مقالة منهجية

تحليل كمي لياقة سير العمل

DOI:

10.3791/4018

⸱

أغسطس 13, 2012

 ,  , 
1Institute for Cell and Molecular Biosciences, Newcastle University Medical School

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحليل الكمي لياقة (QFA) هو عبارة عن سلسلة متكاملة من الطرق التجريبية وحسابية لتقدير اللياقات ثقافة الميكروبية. QFA تقدر تأثير الطفرات الوراثية، والمخدرات، أو غيرها من العلاجات المطبقة على نمو الميكروب. ويمكن تصميم التجارب التحجيم من تحليل مركزة من الثقافات وحيد للآلاف من ثقافات موازية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحليل الكمي لياقة (QFA) هو سير العمل التجريبية والحسابية لمقارنة اللياقات الثقافات الميكروبية التي تزرع في 1،2،3،4 مواز. ويمكن تطبيق QFA إلى الملاحظات تركز على ثقافات واحد ولكن مفيدة جدا لالجينوم على نطاق التفاعل وراثية أو شاشات المخدرات التحقيق تصل إلى الآلاف من ثقافات مستقلة. الأسلوب المركزي التجريبية هو تلقيح مستقل، والثقافات المخففة الميكروبية السائل على لوحات أجار الصلبة التي حضنت وتصويرها بصورة منتظمة. ويتم تحليل الصور من كل نقطة في الوقت، وإنتاج كمي تقديرات كثافة الخلية، والتي تستخدم لبناء منحنيات النمو، مما يسمح للياقة البدنية المستمدة التدابير الكمية. ويمكن مقارنة اللياقات ثقافة لتحديد نقاط القوة وترتيب تفاعل وراثية أو حساسيات المخدرات. واضاف تأثير على اللياقة البدنية ثقافة أي علاجات في أجار الركيزة (الجزيئات الصغيرة على سبيل المثال، والمضادات الحيوية أو المواد الغذائية) أو تطبيقها على لوحات خارجيةويمكن لاي كميا (مثل الأشعة فوق البنفسجية إشعاع، ودرجة الحرارة) من قبل QFA.

سير العمل QFA تنتج نسبة نمو تقدر مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها بواسطة قياس الطيف من الثقافات سائل موازية في القراء لوحة 96-جيدا أو 200 حسنة. الأهم من ذلك، QFA لديه سرعة أعلى بكثير بالمقارنة مع مثل هذه الأساليب. الثقافات QFA تنمو على سطح صلب أجار وبالتالي فهي مهوى بشكل جيد خلال نمو من دون الحاجة إلى إثارة أو اهتزاز.

QFA الإنتاجية ليست مرتفعة كما أن من صفيف بعض الوراثية الاصطناعية (SGA) أساليب الفحص 5،6. ومع ذلك، منذ يتم تخفيفه بشكل كبير الثقافات QFA قبل أن يتم تلقيح على أجار، ويمكن التقاط QFA منحنيات النمو أكثر اكتمالا، بما في ذلك الأسي ومراحل التشبع 3. على سبيل المثال، ملاحظات منحنى نمو السماح يقدر مرات مضاعفة ثقافة مباشرة مع دقة عالية، كما نوقش سابقا 1.

نحن هنا يقدمتطبيق بروتوكول معين QFA إلى الآلاف من S. خميرة الثقافات التي يتم معالجتها تلقائيا بواسطة الروبوت خلال الحضانة، والتلقيح والتصوير. يمكن استبدال أي من هذه الخطوات الآلي عن طريق إجراء، أي ما يعادل دليل، مع تخفيض المرتبطة في الإنتاجية، ونقدم أيضا دليلا انخفاض الإنتاجية بروتوكول. ويمكن تطبيق البرنامج QFA نفس الأدوات لالصور التي تم التقاطها في أي من سير العمل.

لدينا خبرة واسعة في تطبيق QFA إلى ثقافات الخميرة في مهدها س. خميرة لكننا نتوقع أن QFA سوف تكون مفيدة على حد سواء لدراسة الثقافات من الخميرة الانشطار س. pombe والثقافات البكتيرية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دليل QFA بروتوكول (لسلالات خميرة س.)

