مقالة منهجية

Wholemount المناعية للكشف عن تضاريس دماغية معقدة

15.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4042

⸱

أبريل 5, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University , 2Department of Cell Biology and Anatomy and the Hotchkiss Brain Institute, Faculty of Medicine, University of Calgary

في هذه المقالة

ملخص

ويتم تنظيم الطوبوغرافي الدوائر العصبية في المقصورات وظيفي مع التشكيلات الجزيئية محددة. هنا، ونحن نقدم الخطوات العملية والتقنية للكشف عن العالمية تضاريس الدماغ باستخدام تنوعا wholemount نهج تلطيخ المناعى. نحن إثبات فائدة من طريقة استخدام التهندس الخلوي مفهومة جيدا والدوائر المخيخ.

الملخص

بنية متكررة ومفهومة جيدا الخلوية من المخيخ جعله نظاما نموذج مثالي لاستكشاف تضاريس الدماغ. الكامنة وراء التهندس الخلوي بصورة موحدة نسبيا هي مجموعة معقدة من المجالات مجاور للسهمي من الجينات والبروتينات. وينعكس هذا التقسيم الجزيئية للمخيخ من قبل المنظمة التشريحية والوظيفية للألياف وارد. لنقدر تماما مدى تعقيد منظمة المخيخ نحن صقلها من قبل نهج تلطيخ wholemount لتحليل إنتاجية عالية من العيوب الزخرفة في المخيخ الماوس. هذا البروتوكول يصف بالتفصيل الكواشف، والأدوات، والخطوات العملية التي هي مفيدة للكشف عن أنماط التعبير بنجاح بروتين في المخيخ فأر بالغ باستخدام wholemount المناعية. سلط الضوء على خطوات تثبت هنا فائدة هذه الطريقة تستخدم للتعبير عن zebrinII / aldolaseC كمثال على الكيفية التي يمكن بها كشف تضاريس الدقيقة للدماغ في تقريرهاأصلي ثلاثي الأبعاد التشكل. كما وصفت هي التعديلات على البروتوكول الذي يسمح لتصور من بروتين تعبير وارد في التوقعات ومخيخات كبير للدراسات المقارنة للالتضاريس الجزيئية. لتوضيح هذه التطبيقات، يتم تضمين البيانات من تلطيخ وارد من المخيخ الفئران.

