في الوثائق المرفقة مع DNA polymerase من شركة Fermentas.

  1. قبل البدء بتقنية FISH، يتم تحضير المجسات الفلورية عن طريق وسم الحمض النووي الجينومي BAC باستخدام فلوروكروم وفق بروتوكول النقل بالشقوق (nick-translation). اخلط 1 μg من DNA، و0.05 mM من كل من dATP وdCTP وdGTP غير الموصومة، و0.015 mM من dTTP، و1 μl من Cy3- أو Cy5-dUTP، و0.05 mg/ml من BSA، و5 μl من منظم النقل بالشقوق بتركيز 10x، و20 وحدة من DNA polymerase I، و0.0012 وحدة من DNase I، ثم أكمل الحجم بالماء الخالي من النوكلياز حتى 25 μl. يتم اختيار نسبة DNA polymerase I/DNase I تجريبياً للحصول على مجسات تتراوح أحجامها بين 300 و500 bp. يتم تحضين الخليط عند 15 °C لمدة ساعة واحدة.
  2. ضع الشرائح والكواشف في نظام صبغ الشرائح الآلي Xmatrx وقم بتشغيل البرنامج لتنفيذ الخطوات التالية: أضف 800 μl من 1x PBS لمدة 20 دقيقة، ثم جفف الشرائح بالهواء. قم بإجراء التثبيت بالفورمالين عن طريق إضافة 450 μl من فورمالين 4% في 1x PBS لمدة دقيقة واحدة، تليها عمليات غسيل باستخدام إيثانول 100% لمدة ثانية واحدة (مرتين) ولمدة دقيقتين (مرة واحدة)، ثم جفف الشرائح بالهواء.
  3. سخن الشرائح عند 45 °C لمدة دقيقتين لتجنب تكون الفقاعات عند إضافة المجسات. أضف 20 μl من مجسات DNA، وأضف قطرات من الزيت المعدني لمنع تبخر محلول التهجين، ثم ضع غطاء الشرائح (coverslip) في الأعلى. قم بمسخ الكروموسومات ومجسات DNA عن طريق تسخين الشرائح عند 90 °C لمدة 10 دقائق.
  4. لإجراء التهجين، يتم تحضين الشرائح عند 42 °C لمدة 14 ساعة مع بقاء أغطية الشرائح في مكانها. يتكون محلول التهجين من 2x SSC، و100 mM من فوسفات الصوديوم، و1x من محلول Denhardt، و100 μg/ml من أزيد الصوديوم، و10% ديكستران سلفات في الفورماميد.
  5. لإجراء غسيلات الصرامة (stringency washes)، سخن الشرائح عند 42 °C لمدة دقيقتين، ثم أزل أغطية الشرائح، واغسل الشرائح في 2x SSC لمدة ثانية واحدة 4 مرات، ثم جفف الشرائح بالهواء. أضف 800 μl من 0.4x SSC عند 42 °C لمدة 10 دقائق (مرتين). اغسل الشرائح في 2x SSC عند 25 °C لمدة 10 دقائق.
  6. قم بصبغ الكروموسومات عن طريق إضافة 50 μl من 1 μM YOYO-1 في 1x PBS. أضف قطرات من الزيت المعدني لمنع تبخر محلول الصبغ، ثم ضع أغطية الشرائح وحضنها عند 25 °C لمدة 10 دقائق. أزل أغطية الشرائح، واغسل الشرائح في 2x SSC لمدة ثانية واحدة 4 مرات، ثم جفف الشرائح بالهواء. أضف 15 μl من كاشف ProLong Gold المانع للتلاشي، ثم ضع أغطية الشرائح.

3. قراءة الشرائح باستخدام نظام تصوير فلوري تلقائي

يفصل هذا القسم استخدام برنامج Duet، والذي يأتي قياسياً مع نظام المسح الآلي ACCORD PLUS. تبدأ التعليمات بعد التشغيل وفق الترتيب التالي: مصدر طاقة Olympus U-RFL-T للمصباح الهالوجيني، وجهاز كمبيوتر Dell precision T3500، ومجهر Olympus BX61 متصل بكاميرا Olympus U-CMAD3.