1. زراعة سلالات من الخميرة

  1. تستزرع تصل إلى 96 سلالات الخميرة مستقل في 200 ميكروليتر سائل الإعلام الغنية في طبق ثقافة 96-جيدا. وتزرع سلالات من التشبع في درجة الحرارة التي تسيطر الحاضنة.
  2. دبوس 96، 1/8 "يتم تعقيمها قطر دليل طبق الاصل الحصان الرديء (SIGMA R-2508) عن طريق غمس أولا الحصان الرديء متماثلة في الإيثانول بنسبة 100٪، المشتعلة، ثم يترك ليبرد.
  3. ورتب 200 ميكروليتر من الماء المعقم في لوحة الثقافة 96-جيدا. وvortexed الثقافات المشبعة (إيبندورف MixMate، و 30 ثانية و 750 دورة في الدقيقة)، ويخفف من غمس أداة دبوس معقم في سلالات المشبعة ثلاث مرات بعد ذلك في لوحة تحتوي على المياه مرة واحدة.
  4. هو أداة دبوس إعادة تعقيمها وفقا 1.2.
  5. يتم استخدام أداة دبوس معقم على الفور ثقافة المخفف على لوحات أجار المباعة من قبل غمس في لوحة تحتوي على ثقافة المخفف ثلاثة أضعافن نقل أداة دبوس إلى لوحة أجار صلب مستطيل الشكل.
  6. يتم تحضين لوحات مستطيلة أجار الصلبة في درجة حرارة مناسبة قبل أن يتم تصويرها باستخدام يدويا S & P الروبوتات spImager. قد تكون الطرق البديلة لالتقاط الصور أيضا أن تستخدم مثل فوجي فيلم LAS4000، أو أقل تكلفة كاميرا SLR الرقمية إذا تم توخي الحذر لضمان إضاءة حتى وثابتة لتحديد المواقع لوحة بالنسبة لكاميرا التصوير.
  7. هذه الطريقة قابلة للتكيف مع عدد أقل من الثقافات بالتوازي مع ذلك، مثل 48، التي يمكن تركيبها على أطباق بتري الجولة إذا تم توخي الحذر لضمان زاوية النسبي نفسه إلى كاميرا التصوير في كل صورة.

مؤتمتة بالكامل QFA بروتوكول (لسلالات خميرة س.)

2. زراعة سلالات من الخميرة

  1. تبدأ مجموعة مستطيلة من سلالات الخميرة مستقل المتزايد على أجار الصلبة. في هذا المثال سلالات بداية هي نتيجة للعبور إلى درجة حرارةطفرة حساسة الاستعلام مع الخميرة مجموعة الحذف (YDC) بواسطة صفيف الوراثية الاصطناعية (SGA). نهائي لوحات SGA هي في 1536 شكل. هذا هو 16 بنسبة 24 في صفوف الأعمدة من المستعمرات / الثقافات التي تمثل أربع مكررات من 384 سلالات الخميرة مستقل. انظر الشكل 1 لتخطيطات لوحة.
  2. يتم نقل 384 سلالات من أصل 1536 آليا باستخدام S & P الروبوتات شركة BM3-SC الروبوت مع دبوس 96، 1 ملم pintool قطر دبوس معقم إلى أربع لوحات ثقافة 96-جيدا تحتوي على 200 ميكرو لتر من وسائل الإعلام انتقائي (الشكل 1). ويتحقق Pintool النظافة والتعقيم بواسطة غسل بالتتابع في الماء المعقم مرتين (مرة واحدة مع فرشاة دوارة لإزالة الأنقاض)، والإيثانول بنسبة 70٪ (مع صوتنة)، وأخيرا الإيثانول بنسبة 100٪.
  3. وتزرع الثقافات من التشبع (لمدة ثلاثة أيام عند 20 درجة مئوية في هذا المثال، انظر الشكل 1).

3. اكتشاف ثقافات الخميرة

  1. باستخدام Biomek بيكمان FX، والثقافات المشبعة 1إعادة معلق بواسطة vortexing على Teleshake Variomag (عكس اتجاه عقارب الساعة في 1000rpm لمدة 20 ثانية)، وتضعف 1:70 تقريبا من قبل يعلق في الماء المعقم 200 ميكروليتر باستخدام معقم 96 دبوس دبوس أداة الروبوتية (V & P العلمية المغناطيسي تصاعد pintool (2)، قطر دبوس ملم). ويتحقق دبوس نظافة أداة والعقم عن طريق الغسيل في ماء معقم، وغسل في الايثانول 70٪ (مع فرشاة لإزالة الأنقاض)، وأخيرا غمس في الايثانول 70٪ تليها التجفيف.
  2. ورصدت الثقافات المخفف على لوحات أجار الصلبة في 384 شكل باستخدام نفس أداة دبوس الروبوتية (انظر الشكل 1) بعد التنظيف والتعقيم.
  3. بعد تعلق، يتم نقل الصفائح إلى درجة حرارة Cytomat تسيطر عليها، حاضنة مرطب مع دائري التلقائي وفتحة الوصول.