البروتوكول

1. الإرواء الحيوانية والتشريح المخيخ

  1. اعتمادا على البروتين، قد نضح تكون ضرورية ل1،2 تلطيخ ناجحة. Transcardiac نضح هو الغازية، وعدم بقاء الإجراء الذي يتطلب الاستخدام السليم للأدوية التخدير. التدريب الصحيح، وموافقة المؤسسية، والموافقة IACUC كلها ضرورية قبل محاولة هذا الإجراء. هو دائما فكرة جيدة للتشاور مع الأطباء البيطريين في المؤسسة للحصول على مساعدة في تحديد متطلبات التجريبية والحصول على التدريب الصحيح. قبل هذا الإجراء، يجب أن يكون هذا الحيوان تخدير عميق، وليس استجابة للمؤثرات مثل الأقدام أو قرصة الذيل. مقص باستخدام يجعل قطع في الجلد في البطن وجدار العضلات ومن ثم الاستمرار في فتح القفص الصدري عن طريق خفض المتاخمة لمجرد القص على كل جانب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمجرب خلق أكبر مساحة داخلية العمل عن طريق خفض فآسيا المحيطة الحجاب الحاجز. عن طريق رفع جدار البطن والصدر superiorly وسوف، والآن في قلب يتعرض. إجراء قطع صغير في الأذين الأيمن للسماح بتدفق الدم من وضعه على الفور إبرة نضح إلى البطين الأيسر. ويفضل مضخة الهيدروستاتيكي الأساسية لتقديم الحلول نضح (انظر الجدول رقم 1 للحصول على التفاصيل). أولا، تدفق الدم خارجا مع الفوسفات 0.1M مخزنة المالحة (PBS، أنظر الجدول 3) حتى السائل يدير واضح. ثم، إيقاف مضخة الهيدروستاتيكي، والتحول بسرعة تسليم أنبوب إلى حل وعاء يحتوي على امتصاص العرق 4٪ (منهاج العمل، أنظر الجدول 3) المخفف في برنامج تلفزيوني ثم قم بتشغيل مضخة مرة أخرى على لتسليم مثبت. استخدام مضخة ليست ضرورية: مع الممارسة، واثنين من الحقن مليئة برنامج تلفزيوني، ويمكن استخدامها 4٪ PFA لتقديم الحلول ببطء.
  2. فمن الأهمية بمكان أن يشرح بعناية الدماغ من الجمجمة من دون إدخال أي إصابات للأنسجة. وحتى تمزقات صغيرة في الدماغ خلال تشريح التوسع تدريجيا في الشقوق واضحة على أنالأجسام المضادة فخ وتسبب تلطيخ مصطنعة أثناء معالجة الأنسجة (مثل النجمة الحمراء في الشكل رقم 2). للتشريح للدماغ، وهو نموذجي لقطع الجلد أسفل منتصف الرأس، وبعد ذلك بلطف ندف اللوحات بعيدا لفضح الجمجمة. قطع الجمجمة الأمامي إلى الخلفي من خط الوسط على طول ظهري، وأفقيا أيضا على طول كلا الجانبين من الجمجمة. لا قطع ما وراء bregma وهذا ينطوي على خطر من الخدش المخيخ. باستخدام ملقط رفع بلطف الجزء الأمامي من الجمجمة بعيدا عن الدماغ والحرص على عدم المسيل للدموع بعيدا أنسجة المخ التي تعلق على السحايا. قطع أعصاب في الجمجمة في الجانب البطني للدماغ.
  3. فصل من المخيخ عن بقية الدماغ مهم لسببين. أولا، لأنها تتيح للتنقيب عن أنماط التعبير في الفصيصات الأمامية، والتي يتم بعيدا عن الأنظار من قبل أكيمات في الموقع. والثاني هو الذي يفصل بين الأنسجة في مناطق صغيرة، معزولة يسمح للمترتثبيت خام كاملة، والذي يمكن أن يسهل تلطيخ من بعض البروتينات. طوال هذه الخطوة تشريح النهائي، ينبغي الحرص على عدم لمس المخيخ مع نصائح من الملقط. إدراج نصائح من زوج من الملقط في منتصف أكيمات الأعلى والأدنى. مع مجموعة ثانية من ملقط ندف ببطء بعيدا أكيمات السفلي من المخيخ. ثم، وضع المخيخ بحيث جانبها الأمامي لأسفل، وجذع الدماغ ويشير إلى الاتجاه الصعودي. إدراج ملقط في البطين الرابع بين الدماغ والفصيصات التاسع / العاشر من المخيخ. قطع السويقتين من قبل معسر مع ملقط على كلا الجانبين ومن ثم رفع بلطف المخيخ بعيدا عن جذع الدماغ. بمجرد أن يتم عزل المخيخ، مرحلة ما بعد اصلاحها عن طريق الغمر في PFA 4٪ في 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن 24-48 ساعة. ويمكن تخزين المخيخ في PFA 4٪ لفترة ممتدة من الزمن. وينبغي إزالة السحايا سواء قبل أو بعد تلطيخ لتحسين الرؤية لأنماط التعبير.إذا كان مجرب يختار لإزالة السحايا قبل تلطيخ هناك احتمال قوي في أن رصدت المخيخ خلال هذه العملية. تقشير بعيدا السحايا في نهاية الإجراء تلطيخ هو أبسط من ذلك بكثير لأنها تصبح أسهل لتحديد مكان بعد حصولهم على ضعف تلوين الخلفية وتصبح واهية مرحلة ما بعد المعالجة.