  1. لإعداد المسح المسبق بدقة 10x، افتح برنامج Duet في نظام المسح الآلي ACCORD PLUS. انقر فوق زر "Online". أدخل معرف حالة (Case ID) جديداً وخصص معرف شريحة (Slide ID). انقر فوق النقطة المسمى "BF"، وهو خيار المجال المضيء (brightfield). اختر "10x Prescan" كخيار للمسح. استخدم "2500x circle" أو "10000x circle" أو "rectangle". انقر فوق "Set&run" لبدء المسح المسبق بدقة 10x.
  2. انقر فوق زر "OK" لتشغيل المسح المسبق بدقة 10x. اتبع الإرشادات لضبط المسح بشكل صحيح. انقر فوق "Finish" لبدء المسح. اضغط على علامة التبويب "Main" للعودة إلى الشاشة الرئيسية. انقر فوق زر "Offline". ابحث عن معرف الحالة ومعرف الشريحة اللذين تم تخصيصهما وانقر فوق "Offline Scan". في المربع الأسود الموجود في المنطقة العلوية اليسرى، انقر فوق السهم واختبر "10x Prescan". باستخدام الأسهم (< || Δ > المعروفة بأزرار "الرجوع"، "التوقف المؤقت"، "التشغيل"، "التقديم")، تصفح الصور الممسوحة ضوئياً.
  3. بعد العثور على صورة مثيرة للاهتمام، انقر نقراً مزدوجاً على منتصف المنطقة المستهدفة على الشاشة واضغط على "Snap". سيؤدي ذلك إلى تحديد صورة لالتقاطها لاحقاً. بعد تحديد جميع الأهداف، انقر فوق "Classify". اختر "10x Prescan". انقر بزر الفأرة الأيمن فوق الصورة لتصنيف الصور. اختر "Polytene".
  4. قم بإعداد المسح المسبق بدقة 40x في برنامج Duet. انقر فوق "Main" للعودة إلى القائمة الرئيسية. اختر "Online" مرة أخرى. اختر شريحة. قم بتغيير "BF" إلى "FL". قم بتغيير اسم المهمة إلى "Revisit-X40-RG". قم بتغيير القسم الموجود أسفل الإعداد الأخير مباشرةً إلى "Revisit-ALL". انقر فوق "Set&Run". اضغط على "OK". اتبع الإرشادات مرة أخرى لإعداد التشغيل الآلي. انقر فوق زر "Start matching views" لمطابقة صور 10x و40x. انقر فوق "Finish" لبدء المسح. بمجرد الانتهاء، انقر فوق "Classify" وعاين الصور.

4. النتائج التمثيلية

الشكل 1 يوضح بيانياً مخطط تحضير الكروموسومات تحت الضغط العالي. تتضمن هذه الخطوة عملية سحق وتسطيح الكروموسومات باستخدام أداة Dremel ومنجلة ميكانيكية، بالإضافة إلى تصور الكروموسومات باستخدام مجهر تباين الأطوار. يوضح الشكل 2 تهجين مسبار مُعلم فلورياً مع الحمض النووي المستهدف على تحضيرات شرائح الكروموسومات باستخدام نظام آلي لصبغ الشرائح، واستخدام مجهر مسح آلي لتصور ورسم خرائط المسابير بعد تجربة FISH، ووضع وتوجيه السقالات الجينومية على الكروموسومات.

تَمّ تحضير صبغيات متعددة الخيوط من الخلايا الممرضة في مبيض إناث An. gambiae باستخدام تقنية الضغط العالي. لا تتسبب هذه الطريقة في إتلاف أو تغيير معظم بنية الصبغيات (الشكل 3). وهي تعمل على تسطيح الصبغيات المنحنية، وبالتالي تكشف عن نطاقات دقيقة خفية لا تظهر في التحضيرات العادية (الشكل 4).

