في هذا البروتوكول وصفنا الإنتاج، وتنقية ومعايرة ناقلات lentiviral. ونحن نقدم مثالا على lentiviral إيصال الجينات ناقلات بوساطة في الخلايا العصبية مثقف الابتدائي والنجمية. وقد طرقنا تنطبق أيضا على أنواع الخلايا الأخرى في المختبر و في الجسم الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
انتاج ناقلات Lentiviral للخلايا Transducing من الجهاز العصبي المركزي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد التوصيل الفعال للجينات في الجهاز العصبي المركزي (CNS) أمراً هاماً في دراسة وظائف الجينات، ونمذجة الأمراض العصبية، وتطوير النهج العلاجية. وتعتبر النواقل الفيروسية البطيئة (Lentiviral vectors) أدوات جذابة في نقل الجينات إلى الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى في الجهاز العصبي المركزي، نظراً لقدرتها على نقل الجينات إلى الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة على حد سواء، ودعم التعبير المستدام للجينات المنقولة، فضلاً عن امتلاكها سعة تغليف كبيرة نسبياً وسمية منخفضة 1-3. وقد استُخدمت النواقل الفيروسية البطيئة بنجاح في نقل الجينات إلى العديد من أنواع الخلايا العصبية in vitro 4-6 وفي الحيوانات 7-10.
بُذلت جهود كبيرة لتطوير ناقلات فيروسية بطيئة (lentiviral vectors) تتميز بسلامة حيوية وكفاءة محسنة في نقل الجينات. وتوضح Figure 1 الجيل الثالث الحالي من الناقلات الفيروسية البطيئة المعيبة في التضاعف وذاتية التعطيل (SIN). يتم تقسيم العناصر المطلوبة لتعبئة الناقل إلى أربعة بلازميدات. في بلازميد النقل الفيروسي البطيء، يتم استبدال منطقة U3 في التكرار الطرفي الطويل (LTR) عند الطرف 5' بمحفز قوي من فيروس آخر. يسمح هذا التعديل بنسخ تسلسل الناقل بشكل مستقل عن بروتين HIV-1 Tat الذي يكون مطلوبًا عادةً للتعبير عن جينات HIV 11. وتعد إشارة التعبئة (Ψ) ضرورية للتغليف، بينما يكون العنصر المستجيب لـ Rev (RRE) مطلوبًا لإنتاج ناقلات ذات عيار مرتفع. أما مسار البوليبورين المركزي (cPPT) فهو مهم للاستيراد النووي لحمض DNA الخاص بالناقل، وهي ميزة مطلوبة لنقل الجينات إلى الخلايا غير المنقسمة 12. وفي التكرار الطرفي الطويل (LTR) عند الطرف 3'، تتم إزالة التسلسلات التنظيمية (cis-regulatory sequences) تمامًا من منطقة U3. ويتم نسخ هذا الحذف إلى LTR عند الطرف 5' بعد عملية النسخ العكسي، مما يؤدي إلى التعطيل النسخي لكلا التكرارين الطرفيين (LTRs). يحتوي البلازميد pMDLg/pRRE على جينات HIV-1 gag/pol، التي توفر البروتينات الهيكلية وإنزيم النسخ العكسي. ويقوم pRSV-Rev بتشفير Rev الذي يرتبط بـ RRE لضمان التصدير الفعال لـ RNA من النواة. بينما يقوم pCMV-G بتشفير البروتين السكري لفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G) الذي يحل محل HIV-1 Env. ويعمل VSV-G على توسيع النطاق المضيف (tropism) للناقلات ويسمح بتركيزها عبر الطرد المركزي الفائق 13. وقد تم استبعاد جميع الجينات التي تشفر البروتينات المساعدة، بما في ذلك Vif وVpr وVpu وNef، من نظام التعبئة. يجب أن يتم إنتاج ومعالجة الناقلات الفيروسية البطيئة وفقًا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) الخاصة بالأبحاث التي تتضمن DNA معاد التركيب (http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf). قد يكون الحصول على موافقة من لجنة السلامة البيولوجية والكيميائية المؤسسية الفردية مطلوبًا قبل استخدام الناقلات الفيروسية البطيئة. تُنتج الناقلات الفيروسية البطيئة عادةً عن طريق التعدي المشترك (cotransfection) لخلايا 293T مع بلازميد النقل الفيروسي البطيء والبلازميدات المساعدة التي تشفر البروتينات المطلوبة لتعبئة الناقل. يمكن الحصول على العديد من بلازميدات النقل الفيروسية البطيئة والبلازميدات المساعدة من Addgene، وهو مستودع بلازميدات غير ربحي (http://www.addgene.org/). تم تطوير بعض الخطوط الخلوية المستقرة للتعبئة، ولكن هذه الأنظمة توفر مرونة أقل وتنخفض كفاءة التعبئة فيها عمومًا بمرور الوقت 14, 15. قد تدعم أطقم التعدي (transfection kits) المتاحة تجاريًا كفاءة عالية في التعدي 16، ولكنها قد تكون مكلفة للغاية لتحضيرات الناقلات على نطاق واسع. توفر طرق الترسيب بفوسفات الكالسيوم تعديًا عالي الكفاءة لخلايا 293T، وبالتالي توفر نهجًا موثوقًا وفعالًا من حيث التكلفة لإنتاج الناقلات الفيروسية البطيئة.