2. معالجة الأنسجة لتلطيخ Wholemount

لأن نهج تلطيخ wholemount وقتا أطول من تلطيخ المناعى من المقاطع النسيجية، فإنه من المفيد للتخطيط لجدول زمني لكل من التجارب كما هو مبين في الجدول الزمني المنصوص سبيل المثال (الجدول 2). قبل البدء، هناك أشياء رئيسية عديدة أن نأخذ في الاعتبار. 1) يجب أن microtubes التي تحتوي على الأنسجة تكون استدارة على nutator في جميع الأوقات، ما عدا خلال عملية التجميد / الذوبان. يجب 2) بذل عدة حلول جديدة لكل تجربة (انظر الجدول 3 عن وصفات الحل). 3)في جميع أنحاء بروتوكول، عند تغيير الحلول، وتصب بلطف من الحل بدلا من أن تنفق إزالة المخيخ مع الملقط، لتجنب لمس المخيخ. ثم، بعد خلط الحل الجديد في حاوية أخرى، واستخدام ماصة لإضافة بلطف حل جديد لأنبوب.

2،1 يوم 1:

  1. إصلاح المخيخ في 3 الإصلاح دنت لفي درجة حرارة الغرفة لمدة 6-8 ساعات هزاز بلطف على nutator. إذا الميثانول هو مدمر لمولد المضاد الخاص بك، والنظر في استبدال الخطوات من خلال 2.1a 2.3a مع مستضد طريقة استرجاعها. والحرارة ومخازن تستخدم لاسترجاع مستضد مساعدة في إعداد الأنسجة لاختراق الأجسام المضادة.
  2. تبييض المخيخ في بليتش دنت ليلة وضحاها في 3 4 درجات مئوية.

2.2 يوم 2:

  1. يذوى المخيخ في جولتين من MeOH 100٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لكل منهما.
  2. ثم، لتعزيز اختراق للحلول، وذلك رهناالنسيج لسلسلة من تجميد / الذوبان دورات. بعناية وضع أنبوب في وعاء مع الثلج الجاف وتجميد لمدة 30 دقيقة. ثم قم بإزالة أنبوب وتركه في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء لمدة 15 دقيقة. يجب أن يتم تنفيذ الخطوة تجميد / الذوبان أربع مرات (على الأقل).
  3. بعد مشاركة ذوبان في الأنسجة، ووضع أنبوب في الفريزر -80 درجة مئوية خلال الليل.
  4. ويمكن تخزين الأنسجة لفترات طويلة من الزمن على -80 درجة مئوية إما مباشرة قبل أو بعد خطوات تجميد / الذوبان. خلاف ذلك، ينبغي مواصلة البروتوكول.

2،3 يوم 3:

  1. ترطيب المخيخ قبل غسله في 50٪ MeOH/50٪ PBS، 15٪ MeOH/85٪ PBS، و 100٪ لبرنامج تلفزيوني 60-90 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة.
  2. المقبل، لمخيخات فأر بالغ، مع مراعاة النسيج على الهضم الأنزيمي مع 10μg/ml بروتين كاف في برنامج تلفزيوني لمدة 2-3 دقائق. أي خطوة عملية الهضم هو ضروري لمخيخات من الحيوانات الصغيرة (P5 أو الأصغر سنا في الماوس). يعد digestioويقترح ن للحصول على أكبر العقول. على سبيل المثال، يمكن أن الهضم يمكن أن يصل إلى 5-6 دقائق لأدمغة الثدييات العليا 4.
  3. بعد الهضم، وغسل فورا المخيخ ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق كل في درجة حرارة الغرفة لإزالة K. بروتيناز
  4. كتلة النسيج في PMT (أنظر الجدول 3) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. مسحوق الحليب وغالبا ما يكون الخيار الأول عند اختيار وكيل عرقلة لعمل البروتين لأنها غير مكلفة، ويقلل من فعالية تلوين الخلفية، وعادة لا تتدخل في ملزم الأجسام المضادة أو الوصول إلى مولد المضاد. ويمكن أيضا أن تستخدم الأمصال الحيوانية، على الرغم من أن مجرب وينبغي أن يكون على بينة من التكلفة المضافة، ويجب أن أول اختبار نوعية المصل للصليب التفاعل المناعي والقدرة على إنتاج إشارة الأمثل لنسبة الضوضاء.

