يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

انتاج ناقلات Lentiviral للخلايا Transducing من الجهاز العصبي المركزي

36.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4031

⸱

مايو 24, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Neurology and Hope Center for Neurological Disorders, Washington University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

في هذا البروتوكول وصفنا الإنتاج، وتنقية ومعايرة ناقلات lentiviral. ونحن نقدم مثالا على lentiviral إيصال الجينات ناقلات بوساطة في الخلايا العصبية مثقف الابتدائي والنجمية. وقد طرقنا تنطبق أيضا على أنواع الخلايا الأخرى في المختبر و في الجسم الحي.

الملخص

يعد التوصيل الفعال للجينات في الجهاز العصبي المركزي (CNS) أمراً هاماً في دراسة وظائف الجينات، ونمذجة الأمراض العصبية، وتطوير النهج العلاجية. وتعتبر النواقل الفيروسية البطيئة (Lentiviral vectors) أدوات جذابة في نقل الجينات إلى الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى في الجهاز العصبي المركزي، نظراً لقدرتها على نقل الجينات إلى الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة على حد سواء، ودعم التعبير المستدام للجينات المنقولة، فضلاً عن امتلاكها سعة تغليف كبيرة نسبياً وسمية منخفضة 1-3. وقد استُخدمت النواقل الفيروسية البطيئة بنجاح في نقل الجينات إلى العديد من أنواع الخلايا العصبية in vitro 4-6 وفي الحيوانات 7-10.

بُذلت جهود كبيرة لتطوير ناقلات فيروسية بطيئة (lentiviral vectors) تتميز بسلامة حيوية وكفاءة محسنة في نقل الجينات. وتوضح Figure 1 الجيل الثالث الحالي من الناقلات الفيروسية البطيئة المعيبة في التضاعف وذاتية التعطيل (SIN). يتم تقسيم العناصر المطلوبة لتعبئة الناقل إلى أربعة بلازميدات. في بلازميد النقل الفيروسي البطيء، يتم استبدال منطقة U3 في التكرار الطرفي الطويل (LTR) عند الطرف 5' بمحفز قوي من فيروس آخر. يسمح هذا التعديل بنسخ تسلسل الناقل بشكل مستقل عن بروتين HIV-1 Tat الذي يكون مطلوبًا عادةً للتعبير عن جينات HIV 11. وتعد إشارة التعبئة (Ψ) ضرورية للتغليف، بينما يكون العنصر المستجيب لـ Rev (RRE) مطلوبًا لإنتاج ناقلات ذات عيار مرتفع. أما مسار البوليبورين المركزي (cPPT) فهو مهم للاستيراد النووي لحمض DNA الخاص بالناقل، وهي ميزة مطلوبة لنقل الجينات إلى الخلايا غير المنقسمة 12. وفي التكرار الطرفي الطويل (LTR) عند الطرف 3'، تتم إزالة التسلسلات التنظيمية (cis-regulatory sequences) تمامًا من منطقة U3. ويتم نسخ هذا الحذف إلى LTR عند الطرف 5' بعد عملية النسخ العكسي، مما يؤدي إلى التعطيل النسخي لكلا التكرارين الطرفيين (LTRs). يحتوي البلازميد pMDLg/pRRE على جينات HIV-1 gag/pol، التي توفر البروتينات الهيكلية وإنزيم النسخ العكسي. ويقوم pRSV-Rev بتشفير Rev الذي يرتبط بـ RRE لضمان التصدير الفعال لـ RNA من النواة. بينما يقوم pCMV-G بتشفير البروتين السكري لفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G) الذي يحل محل HIV-1 Env. ويعمل VSV-G على توسيع النطاق المضيف (tropism) للناقلات ويسمح بتركيزها عبر الطرد المركزي الفائق 13. وقد تم استبعاد جميع الجينات التي تشفر البروتينات المساعدة، بما في ذلك Vif وVpr وVpu وNef، من نظام التعبئة. يجب أن يتم إنتاج ومعالجة الناقلات الفيروسية البطيئة وفقًا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) الخاصة بالأبحاث التي تتضمن DNA معاد التركيب (http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf). قد يكون الحصول على موافقة من لجنة السلامة البيولوجية والكيميائية المؤسسية الفردية مطلوبًا قبل استخدام الناقلات الفيروسية البطيئة. تُنتج الناقلات الفيروسية البطيئة عادةً عن طريق التعدي المشترك (cotransfection) لخلايا 293T مع بلازميد النقل الفيروسي البطيء والبلازميدات المساعدة التي تشفر البروتينات المطلوبة لتعبئة الناقل. يمكن الحصول على العديد من بلازميدات النقل الفيروسية البطيئة والبلازميدات المساعدة من Addgene، وهو مستودع بلازميدات غير ربحي (http://www.addgene.org/). تم تطوير بعض الخطوط الخلوية المستقرة للتعبئة، ولكن هذه الأنظمة توفر مرونة أقل وتنخفض كفاءة التعبئة فيها عمومًا بمرور الوقت 14, 15. قد تدعم أطقم التعدي (transfection kits) المتاحة تجاريًا كفاءة عالية في التعدي 16، ولكنها قد تكون مكلفة للغاية لتحضيرات الناقلات على نطاق واسع. توفر طرق الترسيب بفوسفات الكالسيوم تعديًا عالي الكفاءة لخلايا 293T، وبالتالي توفر نهجًا موثوقًا وفعالًا من حيث التكلفة لإنتاج الناقلات الفيروسية البطيئة.