في هذا البروتوكول، نقوم بإنتاج ناقلات فيروسية بطيئة (lentiviral vectors) عن طريق التعداء المشترك (cotransfection) لخلايا 293T بأربعة بلازميدات بناءً على مبدأ ترسيب فوسفات الكالسيوم، يليه التنقية والتركيز باستخدام الطرد المركزي الفائق عبر وسادة سكروز بتركيز 20%. يتم تحديد عيارات الناقلات عن طريق تحليل فرز الخلايا المنشط بالفلورية (FACS) أو عن طريق qPCR في الوقت الحقيقي. يمكن إتمام عملية إنتاج وتعيير الناقلات الفيروسية البطيئة في هذا البروتوكول خلال 9 أيام. ونقدم مثالاً على نقل هذه الناقلات إلى مستنبتات القشرة الحديثة الفأرية التي تحتوي على كل من العصبونات والخلايا النجمية. كما نوضح أن الناقلات الفيروسية البطيئة تدعم كفاءة عالية في النقل وتعبيرًا جينيًا نوعيًا حسب نوع الخلية في الخلايا المستنبتة الأولية من الجهاز العصبي المركزي (CNS).
البروتوكول
1. التعبئة والتغليف من ناقلات Lentiviral
ويتم إنتاج النواقل Lentiviral بواسطة cotransfection من ناقلات نقل lentiviral والبلازميدات الأخرى اللازمة للتغليف في الخلايا 293T بواسطة فوسفات الكالسيوم طريقة ترنسفكأيشن. نحن نستخدم 10 زراعة الأنسجة 100 ملم أطباق في هذا البروتوكول. يمكن زيادتها إلى أعلى أو إلى أسفل اعتمادا على التطبيقات. يتم الحفاظ على خط خلية 293T في النسور Dulbecco والمتوسطة معدلة (DMEM) مع ارتفاع نسبة الجلوكوز (4500 ملغم / لتر)، على أن تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، والوحدات 100 / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين في 37 درجة مئوية حا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول، لقد أظهرنا إنتاج النواقل lentiviral وتطبيق هذه النواقل في الثقافات القشرة المخية الحديثة. أثبتنا كفاءة وخلية نوع محدد تنبيغ مع الناقلة التي تنتجها هذه الأساليب. عندما يتم استخدام المروج synapsin، GFP التعبير بدقة الخلايا العصبية المحددة. عندما يتم استخدام المروج GFAP، GFP التعبير هي حصرا في الخلايا النجمية. إذا لم يكن يحتاج خلية نوع محدد التعبير، قد يتم استخدام أحد المروجين في كل مكان. وجدنا كلا ubiqutin وكيناز فسفوغليسرات (PGK) المروجين يمكن أن تدفع ارتفاع مستو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح العلوم العصبية الأساسية مخطط (P30 NS057105، المدارس الأردنية البريطانية) لجامعة واشنطن، برنامج مشروع المنح NS032636 (المدارس الأردنية البريطانية)، ومركز الأمل للاضطرابات العصبية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | |
| DMEM | سيغما الدريخ | D5796 | |
| MEM | إينفيتروجن | 11090-081 | |
| مصل بقري جنيني | Hyclone | SV3001403 | |
| برنامج تلفزيوني | Mediatech | 21-040-CM | |
| التربسين-EDTA | سيغما الدريخ | T3924 | |
| الصوديوم الزبدات | سيغما الدريخ | B5887 | |
| Hexadimethrine بروميد (Polybrene) | سيغما الدريخ | H9268 | |
| 293T الخلايا | ATCC | CRL-11268 | |
| HT1080 الخلايا | ATCC | CCL-121 | |
| فالكون 100 × 20 ملم أنسجة الثقافةه طبق | العلوم البيولوجية دينار بحريني | 353003 | |
| 1 × 3 ½ في أنبوب الطرد المركزي polyallomoer | بيكمان كولتر، | 326823 | |
| 0.2 ميكرون حقنة فلتر | كورنينج | 431219 | |
| QIAamp DNA البسيطة كيت | QIAGEN | 51304 |
المراجع
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