4. التقاط الصور

  1. وS & P الروبوتات الآلية تصوير يزيل مرارا وتكرارا على لوحات من الحاضنة Cytomat، يزيل غطاء لوحة، ويضعهم على وجه التحديد في إطار إحاطةد، مساحة مضيئة بشكل موحد تحت متمرد كانون EOS DSLR 35mm تي، يلتقط صورة في 5184 بكسل القرار العاشر 3456، محل غطاء لوحة، وتعيدهم الى دائري الحاضنة. يتم التقاط صورة واحدة على الفور بعد نقل الأول إلى حاضنة للسماح لقياس الوقت النمو الصفري نقطة (الخلفية). التعامل مع الروبوت والتصوير يأخذ 2 دقيقة لكل لوحة.
  2. مع دائري محملة بالكامل، والحد الأقصى صورة لوحة قابلة للتحقيق وتيرة التقاط صورة واحدة كل ست ساعات. يتم تحضين لوحات لمدة تصل إلى ستة أيام (حتى تشبع نمو مستعمرة. ويظهر الشكل 1 ثلاث صور نموذجية من دورة لمرة في 20 درجة مئوية
  3. لأغراض التتبع، يتم تسمية لوحات وفقا لاسم الحاضنة، ودرجة الحرارة، فريد رقم تسلسلي دفعة وموقف في الحاضنة. أسماء الصورة هي سلسلة من اسم لوحة، والطابع الزمني ويتم إنشاء تلقائيا عند التقاط الصور (على سبيل المثال K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg نوع الملف، FT1، Table1).

5. القبض على الفوقية التجريبي

ملفات التعريف الوارد وصفها في هذا القسم هي ملفات نصية المفصول التي يتم إنشاؤها يدويا (على سبيل المثال باستخدام برنامج جداول البيانات). ملف وصف التجريبية (FT2، الجدول رقم 1) هي فريدة من نوعها إلى كل تجربة، ولكن يمكن للوصف مكتبة (FT3، الجدول رقم 1) إعادة استخدامها على نطاق واسع شيدت مرة واحدة.

  1. وصفت هذه التجربة في ملف وصف التجريبية (FT2، Table1) التي تحتوي على أعمدة للالباركود (أو تتولد تلقائيا اسم لوحة)، والطابع الزمني تجربة انطلاق، والعلاج لوحة، ومحتويات المتوسطة أجار الصلبة، واسم الشاشة، ومكتبة، ورقم لوحة (للمكتبات مع عدة لوحات)، وعدد تكرار-رباعي (انظر الشكل 1) لتوسيع نطاق انخفاضا من 1536 إلى 384 شكل الشكل.
  2. وصفت مكتبة سلالة الخميرة مع مكتبة ملف وصف (FT3،
  3. ويمكن توفير اختيارية اسم جين ستاندرد الملف (FT4، الجدول رقم 1) واصفا اسم الجين القياسية (على سبيل المثال RAD9) المرتبطة بكل ORF منهجي ص رقم (على سبيل المثال YDR217C) تحديد سلالات يجري فرزهم. هذا الملف يحتوي على عمودين: ORF وجين اسم.

6. تحليل البيانات

سير العمل QFA الحسابية يتطلب الوصول إلى محطة عمل قوية بشكل معقول كمبيوتر متعددة النواة (مثل ديل الدقة T3500 مع رباعية النواة زيون 2.67 جيجاهرتز وذاكرة الوصول العشوائي 12GB) المثبت على تحليل الصور Colonyzer أداة البرمجيات 3،4 وحزمة R QFA 7 ، وكلاهما موثقة على شبكة الإنترنت، هي متاحة بحرية وتشغيلها على مجموعة من أنظمة التشغيل.