في هذا البروتوكول، نقوم بإنتاج ناقلات فيروسية بطيئة (lentiviral vectors) عن طريق التعداء المشترك (cotransfection) لخلايا 293T بأربعة بلازميدات بناءً على مبدأ ترسيب فوسفات الكالسيوم، يليه التنقية والتركيز باستخدام الطرد المركزي الفائق عبر وسادة سكروز بتركيز 20%. يتم تحديد عيارات الناقلات عن طريق تحليل فرز الخلايا المنشط بالفلورية (FACS) أو عن طريق qPCR في الوقت الحقيقي. يمكن إتمام عملية إنتاج وتعيير الناقلات الفيروسية البطيئة في هذا البروتوكول خلال 9 أيام. ونقدم مثالاً على نقل هذه الناقلات إلى مستنبتات القشرة الحديثة الفأرية التي تحتوي على كل من العصبونات والخلايا النجمية. كما نوضح أن الناقلات الفيروسية البطيئة تدعم كفاءة عالية في النقل وتعبيرًا جينيًا نوعيًا حسب نوع الخلية في الخلايا المستنبتة الأولية من الجهاز العصبي المركزي (CNS).

البروتوكول

1. التعبئة والتغليف من ناقلات Lentiviral

ويتم إنتاج النواقل Lentiviral بواسطة cotransfection من ناقلات نقل lentiviral والبلازميدات الأخرى اللازمة للتغليف في الخلايا 293T بواسطة فوسفات الكالسيوم طريقة ترنسفكأيشن. نحن نستخدم 10 زراعة الأنسجة 100 ملم أطباق في هذا البروتوكول. يمكن زيادتها إلى أعلى أو إلى أسفل اعتمادا على التطبيقات. يتم الحفاظ على خط خلية 293T في النسور Dulbecco والمتوسطة معدلة (DMEM) مع ارتفاع نسبة الجلوكوز (4500 ملغم / لتر)، على أن تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، والوحدات 100 / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين في 37 درجة مئوية حاضنة مع 5٪ CO 2.