2.4 يوم 4-5:

  1. احتضان النسيج في الأجسام المضادة الأولية مخففة في PMT تستكمل مع DMSO 5٪ لمدة 48 ساعة في 4 درجات تأ (Cوسوف تتطلب إيه مخيخات مرات حضانة زيادة).

2.5 يوم (6):

  1. غسل المخيخ 2-3 مرات لمدة 2-3 ساعات في كل PMT في 4 درجات مئوية لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير منضم.
  2. ثم، احتضان الأنسجة في أجسام مضادة ثانوية في محلول يحتوي على PMT مع DMSO 5٪ في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (أكبر مخيخات قد تتطلب زيادة مرات حضانة).

2.6 يوم (7):

  1. غسل المخيخ 2-3 مرات لمدة 2-3 ساعات في كل PMT في 4 درجة مئوية.
  2. يعطي النسيج يغسل نهائي مع PBT (انظر الجدول 3) لمدة 1-2 ساعات. هذه الخطوة يزيل فائض الحليب، ويعزز من وضوح تلطيخ.
  3. أخيرا، احتضان النسيج في DAB (3،3 '-diaminobenzidine) حل حتى يتم الوصول إلى كثافة تلطيخ الأمثل. ينبغي للناتج التفاعل البني تكون واضحة للعيان في غضون 10 دقيقة ~. فمن الأفضل لاستخدام البث الاذاعي الرقمي في الظلام والضوء يؤدي إلى مولد اللون precipitaالشركة المصرية للاتصالات، والتي يمكن أن تزيد من تلطيخ الخلفية.

2.7

عند الوصول إلى كثافة تلطيخ الأمثل، ووقف رد فعل عن طريق وضع المخيخ في برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.04٪. يمكن تخزينها في الأنسجة على المدى الطويل في هذا الحل. أزيد الصوديوم هو المانع من امكانات نمو البكتيريا ولكن ينبغي تجنب حتى هذه الخطوة لأنه يمنع أيضا الفجل البيروكسيديز.

2.8 إجراءات التضخيم اختياري:

تتبع بروتوكول طبيعي ولكن يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوات في مكان من الخطوات 2.5b-2.7 أعلاه.

  1. احتضان النسيج بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في البيوتين مترافق الأجسام المضادة الثانوية في PBST (انظر الجدول 3) مع DMSO 5٪.
  2. شطف النسيج لمدة 2-3 ساعات في كل التغييرات 3-4 من PBST في درجة حرارة الغرفة.
  3. احتضان المخيخ بين عشية وضحاها في حل اي بي سي 4 في مجمع في PBST درجة مئوية.
  4. شطف النسيج لمدة 2-3 ساعات في كلدرجة حرارة الغرفة في التغييرات 3-4 من برنامج تلفزيوني.
  5. احتضان النسيج في حل DAB طازجة ومعدة سلفا، وعلى النحو المبين أعلاه.
  6. عندما تلطيخ هو الأمثل، ووقف ردود الفعل من قبل غسل المخيخ في برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.04٪.