  1. تشغيل Colonyzer مع كل لوحة من الصور التي تم التقاطها في المدخلات، وتوليد ملف واحد الناتج Colonyzer (الجدول FT5 1) لكل الصور الملتقطة. ملفات الناتج Colonyzer تحديد تقديرات كثافة والثقافة، وثقافة المنطقة، والشكل واللون عن كل موقع من المواقع 384 على لوحة المصورة. يتم نسخها تلقائيا اسم الملف الإخراج من مصدر ملف صورة (مثل صورة طبق K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1، الجدول رقم 1) يتوافق مع ملف الإخراج Colonyzer K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5، الجدول رقم 1)).
  2. باستخدام حزمة R QFA، وتحميل البيانات الوصفية التجريبية (FT2، Table1) والناتج الملفات Colonyzer (الجدول FT5 1). يتم دمج هذه البيانات في إطارات البيانات R (التي يمكن تصديرها كما خام ملفات QFA نص البيانات (FT6، الجدول رقم 1)) لمزيد من التحليل.
  3. حزمة R QFA يحتوي على وظائف لجمع timecourses كثافة خلية لكل ثقافة، لتناسب لو عممنماذج سكان gistic إلى ملاحظات وإلى مؤامرة على حد سواء. (انظر الشكلين 2 و 3 للأمثلة) تتم كتابة القيم المعلمة المجهزة إلى ملفات QFA معلمة لوجستية (FT7 الجدول 1). انظر وثائق حزمة QFA R لمزيد من التفاصيل.
  4. حزمة R QFA يحتوي أيضا على وظائف لمراقبة الجودة: يتم التخلص من المستعمرات حافة بسبب زيادة توافر المواد الغذائية في حواف لوحة وصعوبة في تحليل الصور قرب الجدران لوحة، والثقافات التي فشلت في SGA والمورثات عرض الربط مع الجينات علامة شاشة محددة يتم تجريد من التحليل.
  5. وتستمد العديد من التدابير لياقة بدنية كمية من المعلمات نموذج لوجستية عدد السكان لكل ثقافة. وتشمل هذه أقصى معدلات مضاعفة عدد السكان (MDR)، وعدد الشعب من التلقيح إلى التشبع (MDP). لكل مجموعة من الثقافات تكرار (من النمط الجيني فريدة من نوعها على سبيل المثال) ولكل تعريف اللياقة البدنية، وإحصاءات موجزة العديد من التقديرات لياقة بدنية وشركاتuted: متوسط ​​ومتوسط ​​اللياقة البدنية، واللياقة البدنية الانحراف المعياري وعدد من يعيد لوحظ. إحصاءات موجزة والإخراج لملفات QFA ملخص لياقة (FT8، الجدول رقم 1) لمزيد من التحليل، على سبيل المثال حساب عشرات التفاعل الجيني (FT9 الجدول 1).

7. ممثل النتائج

ويبين الشكل 2 1 منحنى نمو نموذجي من الثقافات QFA 384 المتزايد في درجة حرارة 20 مئوية على أجار الصلبة كما كميا بواسطة Colonyzer، مع زيادة في كثافة الخلية الأولى تصبح بعد اكتشاف ما يقرب من 2 يوما. هذا التأخير من المحتمل أن يكون التأثير المشترك للثقافة المرحلة الفاصلة بعد تلقيح على المتوسط ​​الصلبة والحد الأدنى للكشف عن كثافة الخلية. ويبين الشكل 3 308 منحنيات نمو مماثل تم الاستيلاء عليها من لوحة واحدة. الشكل 4 يوضح مقارنة اثنين من الجينوم واسعة شاشات QFA لاستنتاج الوراثيةنقاط القوة التفاعل (مقتبس من 1). حزمة R QFA 7 يتضمن أيضا وظائف لإنتاج الشكل (3)، وإخراج قوائم مرتبة من التراكيب الوراثية للفحص والتقديرات من قوة التفاعل وراثية (GIS)، جنبا إلى جنب مع Q-قيمة (الكاذبة معدل اكتشاف (روزفلت) تصحيح قيمة ف) لل أهمية نظم المعلومات الجغرافية المرصودة.

figure-protocol-1
الشكل 1. خطة لتلقيح الروبوتية من سلالات الخميرة في 384 بقعة الشكل. هذا الإجراء يبدأ ب 1536 الثقافات مستقل في لوحة (من اليسار). في هذا المثال النموذجي، والمستعمرات في المواقف 1،1، 1،2، 2،1 و 2،2 (اللون الأحمر) وأربع مكررات من النمط الجيني نفسه his3 :: الثقافات KANMX باللون الأصفر، وتزايد على حافة الطبق. ، لديها ميزة النمو بسبب عدم وجود منافسة وبالتالي لا تبحثها QFA. يتم تلقيح واحد من هذه مكررات (على سبيل المثال 1،1) إلى وسائل الإعلام نمو السائل في 96-جيدا لوحة الصورة باستخدام أداة 96-دبوس الذي inoculates 96 من أصل 1536 مستعمرات في كل مرة. من أجل تطعيم 1 تكرار لكل من الحذف الجين 384، أربعة أنواع مختلفة من "الأرباع" (كما هو مبين الأحمر والأزرق والأخضر والأرجواني) وتلقيح إلى أربع لوحات 96-جيدا مختلف وسائل الإعلام التي تحتوي على النمو. بعد نمو من التشبع (مثل 3 أيام في 20 درجة مئوية)، وتضعف الثقافات في الماء، ثم يتم رصد الأرباع الأربعة من تكرار في شكل-384 على لوحة أجار الصلبة (يمين) في نفس نمط لوحة SGA الأصلي (كما هو موضح حسب اللون). ويمكن تكرار هذه العملية لاختبار آخر يعيد: 1،2، 2،1 و 2،2. تم القبض على سبيل المثال الوقت الفاصل بين الصور على حق 0.5، 2 و 3.5 أيام بعد التلقيح. مقتبس من الشكل التكميلية 1 2. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