  1. البذور 293T الخلايا في التقاء 30-40٪ إلى 10 100 ملم أطباق زراعة الأنسجة (3 × 10 6 خلية / طبق) في ثقافة المتوسط. عودة إلى الخلايا الحاضنة.
  2. بعد ثقافة ح 20-24، والتحقق من كثافة الخلية. وينبغي أن الخلايا تكون حوالي 80٪ التقاء في وقت ترنسفكأيشن.
  3. يعد أنبوب 50 مل. إضافة 4.4 مل TE79/10 (1 ملم TrisHCl، 0.1 مليEDTA، ودرجة الحموضة 7.9) ناقص مجموع حجم الحمض النووي للبلازميد التالية. إضافة 100 ميكروغرام نقل lentiviral البلازميد (الشكل 1)، و 58 ميكروغرام pMDLg / pRRE، 31 ميكروغرام pCMV-G، 25 ميكروغرام pRSV، القس، 600 ميكروليتر 2M CaCl 2. اخلطي برفق.
  4. إعداد أنبوب آخر 50 مل. إضافة 5 مل 2X HBS (0.05 HEPES متر، 0.28 متر كلوريد الصوديوم، 1.5 مم نا 2 هبو 4، ودرجة الحموضة 7.12).
  5. أخذ الحمض النووي CaCl 2 خليط بنسبة 10 مل ماصة وإضافة إلى أنبوب يحتوي على 2 × HBS، قطرة قطرة بينما vortexing الأنبوب.
  6. الحفاظ على رد فعل هطول الأمطار في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة.
  7. إزالة أطباق ثقافة من الحاضنة. خلط رد فعل هطول الأمطار بشكل جيد من قبل vortexing. إضافة 1 مل من التعليق على كل الخلايا طبق 100 ملم تحتوي على. ويجب ان يضاف تعليق ببطء، في حين يحوم نقطه نقطه بلطف المتوسطة في طبق. عودة هذه الأطباق إلى الحاضنة وتترك لمدة 5 ساعات.
  8. إزالة المتوسطة من الثقافة. إضافة 6 مل المتوسطة ثقافة جديدة تحتوي على 6 ملم بو الصوديومtyrate إلى كل طبق. عودة إلى حاضنة للثقافات. بعد ثقافة بين عشية وضحاها، اذا كان هناك مراسل فلوري في التصور، والتحقق من مراسل التعبير الجيني تحت المجهر الفلورسنت. عادة، أكثر من 80٪ من الخلايا التعبير عن الجين المراسل إذا كان مدفوعا من قبل أحد المروجين في كل مكان (مثل CMV المروج).
  9. يومين (40-44 ساعة) بعد ترنسفكأيشن، جمع طاف في الفترة من 10 إلى أطباق أنابيب 50 مل 2 (حوالي 30 مل كل أنبوب). تجميد طاف في -80 درجة مئوية الثلاجة أو انتقل إلى الخطوة التالية.

2. تركيز وتنقية المتجهات

  1. أجهزة الطرد المركزي والتي تم جمعها طازجة أو إذابة طاف ب 900 غرام (حوالي 2000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة لإزالة أي حطام خلية في طاف.
  2. تعلق حقنة 60 مل إلى 0.2 ميكرون فلتر حقنة SFCA. نقل طاف من 50 مل أنبوب إلى الحقنة. تصفية طاف في polyallomer أنبوب الطرد المركزي.
  3. تأخذ 5 مل السكروز 20٪ (على استعداد في برنامج تلفزيوني) حتى في ماصة 5 مل. أدخلماصة إلى الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على طاف. إضافة ببطء في حل السكروز تحت طاف ناقلات. كرر هذه الخطوات لطاف من أنبوب آخر.
  4. منبذة طاف في 11000 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات مع الدوار بيكمان سوينغ SW28.
  5. إزالة طاف. إضافة 150 ميكروليتر اللاكتوز 4٪ (على استعداد في PBS) إلى كل أنبوب للطرد المركزي. Resuspend الكريات.
  6. نقل الناقل مركزة من جميع أنابيب الطرد المركزي لأنبوب 1.5 مل. ترك الأنبوب على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  7. خلط تعليق بواسطة ناقلات pipetting. تدور مع microcentrifuge بأقصى سرعة (حوالي 16000 ز) لمدة 1 دقيقة.
  8. طاف نقل إلى أنبوب 1.5 مل جديد. تقسيم العينة النهائية في 20 aliquots ميكرولتر وخزنها في الثلاجة -80 درجة مئوية.