3. التصوير النسيج الملون

  1. شنت كاميرا لايكا FX DFC3000 يمكن التقاط الصور Wholemount باستخدام، على سبيل المثال، على stereomicroscope ايكا ايكا FA MZ16 تشغيل تطبيقات البرمجيات FX جناح. إذا رغبت في ذلك، يمكن استخدام المجهر deconvolution للحصول على صور متتالية متعددة في الطائرات اتصال مختلفة، مع كل صورة لها سوى فصيص واحد في التركيز هش. ثم، يمكن ضغط الصور في كومة واحدة والبرامج المقدمة لإزالة التشويه. والصورة النهائية مركب توضح المخيخ أنماط التعبير السطح مع جميع الزخرفة واضحة في تركيز واضح.
  2. وينبغي تصوير Wholemount النسيج الملون في حين منغمسين في برنامج تلفزيوني (أو وسيلة أخرى من شأنها أن تعطيالأمثل معامل الانكسار). من أجل وضع بسهولة wholemount التصوير، وجعل جل أجار 1٪ في طبق بيتري من البلاستيك. قطع ثقوب صغيرة في هلام. والثقوب تسمح مثبتة المخيخ في اتجاه المطلوب.
  3. ويتم استيراد البيانات الخام إلى برنامج Adobe Photoshop CS4 وتعديلها لمستويات التباين والسطوع.

الحيوانات

وأجريت جميع الدراسات على الحيوانات في إطار بروتوكول حيوان IACUC الموافقة عليه وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية في كلية ألبرت اينشتاين للطب. تمت المحافظة على الذكور والإناث الأباعد السويسري ويبستر (Taconic، ألباني، نيويورك) في الفئران مستعمرة لدينا وتستخدم لجميع الدراسات. تفضلت الفئران البالغين الموت الرحيم الدكتور Bryen الأردن (كلية ألبرت اينشتاين للطب). وكانت جميع الحيوانات ما لا يقل عن شهر واحد من العمر.

4. ممثل النتائج

ومجزأة المخيخ بواسطة التعبير الجزيئية إلى أربع مناطق عرضية:المنطقة الأمامية (من الألف إلى الياء: ~ فصيصات الرابع)، والمنطقة المركزية (تشيكوسلوفاكيا: ~ فصيصات السادس والسابع)، والمنطقة الخلفية (PZ: ~ فصيصات VIII-ظهري التاسع) والمنطقة عقيدية (NZ: ~ فصيصات التاسع والعاشر بطني ) 5. كل منطقة تحتوي على مجموعة فريدة من المشارب مجاور للسهمي 1،2،5،6 (الشكل 1). ZebrinII التعبير في الخلايا العصبية يكشف المشارب في الألف إلى الياء وPZ (الشكل 2) والتعبير موحدة في تشيكوسلوفاكيا ونيوزيلندي (الشكل 2). وينعكس تنظيم مجاور للسهمي من الخلايا العصبية التي تضاريس الحقل محطة من الألياف وارد. نص الكوكايين والأمفيتامين التنظيم (سلة) وأعرب عن الببتيد في مجموعات فرعية من الألياف التسلق (الشكل 3A) أن المشروع لالمشارب من التشعبات الخلية العصبية في الطبقة الجزيئية للقشرة المخيخ 7 (الشكل 3B). مع التعديلات المناسبة، مثل التضخيم 7، وبروتوكول wholemount يسمح لتصور أنماط السبيل الزيتوني دون نيد من أجل إعادة البناء شاقة، تستغرق وقتا طويلا من المقاطع النسيجية تلطيخ (الشكل 3B).

figure-protocol-1
الشكل 1. ألف ZebrinII / aldolaseC التعبير يكشف عن عصابات السهمي في المقاطع العرضية من المخيخ. شريط مقياس = 500 ميكرون. وأعرب عن B. ZebrinII / aldolaseC حصرا في الخلايا العصبية somata والتشعبات. مقياس شريط = 150μm (GL = طبقة الحبيبية، PCL الخلية العصبية = طبقة؛ مل = طبقة جزيئية).