018/4018fig2.jpg "/>
الشكل 2. وحيد نمو QFA الروبوت القبض على منحنى. ونمو QFA) منحنى من سلالة الخميرة تنمو على الجلاكتوز أجار يحتوي على 20 درجة مئوية. وتم التقاط الصور آليا تقريبا كل ساعة 2. وكان يمكن ملاحظتها مرحلة الأسي في هذه الدرجة لمدة ما يقرب من 1.5 أيام، مع زيادة كثافة تصبح ثقافة 1 اكتشاف ما يقرب من 2 يوما بعد التلقيح. وتناسب نموذج معمم لوجستية للبيانات المرصودة (رمادي منحنى). وتعرض المعلمات نموذج تركيبها تلقائيا من خلال حزمة R QFA: K (القدرة على التحمل (الاتحاد الافريقي))، ص (معدل النمو (د -1))، ز (اللقاح كثافة (الاتحاد الافريقي)) والخامس (تناظر النمو). ب) أما بالنسبة للفريق، تآمر مع كثافة الخلية على نطاق وسجل. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

figure-protocol-2
الشكل 3. الجينات تلقائيا منحنيات النمو التي احتلتها في تصنيف مواز من 384 لوحة شكل واحد. كل لوحة تظهر تقديرات كثافة الخلية (علامات الصليب الأحمر)، ويصلح نموذج (منحنيات الأسود) للثقافات مستقلة وصفت من قبل اسم الجين أو ORF ص عدد نمت في إجراء QFA. تم تصوير هذا لوحة سبيل المثال عن طريق الروبوت، وتنمو في حاضنة الآلي على 20 درجة مئوية وترد تلقائيا الفوقية التجريبية في العنوان الرقم: اسم لوحة، وعلاج لوحة والمتوسطة أجار ومكتبة رقم لوحة. كما المجهزة قيم المعلمات نموذج المطبوعة تلقائيا على كل لوحة (انظر الشكل 2). جردوا من الثقافات حافة تحليل QFA، وترك 308 الثقافات في هذه المؤامرة (انظر QFA بروتوكول 5.4). منذ لا يتم تحليل الثقافات في حافة QFA، وعادة ما تمتلئ هذه المواقع مع ثقافة سلالات مراقبة محايدة (pGAL-HIS3 في هذه الحالة). النسخة الأصلية من هذا الرقم، خرج من خلال حزمة R QFA، هو في. شكل قوات الدفاع الشعبي، وبالتالي زوومابلي بلا حدود وقابلة للبحث من قبل استعلامات النص.:/ / www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

figure-protocol-3
الشكل 4. مقارنة اللياقات من على شاشات QFA سنتين إلى استنتاج تفاعل الجينية. هذه المؤامرة يبين مقارنة بين اللياقة البدنية من الحذف الخميرة في مهدها (yfgΔ) جنبا إلى جنب مع الطفرة ura3Δ محايد أو في درجة الحرارة طفرة حساسة cdc13-1، وتنمو في درجة حرارة شبه إباحية لcdc13- 1 (27 درجة مئوية). تم حساب اللياقة البدنية بوصفها نتاجا لمضاعفة معدل الحد الأقصى والحد الأقصى لإمكانية مضاعفة 1. معظم سلالات الحذف تنمو جيدا عند دمجها مع الطفرة ura3Δ محايدة، كما هو متوقع ويكون لياقة بدنية عالية، ولكن الحذف جنبا إلى جنب مع 1-cdc13 لديها مجموعة واسعة من اللياقات. خطوط عبور الضوء الأزرق في الموقع (ه) من طفرة his3Δ محايد، خط الصلبة هو نموذج الانحدار الخطي للاستقلال الجينية (لياقة بدنية المتوقع من 1-cdc13 yfgΔ المسوخ نظرا للياقة البدنية من المسوخ yfgΔ ura3Δ) وخط متقطع هو خط من لياقة بدنية على قدم المساواة. الحذف اللون الاخضر يعزز إلى حد كبير من اللياقة البدنية خلل cdc13-1 السلالات. الحذف حمراء اللون قمع بشكل كبير من العيب نفسه. المسافة العمودية من أي طفرة cdc13-1 yfgΔ من خط الصلبة تدل على قوة التفاعل الجيني بين 1-cdc13 وyfgΔ في ظل الظروف لوحة. لاحظ أن يتم تحديدها من قبل بعض أقوى من المكثفات 1-cdc13 الجينات نقطة تفتيش، RAD17، DDC1 وRAD24 وnuclease EXO1 بالقرب من أعلى اليمين. الجينات التي الحذف يقلل من اللياقة البدنية وتشمل YKU80 (ترميز إصلاح الحمض النووي وشريط الحامض النووي متوجا بروتين Yku80) بالقرب من أسفل اليمين. نلاحظ أيضا أن بعض مجموعات من الجينات التي تعمل معا تميل الى ان تكون في موقع مشترك على هذه المؤامرة. وتبرز مجموعات سبيل المثال ثلاثة في الزرقاء SPE1، SPE2 وSPE3: الجينات التوليف سبيرمدين، RAD17، DDC1 وRAD24: مكونات ترميز المشبك نقطة تفتيش وحاجز محمل انزلاق المشبك، MRE11، RAD50 وXRS2: مجمع MRX، والمشاركة في DDR وEST1 وEST3: الجينات المسؤولة عن تنظيم طول شريط الحامض النووي. مقتبس من الشكل 1B تكميلية 1، ويمكن تحميل البيانات الخام التي تم إنشاؤها هذه مؤامرة من هنا: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/ . انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