3. معايرة ناقلات

  1. البذور 5 × 10/4 أيضا من HT1080 الخلايا في 12 لوحة جيدا في 1 حبة متوسطة الحجم DMEM مل تستكمل مع FBS 10٪.
  2. بعد overnigحزب التحرير والثقافة، وتعول الخلايا من بئر واحدة ويسجل عدد الخلايا.
  3. جعل 5 أضعاف تخفيف مسلسل (1:5، 1: 25؛ 1:125، و 1:625) من ناقلات المركزة مع الثقافة المتوسطة. إضافة أنا ميكرولتر من كل ناقلات المخفف إلى آبار منفصلة. ويمكن تكرار هذه العينات لزيادة دقة.
  4. إضافة 1 ميكروليتر 4 ملغ / مل Polybrene (Hexadimethrine الميثيل) في كل متجه تحتوي بشكل جيد وفي بئر بدون ناقلات. مزيج من قبل يهز بلطف لوحة. العودة إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة.
  5. إزالة المتوسطة من الآبار ثقافة الخلية. يغسل جيدا مع كل برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكروليتر 1X trypsine-EDTA حل لهذه الخلايا. عندما يتم فصل الخلايا (3-5 دقيقة)، إضافة 1 مل الثقافة المتوسطة. Resuspend الخلايا بواسطة pipetting. نقل تعليق خلية إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي.
  6. الطرد المركزي في 900 غ لمدة 6 دقائق. لنواقل مع جين مراسل فلوري (على سبيل المثال GFP)، انتقل إلى الخطوة 3.7 لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. لنواقل بدون مراسل، انتقل إلى الخطوة 3.8 لqPCR الوقت الحقيقي.
  7. لنواقل تحتوي على fluorescent الجين المراسل، وإزالة طاف وresuspend وبيليه مع 300 ميكرولتر من الفورمالدهايد 3.7٪ في برنامج تلفزيوني. تحديد نسبة الخلايا مراسل إيجابي عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. وسيتم تمثيل وحدات عيار تنبيغ في المليلتر المركزة ناقلات (TU / مل).

figure-protocol-1

على سبيل المثال، إذا كان transduced 1 × 10 5 الخلايا مع ميكروليتر 1/25 (0.04 ميكرولتر) النواقل والخلايا 30٪ من مراسل إيجابي، سوف يكون من عيار:

figure-protocol-2

فقط استخدام التخفيفات تقع في وجود علاقة خطية بين النسبة المئوية للخلايا إيجابية وكمية ناقلات وأضاف لحساب عيار. يجب أن يكون عيار النهائي في المتوسط ​​من التتر تم الحصول عليها من transductions من لا يقل عن 2 كميات مختلفة من الناقل.

  1. لنواقل دونفلوري مراسل الجينات، واستخراج الحمض النووي الجيني من HT1080 الخلايا باستخدام الحمض النووي QIAamp البسيطة كيت (QIAGEN) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تضخيم تسلسل ناقلات في الحمض النووي الجيني باستخدام ABI بريزم الكشف عن تسلسل 7000 نظام (النظم البيولوجية التطبيقية) مع الاشعال (HIV-1 في منطقة PBS / PSI 17) 5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 "و 5'-3-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT '، ومسبار TaqMan 5 '-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-طمرة-3 ". وقد تضخمت أيضا الجين الزلال الذي هو نسخة واحدة الجينات في الجينوم (2 نسخة / خلية) مع 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 الاشعال "و5'-3-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT '، وتحقيق 5'-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-3-طمرة 'باعتبارها الرقابة الداخلية. تحديد أعداد نسخة من النواقل والزلال بواسطة PCR في لوحة 96-جيدا وفقا لتعليمات تصنيع مع البرنامج التالي: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، و 35 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عشرة أضعاف التخفيفات المسلسل من البلازميدات من تركيز معروف (ممثلة نسخةعدد) التي تحتوي على وينبغي أيضا تسلسل قالب يتم تضخيمها لخلق منحنى القياسية لتقدير حجم العينات غير معروف. وسيتم تمثيل عيار وحدات التكامل في المليلتر المركزة ناقلات (وحدة دولية / مل).

figure-protocol-3

4. تنبيغ من الثقافات القشرة المخية الحديثة

وتعد الثقافات القشرة المخية الحديثة تحتوي على كل من الخلايا العصبية والدبقية من القشور فأر باستخدام إجراء الطلاء على مرحلتين كما هو موضح سابقا 18. ومطلي Neocortices تم الحصول عليها من الأجنة في الفئران الحمل أيام 14-16 على أحادي الطبقة 1 الدبقية المحددة سابقا في الفنزويلية استكمال FBS 10٪، 20 ملم والجلوكوز الجلوتامين 2 ملم في 24-جيدا نسيج لوحة الثقافة.