تعد المجسات المستخدمة في هذا البروتوكول مستنسخات DNA من نوع BAC جينومية تم الحصول عليها من مكتبة ND-TAM BAC التي تم إنشاؤها من DNA سلالة PEST لـ An. gambiae. وقد استُخلص DNA الجينومي لهذه المكتبة من يرقات الطور الأول حديثة الفقس من كلا الجنسين. يوضح الشكل 5 نتائج تقنية FISH باستخدام مستنسخات BAC التي تم تهجينها مع الكروموسومات متعددة الخيوط لـ An. gambiae. وقد أُجري هذا الإجراء باستخدام نظام Xmatrx الآلي لصبغ الشرائح. وبالاستعانة بخريطة صور وراثية خلوية لـ An. gambiae10، تم تحديد موقع مستنسخي BAC، وهما 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) و BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698)، في القسمين الفرعيين 16C و 16D من الذراع 2R على التوالي. ومع ذلك، حدد بحث BLAST مقابل تجميع AgamP3 لسلالة PEST لـ An. gambiae14 التسلسلات المتماثلة لـ 102B24 و 142O19 في القسمين الفرعيين 16B و 17A من الذراع 2R على التوالي (الجدول 1). وبناءً على ذلك، يمكن الآن ضبط التوافق بين الإحداثيات الجينومية والأقسام الفرعية الوراثية الخلوية وفقاً لبيانات التعيين الخاصة بنا. وقد وجد بحث BLAST مقابل تجميعات جينوم الشكل M والشكل S لـ An. gambiae أن مستنسخي BAC يقعان في قطع متصلة (contigs) مختلفة، ولكن في نفس السقالات (scaffolds) ضمن كل شكل (الجدول 1). ويمكن الآن ربط القطع المتصلة المحددة بمواقع كروموسومية محددة. علاوة على ذلك، يمكن الآن توجيه السقالات المحددة بشكل صحيح ضمن الأقسام الخلوية الفرعية 16CD. ومن المثير للاهتمام أن المسافات بين تسلسلات 102B24 و 142O19 في السقالات هي 1,892,981 bp، و 1,658,391 bp، و 1,688,426 bp في تجميعات جينوم سلالة PEST، والشكل M، والشكل S على التوالي. ونظراً لأن سلالة PEST هي هجين بين الشكلين M و S، فمن المرجح أن يكون هذا الاختلاف ناتجاً عن تجميع غير صحيح لجينوم PEST.

BAC
(رقم الوصول)		سلالة PEST
AgamP3

الإحداثيات		النمط M
القطع المتصلة (contigs)

الإحداثيات		النمط M
السقالات (scaffolds)

الإحداثيات		النمط S
القطع المتصلة (contigs)

الإحداثيات		النمط S
السقالات (scaffolds)

الإحداثيات
102B24
(BH372694)		2R:AAAB0100
8844_26 (16B)

43,681,342-
43,681,874		ABKP020247
53.1

32,513-
33,045		EQ090167.1

1,858,377-
1,858,909		ABKQ010123
32.1

4,299-
4,832		EQ099711.1

215,891-
216,424
102B24
(BH372701)		2R:AAAB0100
8844_28 (16B)

43,788,213-
43,788,969		ABKP020247
51.1

24,816-
25,575		EQ090167.1,

1,772,683-
1,773,442		ABKQ010123
35.1

27,782-
28,540		EQ099711.1,

305,514-
306,272
142O19
(BH368698)		2R:AAAB0100

8805_5 (17A)
45,428,580-
45,429,264		ABKP020247
01.1

2,499-
3,185		EQ090167.1

315,806-
316,492		ABKQ010123
76.1

49,242-
49,942		EQ099711.1

1,791,625-
1,792,325
142O19
(BH368703)		2R:AAAB0100
8805_8 (17A)

45,560,099-
45,574,323		ABKP020220
17.1

30,971-
32,469		EQ090167.1
200,518-
202,016		ABKQ010123
79.1

27,760-
28,508		EQ099711.1

1,903,569-
1,904,317

الجدول 1. نتائج BLAST لتسلسلات نهايات BAC مقابل التجميعات الجينومية لـ An. gambiae.

تشريح مبيض البعوض؛ مجهر تشريحي؛ تحضير الكروموسومات؛ المجهر تبايني الأطوار.
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لتحضير الكروموسومات تحت ضغط عالٍ. تظهر مبايض البعوض في المرحلة الصحيحة من النمو.