"> ملف التعريف ملف نوع شيدت يدويا تحديث التردد شرط مسبق FT1 لوحة فوتوغرافية لا لكل لوحة وtimepoint نعم FT2 وصف التجريبية نعم في التجربة نعم FT3 مكتبة الوصف نعم في مكتبة نعم FT4 أسماء جين القياسية نعم في مكتبة لا FT5 Colonyzer Ouput لا لكل timepoint لكل لوحة نعم FT6 بيانات أولية QFA لا في التجربة - FT7 لا في التجربة - FT8 QFA اللياقة البدنية موجز لا في التجربة - FT9 QFA Hitlist التفاعل الوراثية لا في دراسة نظم المعلومات الجغرافية (2 expts.) -

الجدول رقم 1. الملفات الالكترونية QFA. جميع الملفات المدرجة (باستثناء FT1) هي ملفات نصية المفصول ويمكن بناؤها أو قراءة باستخدام أي محرر نصوص أو برامج جداول البيانات. لمزيد من التفاصيل حول بناء ملفات التعريف QFA والتفسير الدقيق للانتاج QFA يرجى الاطلاع على مجموعة وثائق QFA R (7) وثائق البرنامج Colonyzer 3.

figure-protocol-4
الجدول 2. طرق لتقييم اللياقة البدنية ثقافة. موجز للملامح، وتتطلببيانات أدلى عدد من الطرق لتقييم اللياقة البدنية ثقافة الميكروبية. استعراض من قبل بلومبرغ 8 يتضمن مقارنة أكثر تفصيلا لبعض من هذه. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

QFA هو في كثير من الحواس مباشرة من نسل ثلاث تقنيات مقاعد البدلاء النطاق أنشئت الميكروبيولوجية: ثقافة الاختبارات بقعة تخفيف سلسلة 9، نمو تحديد منحنى في الثقافات الغازية السائلة (9) وطبق الطلاء 13. وتتلخص هذه الأساليب الثلاثة، وبالمقارنة مع QFA وغيرها من تقنيات عالية الإنتاجية في الجدول رقم 2. في حين أن اختبارات تخفيف بقعة سلسلة تعريف اللياقة البدنية سلالة كما قدرتها على تشكيل مستعمرات في سلسلة من الثقافات نمت من مجموعة من التخفيفات اللقاح، QFA اللياقة البدنية سلالة التدابير الملاحظات المتكررة من ثقافة واحدة لبناء منحنى النمو. قياس اللياقة البدنية من ثقافات واحد يسمح للفحص سلالات كثيرة في وقت واحد، في ظل ظروف مماثلة. صفائف تكرار للثقافات يسمح التجارب المتكررة لمجموعات الضغط، من المفيد للغاية عند اختبار اللياقة البدنية للاختلافات الثقافية في بيئات مختلفة أو خلفيات وراثية. قدم بروتوكول QFAهنا يستخدم معدات آلية مكلفة لتكرار، تطعيم، واحتضان لوحات أجار صورة، مناسبة لمراقبة نمو الآلاف من الثقافات المستقلة (QFA الروبوتية، الجدول 2). ومع ذلك، منذ يستند على QFA الراسخة، وتقنيات مختبر التقليدية، فإنه يمكن أيضا أن تنفذ أكثر من ذلك بكثير بأسعار رخيصة عن طريق الاستعاضة عن مساعدة الروبوت مع الخطوات اليدوية (دليل QFA، الجدول 2). دليل QFA ينطوي على تكرار وتلقيح الثقافات على لوحات أجار باستخدام أداة دبوس دليل ودليل نقل لوحات من وإلى حاضنة للتصوير الفوتوغرافي. ويمكن تطبيق نفس التحليل سير العمل الحسابية لتوليد منحنيات النمو سواء من التصميم التجريبي.