  1. بعد 5 أيام في المختبر، إضافة 10 ميكرومتر السيتوزين الأرابينوزيد (آرا-C) في neocثقافة ortical لمنع عدم انقسام الخلايا العصبية. تواصل ثقافة الخلايا لمدة 2 ايام.
  2. دافئ الثقافة المتوسطة في 37 درجة مئوية ماء الحمام ل5-10 دقيقة. استبدال آرا-C تحتوي على المتوسط ​​مع الثقافة المتوسطة الطازجة (500 ميكروليتر / جيد).
  3. إضافة ناقلات مع وزارة الداخلية المطلوب (تعدد عدوى، ونسبة من عدد الجسيمات الموجه إلى عدد الخلايا المستهدفة) للثقافة. تواصل الثقافة لمدة 24 ساعة. نحن نستخدم وزارة الداخلية من 1-10 (5 عادة) في الثقافات القشرية الأولية.
  4. استبدال الثقافة المتوسطة مع المتوسطة الطازجة. تواصل ثقافة. إذا كان هناك جينات مراسل في التركيبة ناقلات، والتحقق من الخلايا تحت المجهر الفلورسنت 2 بعد أيام تنبيغ. وسوف مراسل التعبير الجيني في الخلايا العصبية تكون مرئية 2-7 بعد تنبيغ، اعتمادا على تصميم ناقلات والجرعة المستخدمة.

5. ممثل النتائج

والتتر من ناقلات lentiviral المنتجة مع هذا النطاق بروتوكول 10 8 -10 10 وحدة دولية / مل، whicح هي مناسبة لتنبيغ من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا من الجهاز العصبي المركزي على حد سواء في التجارب المختبرية والحية. الجدول رقم 1 ورقم 2 وتظهر نتيجة لممثل باستخدام ناقلات التي ينتجها هذا البروتوكول. نحن transduced الثقافات القشرة المخية الحديثة الفئران مع ناقلات lentiviral التعبير عن بروتين فلوري الخضراء (GFP) التي تسيطر عليها المروج (SYN) synapsin أو الغروية بروتين حمضي لييفي المروج (GFAP). سبعة أيام بعد تنبيغ، أجرينا المناعية إلى الخلايا العصبية والخلايا النجمية التسمية مع أضداد NeuN ومكافحة GFAP، على التوالي. كما هو مبين في الجدول 1 والشكل. 2A، بعد تنبيغ مع ناقلات تحمل المروج synapsin، أكثر من 90٪ من الخلايا العصبية (NeuN + الخلايا) صريحة GFP والنجمية رقم (GFAP + الخلايا) التعبير عن هذا الجين المراسل. عندما يتم استخدام المروج GFAP في التركيبة ناقلات (الشكل 2B)، حوالي 80٪ من الخلايا النجمية (GFAP + الخلايا) EXPRESق GFP؛ جميع + الخلايا النجمية هي GFP كما أكده colocalization مع GFAP وغياب التعبير GFP في الخلايا NeuN المسمى. هذه النتائج تثبت أن ناقلات lentiviral هي فعالة جدا لتوصيل الجينات المحورة إلى خلايا من الجهاز العصبي المركزي وخلية محددة التعبير الجيني يمكن أن يتحقق عندما يتم استخدام المروجين المناسبة.

figure-protocol-4
الشكل 1. التمثيل التخطيطي من فيروس نقص المناعة البشرية القائمة على المتجهات lentiviral والبلازميدات التعبئة والتغليف. ويرد-1 فيروس نقص المناعة البشرية طليعة الفيروس في الأعلى. يتم فصل العناصر لإنتاج متجه إلى أربع البلازميدات المختلفة. نقل lentiviral البلازميد يحتوي على هجين 5 'LTR التي يتم استبدال منطقة U3 مع المضخم للخلايا (CMV) مروج، إشارة التعبئة والتغليف (ψ)، وتسلسل RRE، المسالك polypurine المركزية (cPPT)، الجين من الفائدة (على سبيل المثال مراسل فلوري) جنبا إلى جنب مع أحد المروجين من خيار، وLTR 3 'فيهتتم إزالة تماما متواليات التنظيمية لرابطة الدول المستقلة من منطقة U3. pMDLg / pRRE يحتوي على هفوة والجينات بول وتسلسل RRE من HIV-1 تحت سيطرة المروج CMV. pRSV-القس يحتوي على تسلسل ترميز القس مدفوعا المروج RSV. pCMV-G تحتوي على جينات بروتين VSV الجميع تحت سيطرة المروج CMV. السلطة الفلسطينية يشير إلى إشارة تذييل بعديد الأدينيلات من الجينات β-غلوبين الإنسان.