وسم المسبار لرسم خرائط الكروموسومات باستخدام التهجين الآلي للشرائح ومجهر المسح الضوئي.
الشكل 2. مخطط يمثل عملية FISH الآلية، ومسح الشرائح، ورسم خرائط الكروموسومات للسقالات الجينومية.

بنية الكروموسومات العملاقة، صورة مجهرية، تحليل نمط حزم DNA، أبحاث جينية.
الشكل 3. انتشار للكروموسوم العملاق 3 لـ An. gambiae تم الحصول عليه باستخدام تقنية الضغط العالي. تشير 3L و 3R إلى الأذرع اليسرى واليمنى عند نهاياتها الطرفية (telomeres). بينما تشير PH و IH إلى الكروماتين المغاير حول المركز والبيني، على التوالي.

صورة مجهرية تقارن أنماط نطاقات الكروموسوم 3R/3L تحت ضغوط مختلفة.
الشكل 4. مقارنة للكروموسومات متعددة الخيوط لـ An. gambiae التي تم تحضيرها باستخدام التقنية التقليدية (أعلى) وتقنية الضغط العالي (أسفل). تغطي الصور التقسيمات 29A-30E من الذراع 3R (A) و 43D-46D من الذراع 3L (B).

مخطط لرسم خرائط الكروموسومات، والوسوم الفلورية، والمواقع الجينية على كروموسومات Drosophila متعددة الخيوط.
الشكل 5. تهجين فلوري موضعي (FISH) لنسخ BAC على الكروموسومات متعددة الخيوط لـ An. gambiae. أ) تهجين 102B24 (إشارة حمراء) مع ذراع 2R. ب) تهجين فلوري موضعي ثنائي اللون لـ 102B24 (إشارة حمراء) و 142O19 (إشارة زرقاء) في التقسيمات الفرعية 16C و 16D من ذراع 2R الممدودة، على التوالي. تشير الأسهم إلى إشارات تهجين نسخ BAC الموسومة بـ Cy3 (أحمر) و Cy5 (أزرق). ج- المنطقة المركزية. يظهر a/+ الانقلاب المتباين الزيجوت 2La. صُبغت الكروموسومات صبغة تباينية باستخدام الفلوروفور YOYO-1.

المناقشة

تعتبر الخطوة الأكثر أهمية في إجراء الضغط العالي هي السحق الصحيح للخلايا المغذية للمبيض المعزولة في مرحلة Christophers' III من تطور المبيض13. يمكن أن يؤدي السحق غير الصحيح إلى عدم انتشار الكروموسومات بشكل كافٍ، مما قد يسبب مشكلات عند محاولة تحديد مواقع المسبار بعد إجراء تقنية التهجين الموضعي المتألق (FISH). أما إذا تم سحق الكروموسومات بشكل مفرط، فقد تتعرض للكسر أو الاستطالة لدرجة تؤدي إلى فقدان أنماط النطاقات (banding patterns). وينبغي أن يؤدي إنتاج شرائح متعددة إلى تحقيق الاتساق عند محاولة سحق الشرائح باستخدام أداة Dremel، مما سيزيد من الكفاءة الإجمالية لإنتاج الشرائح. لقد تم تطوير تقنية الضغط العالي لأول مرة للغدد اللعابية المعزولة حديثاً من D. melanogaster9. ومع ذلك، يتم حفظ مبايض البعوض بشكل روتيني في محلول تثبيت كارنوي المعدل (3 ميثانول: 1 حمض أسيتيك جليدي حسب الحجم) قبل استخدامها في التحضيرات الكروموسومية. لذلك، قمنا بتعديل بروتوكول الضغط العالي الحالي لجعله مناسباً للكروموسومات المتعددة في الخلايا المغذية للمبيض المثبتة لبعوضة الملاريا An. gambiae. وبما أن الضغط العالي يتم تطبيقه باستخدام منجلة دقيقة تمتلك سطح عمل متوازٍ للغاية على كامل الشريحة، فإن تحضير سحق الكروموسومات يستغرق وقتاً أقل بكثير مقارنة باستخدام تقنية النقر التقليدية بممحاة قلم الرصاص.