QFA تقديرات لياقة بدنية ويبدو أن يكون دقيقا نسبيا. في الشكل (4)، ويسلط الضوء على اللياقات متوسط ​​مجموعات سبيل المثال أربعة من الحذف وظيفيا الجينات ذات الصلة. على مقربة من أعضاء كل فئة الجينات المرتبطة وظيفيا في اثنين من استقلالخلفيات والأنف والحنجرة وراثية (ura3Δ وcdc13 1) يدل على استنساخ من التقديرات لياقة بدنية QFA. على سبيل المثال، والحذف الجين فقط 3 (من أصل 4300 أمكن) فصل ثلاثة من أعضاء مجمع MRX حفظها.

الإنتاجية العالية لبدائل QFA لاختبار خصائص نمو السلالات الميكروبية وتشمل SGA 5،6، والشاشات المنافسة في المكتبات barcoded 11،12 وشاشات التقاط حركية الكثافة البصرية في لوحة القراء طيفية 10 التي تتلخص في الجدول رقم 2، ووصف أكثر في مكان آخر تماما 8 . يمكن التعامل معها QFA وألواح SGA، حيث الثقافات تنمو على السطوح الصلبة أجار (الأساليب القائمة على أجار، الجدول 2) بسرعة وسهولة عن طريق الروبوت. يتم تهوية جيدة الصلبة الثقافات سطح أجار طوال النمو والخلايا يمكن أن تنمو في الثقافات ثابت، مما يسمح للميكروبات مؤنس أن تنمو في المجتمع 14. تركت سليمة، والمجتمعات الميكروبية 1ffect الخاصة الصغيرة البيئات، وإفراز مواد سامة مثل الإيثانول، وربما يشير الى ما بين الخلايا. ومع ذلك، مستمرة اختلاط الثقافات السائل، واللازمة لتحقيق تهوية كافية، يعطل بشكل مصطنع المجتمعات الميكروبية والبيئات الصغيرة الخاصة بهم والتي قد تؤثر على وسائط نموها. عبر تلوث هو اقل مدعاة للقلق في طرق أجار الصلبة لأنه ليس هناك أقل فرصة لطخات تحمل خلايا السائل بين الثقافات. إذا تلوث يحدث من قبل الميكروبات المحمولة جوا الأجنبية في المقايسات أجار الصلبة، ويمكن في كثير من الأحيان يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص البصري لوحات أجار الصلبة واستأثرت أو إزالتها.

QFA الإنتاجية أعلى بكثير من الطرق الموازية السائل بطريقتين. بادئ ذي بدء، على لوحات (وSGA) QFA، معبأة الثقافات تلقيح معا بصورة أكثر كثافة، وإعطاء المزيد من الثقافات مستقلة لكل لوحة. في QFA هناك عادة 308 الثقافات، لا عد الثقافات حافة غير التجريبية (الشكل 1) COMقلص موازية لثقافات السائل مع 96 أو 100 لوحة لكل الثقافات. ثانيا، يمكن تحجيم تجارب QFA إلى عدد أكبر بكثير من لوحات. في حين يقتصر عدد من اللوحات التي تم تحليلها في تجربة واحدة فقط من قبل QFA المساحة المتوفرة في غرفة الحاضنة أو الحارة، إلا أن الحد الأدنى المسموح به تردد التقاط الصور، والحد الأقصى تردد القبض على تحقيقها، وعدد من لوحات في تجربة النمو سائل محدودة بقوة من قدرة القارئ لوحة (عادة واحد أو اثنين لوحات)، أو من مكدس تعلق على قارئ لوحة (عادة 25-50 لوحات). وقد قمنا مؤخرا بإجراء تجربة QFA مؤتمتة بالكامل على 123 لوحات، ولكل منها 308 الثقافات التجريبية، وإعطاء 37884 الثقافات في وقت واحد. نقدر أن العدد الأقصى للتحقيق مستقل من الثقافات المتزايد في السائل هو 96 (ثقافات / لوحة) × 50 (لوحات / مكدس) = 4800، والذي هو حوالي عشرة أضعاف أقل من الإنتاجية QFA لدينا. بديلا عن الشاشات ثقافة السائل هو للاستفادة من العديد الآلي غرووث الأجهزة في نفس الوقت (الجدول 1 من هذا الاستعراض من قبل بلومبرغ 8)، ولكل منها بطاقة واحدة أو اثنتين لوحات. التحكم في درجة الحرارة في كل جهاز مستقل، وهكذا ظروف ليست متطابقة، ولكن على افتراض أنهم، فإن هذا العمل يتطلب ما لا يقل عن 190 مثل هذه الأجهزة لتتناسب مع QFA الإنتاجية (على افتراض 200 الثقافات السائل في الجهاز).