figure-protocol-5
الشكل 2. transduced التعبير عن الجينات صحافي في ثقافة مختلطة الماوس القشرة المخية الحديثة مع ناقلات lentiviral تحمل خلية نوع محدد المروجين. وtransduced والثقافات مع LV-SYN-GFP (A) أو LV-GFAP-GFP ناقلات (B) في وزارة الداخلية من 5. سبعة أيام بعد تنبيغ، وimmunostained الخلايا مع الجسم المضاد المضادة للNeuN أو المضادة GFAP. لوحات تظهر العلوي GFP مضان، لوحات تظهر وسط المناعية ويتم دمج أدنى لوحات الصور (GFP: الأخضر؛ NeuN أو GFAP: أحمر).

ناقلات GFP + الخلايا في الخلايا العصبية GFP + في الخلايا النجمية
LV-SYN-GFP 92.2 ± 7.3 0
LV-GFAP-GFP 0 78،3 ± 11،5

الجدول رقم 1. transduced مقارنة التعبير GFP في الثقافات القشرة المخية الحديثة الفئران مع ناقلات تحمل lentiviral المروجين مختلف 1.
وtransduced 1 الثقافات الفئران القشرة المخية الحديثة (5 × 10 5 / جيد في 24 لوحة جيد) مع LV-SYN-GFP أو LV-GFAP GFP-1 في وزارة الداخلية من 5. سبعة أيام بعد تنبيغ، وثبتت الثقافات وimmunostained لNeuN أو GFAP. احصي عدد الخلايا GFP وNeuN / GFAP التعبير في الصور من 10 حقول في حالة تجريبية. القيم تمثل نسبة مئوية من الخلايا العصبية (NeuN + الخلايا) أوالنجمية (GFAP + الخلايا) الذي أعرب أيضا عن الجينات مراسل GFP. قيم أظهرت وسائل ± SD من ثلاث تجارب مستقلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول، لقد أظهرنا إنتاج النواقل lentiviral وتطبيق هذه النواقل في الثقافات القشرة المخية الحديثة. أثبتنا كفاءة وخلية نوع محدد تنبيغ مع الناقلة التي تنتجها هذه الأساليب. عندما يتم استخدام المروج synapsin، GFP التعبير بدقة الخلايا العصبية المحددة. عندما يتم استخدام المروج GFAP، GFP التعبير هي حصرا في الخلايا النجمية. إذا لم يكن يحتاج خلية نوع محدد التعبير، قد يتم استخدام أحد المروجين في كل مكان. وجدنا كلا ubiqutin وكيناز فسفوغليسرات (PGK) المروجين يمكن أن تدفع ارتفاع مستو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح العلوم العصبية الأساسية مخطط (P30 NS057105، المدارس الأردنية البريطانية) لجامعة واشنطن، برنامج مشروع المنح NS032636 (المدارس الأردنية البريطانية)، ومركز الأمل للاضطرابات العصبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد
DMEM سيغما الدريخ D5796
MEM إينفيتروجن 11090-081
مصل بقري جنيني Hyclone SV3001403
برنامج تلفزيوني Mediatech 21-040-CM
التربسين-EDTA سيغما الدريخ T3924
الصوديوم الزبدات سيغما الدريخ B5887
Hexadimethrine بروميد (Polybrene) سيغما الدريخ H9268
293T الخلايا ATCC CRL-11268
HT1080 الخلايا ATCC CCL-121
فالكون 100 × 20 ملم أنسجة الثقافةه طبق العلوم البيولوجية دينار بحريني 353003
1 × 3 ½ في أنبوب الطرد المركزي polyallomoer بيكمان كولتر، 326823
0.2 ميكرون حقنة فلتر كورنينج 431219
QIAamp DNA البسيطة كيت QIAGEN 51304

المراجع

  1. Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  2. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
  3. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
  4. Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
  5. Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
  6. Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
  7. Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
  8. Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
  9. Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
  10. Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
  11. Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
  12. Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
  13. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
  14. Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
  15. Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
  16. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499(2009).
  17. Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
  18. Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
  19. Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
  20. Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
  21. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  22. Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10(2009).
  23. Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
  24. Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
  25. Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
  26. Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
  27. Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
  28. Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

FACS qPCR 293T
انتاج ناقلات Lentiviral للخلايا Transducing من الجهاز العصبي المركزي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.