تشمل الخطوات الهامة الأخرى نقع الجريبات بشكل كافٍ في حمض البروبيونيك بتركيز 50% وتسخين الشريحة. وتعتبر هاتان الخطوتان ضروريتين للمساعدة في بسط الكروموسومات؛ ففي حال إهمالهما، قد تظهر الكروموسومات لامعة بعد عملية التجفيف، مما قد يؤدي إلى زيادة في الخلفية التي يمكن الخلط بينها وبين الإشارة في تقنية التهجين الموضعي المتألق (FISH). كما تعمل تقنية السحق ذات الضغط العالي بشكل جيد باستخدام المحاليل نفسها عند تحضير الكروموسومات في الطور الميتوزي. ويساعد الفرد والبسط الإضافيان في إظهار الكروموسومات من نواتها بشكل أفضل. ومن شأن تطبيق ضغط متساوٍ أن يؤدي إلى بسطها بما يسمح بإجراء القياسات وربما تحسين دقة النطاقات المرئية من التلوين. وقد وردت تفاصيل عزل الكروموسومات الميتوزية من البعوض في مكان آخر15. وعلى الرغم من أن تحضيرات السحق العادية كافية للعديد من الأغراض، بما في ذلك تقنية FISH 16 والتلوين المناعي17، إلا أن طريقة الضغط العالي لا تقلل فقط من التباين المحتمل من شريحة إلى أخرى، بل تزيد أيضاً من الجودة العامة للكروموسومات، مما يؤدي إلى تفاصيل أعلى عند رسم خرائط الكروموسومات. ويمكن استخدام هذا الإجراء أيضاً لتحضير شرائح أغشية الكروموسومات متعددة الخيوط من أجل التشريح المجهري بالالتقاط الليزري.

تشمل قيود طريقة الضغط العالي تكسر الشريحة والتمدد المفرط للكروموسومات. من الممكن أن يحدث تكسر للشريحة نتيجة تسليط ضغط زائد عليها عبر المنجلة، ولكن يمكن الحد من ذلك باستخدام قيم الضغط المذكورة في المقال. أما بالنسبة للتمدد المفرط للكروموسومات، ففي حال استخدام أداة Dremel على الشريحة لفترة زمنية طويلة، هناك احتمالية أن تتمدد الكروموسومات بشكل زائد وتفقد دقة الوضوح. ويمكن معالجة ذلك باستخدام الأداة لفترة زمنية قصيرة، ثم الفحص تحت المجهر، وزيادة مدة استخدام أداة Dremel إذا كانت الكروموسومات غير منتشرة بشكل كافٍ.

يتضمن بروتوكول التهجين الموضعي المتألق (FISH) التقليدي عدداً من خطوات الغسيل والتحضين، والتي تستغرق عادةً من 5-20 min وتتطلب انتباهاً كاملاً تقريباً من الباحث طوال مدة التجربة. علاوة على ذلك، يكون عدد الشرائح التي يمكن التعامل معها يدوياً محدوداً عادةً ببضع شرائح في تجربة معينة. وفي المقابل، يقوم نظام صبغ الشرائح الآلي بتنفيذ جميع الخطوات (بما في ذلك الغسيل، والتحضين، وإضافة المسبار، والمسخ، والتهجين، ووضع الغطاء الزجاجي وإزالته) بشكل آلي. وهذا يوفر ما يصل إلى 6-8 ساعات عمل للباحث في تجربة FISH. فضلاً عن ذلك، يمكن لنظام FISH الآلي زيادة الإنتاجية بشكل كبير؛ فعلى سبيل المثال، يستطيع نظام Xmatrx معالجة ما يصل إلى 40 مقايسة على شرائح التحضير الفردي وما يصل إلى 80 مقايسة على شرائح التحضير المزدوج في وقت واحد. ومن بين قيود هذا النظام أنه ليس فعالاً لعدد صغير من تجارب FISH لأنه يتطلب تحضير أحجام كبيرة من المحاليل. بالإضافة إلى ذلك، قد يتطلب بروتوكول FISH المبرمج في النظام تعديلات وضبطاً للتطبيقات الجديدة.