وخلاصة القول، QFA هو سير العمل عالية الجودة والتي يمكن تطبيقها على نحو مفيد لجمع الظواهر النمو الكمي في كل من التجارب الصغيرة ركزت وشاشات عالية الإنتاجية. انها مرنة بما فيه الكفاية ليتم تطبيقها على نحو فعال مع اختلاف الاحتياجات من المعدات الآلية. ويستند العنصر الحسابية لسير العمل في QFA متاحة بحرية، وشفرة المصدر المفتوح.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نعترف بامتنان جميع أعضاء مختبرنا ومركز علم الأحياء النظام المتكامل للشيخوخة والتغذية (CISBAN) للحصول على الدعم ومناقشات مفيدة. وأيد هذه الدراسة عن طريق البحث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية المجلس (BBSRC) (BB/C008200/1) ويلكوم ترست (075294، 093088).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف / معدات شركة فهرس العدد تعليقات
طبق الاصل الحصان الرديء سيغما R-2508 96 دبوس دليل pintool مع 1/8 دبابيس قطر "
مزيج ماتي إيبندورف 5353 000.014
Biomek FX بيكمان A31842
Teleshake الحرارية العلمية 50095890 مثبتة على FX Biomek
BM3-SC S & P الروبوتات المؤتمر الوطني العراقي BM3-SC 192 الجرف الدورية دائري
spImager S & P الروبوتات المؤتمر الوطني العراقي spImager ارتفاع القرار دليل التصوير
spImager مع Cytomفي S & P الروبوتات المؤتمر الوطني العراقي عرف التحكم الآلي في درجة الحرارة التصوير عالية الدقة
Cytomat 6001 مع مبادل حراري الحرارية العلمية 51022222 تعلق على spImager
بفضل تكنولوجيا Ecoline RE207 لاودا RE207 تعلق على Cytomat
spImager مع دائري S & P الروبوتات المؤتمر الوطني العراقي عرف الآلي التصوير عالية الدقة
روبوت لاعبا اساسيا أداة دبوس لFP12pins V & P العلمية AFIX96FP12 N / A
96 × FP12 دبابيس V & P العلمية FP12 50.4 مم، 17 مم يتعرض طول دبوس
محطة لرسو السفن لأداة الدبوس V & P العلمية VP425 قاعدة لرسو السفن محطة إزالتها للسماح للتجفيف مروحة من الدبابيس
دبوس فرشاة تنظيف V & P العلمية VP425 N / A
طبق الاصل الحصان الرديء سيغما R-2508 دليل دبوس أداة
نونك OmniTray مع غطاء نونك 734-0490 N / A
96 لوحات البوليسترين معقم جيد غرينر BioOne 655161 N / A
96 الأغطية البوليسترين معقم جيد غرينر BioOne 656171 N / A

الجدول 3. الكواشف معينة والمعدات.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects. PLoS Genetics. 7 (4), e1001362(2011).
  2. Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 180, 2251-2266 (2008).
  3. Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar. BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).
  4. Colonyzer - Image analysis software [Internet]. , Newcastle University. Newcastle, UK. Available from: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/ (2012).
  5. Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
  6. Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  7. qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. , University of Vienna. Vienna, Austria. Available from: http://qfa.r-forge.r-project.org/ (2012).
  8. Blomberg, A. Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping. Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).
  9. Maringele, L., Lydall, D. EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants. Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).
  10. Warringer, J., Blomberg, A. Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 20, 53-67 (2003).
  11. Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320 (5874), 362-365 (2008).
  12. Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries. J. Vis. Exp. (54), e2864(2011).
  13. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).
  14. Queller, C. Behavioural ecology: The social side of wild yeast. Nature. 456, 589-590 (2008).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Quantitative Fitness AnalysisMicrobial Culture FitnessGrowth Curve AnalysisSolid Agar PlatesAutomated ImagingGenetic Interaction ScreeningYeast Deletion CollectionColonizer SoftwareLogistic Population ModelFitness Measurement

مقالات ذات صلة