figure-protocol-2
الشكل 2. والمخيخ wholemount ملطخة للZebrinII / aldolaseC تبين الخلية العصبية المشارب في صور الأمامي (الكمار)، المركزية (تشيكوسلوفاكيا)، والخلفية (PZ) مناطق من المخيخ. هنا نعرض أيضا مثال على نتيجة سلبية من الخدش المخيخ. يشار إلى تلطيخ الناتج مصطنعةمع النجمة الحمراء. شريط مقياس = 1 ملم (LS البسيط الفصيص =؛ حزب الرابطة الاسلامية = ناصف فصيص؛ COP = حباك الهرمية).

figure-protocol-3


الشكل 3. وأعرب عن ألف سلة في التسلق محطات الألياف في الطبقة الجزيئية. شريط مقياس = 100 ميكرون. (مل = طبقة الجزيئي؛ PCL الخلية العصبية = طبقة، طبقة = GL الحبيبية) B. Wholemount المناعية التعبير السلة في نيوزيلندا. شريط مقياس = 2 ملم (COP = حباك الهرمية، حزب الرابطة الاسلامية = فصيص ناصف؛ PFL = النديفة؛ FL = الندفة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد وصفت لنا التفاصيل الفنية اللازمة لتلطيخ wholemount ناجحة باستخدام نهج متعدد الاستعمالات المناعى للتعبير عن بروتين كاشفة في الدماغ النامية وتعليم الكبار. باستخدام هذا النهج، يمكن تحليل معقد أنماط التعبير الجزيئية وتضاريس الدماغ تقدير من دون الحاجة إلى شاقة وتستغرق وقتا طويلا الإجراءات باجتزاء الأنسجة.

وقد استخدم هذا البروتوكول للكشف عن التعبير نمط من عدة بروتينات الخلايا العصبية في البالغين على حد سواء في وقت ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا ما يكشف.

شكر وتقدير

ويدعم RVS بواسطة محقق جديد لبدء الأموال من كلية ألبرت اينشتاين للطب في جامعة يشيفا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المواد وظيفة في بروتوكول
مضخة نضح (فيشر Scientific/13-876-2) يسمح لنضح بما يتفق وبطيئة.
مقص حاد الطرف (FST/14081-08) الاستخدام العام في نضح وتشريح.
كليل معلومات سرية الملقط (FST/91100-12) لتحقيق الاستقرار في قلب لإدخال الإبرة نضح.
ملقط (FST بواسطة دومون AA/11210-10) لاستخدامها خلال تشريح الدماغ من الجمجمة وفصل المخيخ عن بقية الدماغ. هذه ضرورية لأن لديهم معلومات سرية مقربة قليلا أن يساعد على التقليل من الأضرار التي لحقت المخيخ خلال تشريح.
Nutator (فيشر العلمية) تستخدم للحفاظ على النسيج في الحركة خلال فترات حضانة.
1.5 مل أنبوب (Sarstedt / المكسرات سقف مايكرو أنبوب) كل الخطوات من لهtochemistry بروتوكول تجري في هذه microtubes. أسفل تقريب يضمن أن يبقى في المخيخ الحركة.
مثقب ملعقة (FST/10370-17) تستخدم للحفاظ على wholemounts في microtubes بينما الصب بلطف خارج الحل قضى.
مجهر لايكا MZ16 FA تستخدم لفحص تلطيخ wholemount.
لايكا DFC3000 FX الكاميرا تستخدم لالتقاط الصور wholemount.

الجدول رقم 1.