يُعد نظام مسح الشرائح نسخة مؤتمتة من المجهر الفلوري. حيث تساهم حركة المنصة المؤتمتة ولوحة تحكم المجهر البسيطة في توفير وقت الباحث وجعل تشغيل المجهر بسيطاً للغاية. فعلى سبيل المثال، يتيح البرنامج في نظام المسح ACCORD PLUS التقاط قنوات فلورية متعددة بسهولة، وإدارة عملية الحصول على الصور بيسر. ومن الأمثلة على ذلك إدراج خاصية التقاط z-stack بدلاً من أخذ صورة واحدة؛ حيث يقوم البرنامج بالتقاط مجموعة صور z-stack قابلة للضبط لضمان بقاء صورة واحدة على الأقل في نطاق التركيز. وبالرغم من أن هذا النظام مصمم بشكل أكبر للحصول على صور متعددة (عدد كبير من الخلايا على شريحة واحدة)، إلا أنه لا يزال يجعل العثور على الكروموسومات على الشريحة أسهل بكثير من التنقل عبر الشريحة يدوياً.

تستخدم عيادات الوراثة الخلوية بشكل روتيني كلاً من نظام صبغ الشرائح الآلي ونظام المسح التشخيصي لتقنية FISH للكشف عن التشوهات الكروموسومية في الخلايا البشرية. وفي هذه الدراسة، قمنا بتطوير بروتوكول يسخّر هذه الأنظمة الآلية لتطبيق في مجال الأبحاث الأساسية. يمكن لبروتوكول التعيين الفيزيائي الآلي عالي الإنتاجية أن يسهل التطوير السريع لخرائط الكروموسومات الفيزيائية لأي نوع من الكائنات الحية محل الدراسة. وعلى الرغم من استخدامنا للكروموسومات العملاقة (polytene chromosomes) في هذا التقرير لعملية التعيين الفيزيائي، إلا أنه يمكن أيضاً استخدام الكروموسومات الميتوزية (mitotic chromosomes) مع هذه الأنظمة. وسيكون من المفيد تعديل البروتوكول ليتناسب مع الكروموسومات الميتوزية لأن غالبية الكائنات الحية لا تطور كروموسومات عملاقة قابلة للقراءة. ومع ذلك، يمكن للكروموسومات العملاقة، عند توفرها، أن توفر معلومات قيمة حول تطابق نطاقات الجينوم الوظيفية مع بنية الكروموسوم بأعلى دقة ممكنة. وقد شُبهت المبادئ التنظيمية للكروموسومات العملاقة، مثل أنماط الحزم والفواصل بين الحزم، مؤخراً بتلك الموجودة في الكروموسومات العادية غير العملاقة (في الطور البيني)18. وبناءً على ذلك، فإن التعيين الفيزيائي التفصيلي الذي يتم إجراؤه على تحضيرات الكروموسومات عالية الضغط يمتلك القدرة على ربط تسلسلات DNA ببنى كروموسومية محددة مثل الحزم، والفواصل بين الحزم، والانتفاخات (puffs)، والسنتروميرات، والتيلوميرات، والكروماتين المغاير؛ مما يساهم في إنشاء تجميعات جينومية قائمة على الكروموسومات.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة 1R21AI094289 المقدمة إلى Igor V. Sharakhov. وقد تم شراء نظام Xmatrx لصبغ الشرائح آلياً ونظام ACCORD PLUS للمسح الآلي بمساعدة برنامج صندوق ائتمان المعدات في معهد فرالين لعلوم الحياة، وقسم علم الحشرات وقسم الكيمياء الحيوية في جامعة فيرجينيا تك.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غطاءات شرائح مجهرية 22x22 mmFisher12-544-10
غطاءات شرائح مجهرية 18x18 mmFisher12-553-402
حمض الأسيتيكFisherA491-212
ميثانولFisherA412-4
حمض البروبيونيكSigma-Aldrich402907
أداة دوارة Dremel 200 مع ملحق Flex-ShaftRandماكينة تجليخ مكتبية صغيرة متعددة الأغراض 3" (مع محدد سرعة)
رؤوس بلاستيكية 200 μl مصممة خصيصاً (بحواف بلاستيكية محببة) لأداة DremelPipetmanF171300قطع وتسخين الطرف العريض لرؤوس الماصة
منجلة سريعة مطلية بالقصديرAvenger Gold ToolmakerMTC-200-1مربعة وموازية مصقولة بدقة في حدود 0.00025
مفتاح عزمCraftsman44593
نظام ThermoBrite لمسخ/تهجين الشرائحAbbott Molecular30-144110
شرائح حاجزية 25 mmAbbott MolecularXT108-SL
غطاءات شرائح 25 mmAbbott MolecularXT122-90X
نظام Xmatrx الآلي لصبغ الشرائحAbbott Molecular08L46-001
مجهر ستيريو MZ6 LeicaLeicaVA-OM-E194-354يمكن استخدام مجهر ستيريو مختلف
مجهر طوري Olympus CX41OlympusCX41RF-5يمكن استخدام مجهر طوري مختلف
نظام المسح الآلي ACCORD PLUSBioView (USA)BV-5000-ACCP
10x PBSInvitrogenP5493
10% NBF (فورمالين محيد المنظم)Sigma-AldrichHT501128
99% formamideFisher ScientificBP227500
ملح صوديوم ديكستران سلفاتSigmaD8906
20x SSC bufferInvitrogenAM9765
فوسفات الصوديومSigma-AldrichS3264
50x Denhardt's solutionSigma-AldrichD2532
أزيد الصوديومSigma-AldrichS2002
محلول 1 mM YOYO-1 iodide (491/509) في DMSOInvitrogenY3601
كاشف ProLong Gold المضاد للتلاشيInvitrogenP36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTPFermentasR0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTPGE HealthcarePA53022, PA55022
BSASigmaA3294
DNA polymerase IFermentasEP0041
DNase IFermentasEN0521

المراجع

  1. Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species. J. Hered. 100, 659-674 (2009).
  2. Robinson, G. E., et al. Creating a Buzz About Insect Genomes. Science. 331, 1386-1386 (2011).
  3. Project description at Broad Institute [Internet]. , The Eli and Edythe L. Broad Institute of Harvard and MIT. Cambridge, MA. Available from: http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/ (2012).
  4. Besansky, N. Genome Analysis Of Vectorial Capacity In Major Anopheles Vectors Of Malaria Parasites. White Paper. , 1-15 (2008).
  5. Alkan, C., Sajjadian, S., Eichler, E. E. Limitations of next-generation genome sequence assembly. Nature. 8, 61-65 (2011).
  6. Sharakhova, M. V., et al. Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly. Genome Biol. 8, R5(2007).
  7. Lewin, H. A., Larkin, D. M., Pontius, J., O'Brien, S. J. Every genome sequence needs a good map. Genome Res. 19, 1925-1928 (2009).
  8. Bhutkar, A., et al. Chromosomal rearrangement inferred from comparisons of 12 Drosophila genomes. Genetics. 179, 1657-1680 (2008).
  9. Novikov, D., Kireev, I., Belmont, A. S. High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution. Nature. 4, 483-485 (2007).
  10. George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-resolution cytogenetic map for the African malaria vector Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 19, 675-682 (2010).
  11. FISH Complete Automation [Internet]. , Abbott Laboratories. Abbott Park, IL. Available from: http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html (2012).
  12. The ACCORD system [Internet]. , BioView Ltd. Billerica, MA. Available from: http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332 (2012).
  13. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes: Development, Nutrition and Reproduction. , Chapman & Hall. (1992).
  14. BLAST @ VectorBase.org [Internet]. , VectorBase.org. Notre Dame, IN. Available from: http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/ (2012).
  15. Sharakhova, M. V., et al. Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e10(2011).
  16. Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis. J. Vis. Exp. (48), e2570(2011).
  17. Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling. J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).
  18. Vatolina, T. Y., et al. Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 6, (2011).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحضير الكروموسوماتالتهجين الموضعي المتألقالتصوير الآليطريقة الضغط العاليالكروموسومات المتعددةAnopheles gambiaeترجمة الثلمةتلوين الشرائح الآلينظام التصوير المتألقالخرائط الفيزيائية للجينوم
الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.