تقويم مثال لتجربة نموذجية wholemount
اليوم 1 دنت في الإصلاح، درجة حرارة الغرفة، 8 ساعات دنت في التبييض، و 4 درجات مئوية، بين عشية وضحاها
اليوم 2 100 MeOH٪، درجة حرارة الغرفة، 2X، كل 30 دقيقة 100 MeOH٪، تجميد / الذوبان،
4X، 30 دقيقة min/15 		ن = "2"> MeOH 100٪، -80 درجة مئوية، بين عشية وضحاها
اليوم 3 50٪ MeOH/50٪ PBS، درجة حرارة الغرفة، 60-90 دقيقة 15٪ MeOH / PBS 85٪، درجة حرارة الغرفة، 60-90 دقيقة 100 PBS٪، درجة حرارة الغرفة، 60-90 دقيقة 10μg/mL بروتين كاف في برنامج تلفزيوني، درجة حرارة الغرفة، 2-3 دقيقة 100 PBS٪، درجة حرارة الغرفة، 3X، 10 دقيقة كل PMT، 4 درجات مئوية، بين عشية وضحاها
يوم 4-5 PMT + 1 ° الضد + 5٪ DMSO، 4 درجات مئوية، 48 ساعة
6 أيام PMT، 4 درجات مئوية، 2-3X، 2-3 ساعات كل PMT + 2 ° الضد + 5٪ DMSO، 4 درجات مئوية، 24 ساعة (أو تبدأ خطوات التضخيم مع مجمع ABC)
يوم 7 PMT، 4 درجات مئوية، 2-3X، 2-3 ساعات كل PBT، درجة حرارة الغرفة، 2 ساعات في احتضان DAB جديدة في برنامج تلفزيوني حتى تلطيخ الأمثل هو تصور
_content "> الجدول رقم 2.

وصفات (* = إعداد جديد في كل مرة)
برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) مخزنة 0.1M فوسفات المالحة في الماء منزوع الأيونات. درجة الحموضة 7.2 (أقراص سيغما، P4417)
PFA (لامتصاص العرق) أدلى والمجمدة تخزين كحل 20٪ ومن ثم تخفيفه إلى 4٪ في برنامج تلفزيوني من أجل حل العمل (فيشر العلمية؛ T353)
دنت ومثبت 3 * 4 أجزاء الميثانول
1 dimethylsulfoxide جزء (DMSO؛ فيشر العلمية؛ D159-4)
دنت في بليتش 3 * 4 أجزاء الميثانول
1 dimethylsulfoxide جزء (DMSO؛ فيشر العلمية؛ D159-4)
1 بيروكسيد الهيدروجين جزء 30٪
الأنزيمية الهضم 10 ميكروغرام / مل من K بروتين (روش تشخيص، 03115828001) في برنامج تلفزيوني.
PBST برنامج تلفزيوني وعلى متنها:
0.1٪ توين-20 (Fisheالبحث العلمي، BP337، ويمكن أيضا أن تستخدم تريتون في مكان توين-20 في جميع الحالات).
PMT 25 * برنامج تلفزيوني وعلى متنها:
2٪ دهن مسحوق الحليب الخالي من الدسم (قرنفل فضل)
0.1٪ توين-20 (فيشر العلمية؛ BP337)
PBT 25 * برنامج تلفزيوني وعلى متنها:
0.2٪ البقري (سيغما؛ B9001S) مصل
0.1٪ توين-20 (فيشر العلمية؛ BP337)
DAB * حل 1 10 ملغ من diaminobenzidine-3،3 (سيغما الدريخ؛ D5905) في 40 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 10 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30٪ لبدء رد فعل).
ABC حل معقد Vectastain مجموعة (المتجهات المختبرات، وشركة؛ PK-4000)

الجدول 3.

المراجع

  1. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
  2. Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R. Whole-Mount Immunohistochemistry of the Brain. Current Protocols in Neuroscience. , (2006).
  3. Dent, J. A., Polson, A. G., Klymkowsky, M. W. A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus. Development. 105, 61-74 (1989).
  4. Sillitoe, R. V., Malz, C. R., Rockland, K., Hawkes, R. Antigenic compartmentation of the primate and tree shrew cerebellum: a common topography of zebrin II in Macaca mulatta and Tupaia belangeri. J. Anat. 204, 257-269 (2004).
  5. Ozol, K., Hayden, J. M., Oberdick, J., Hawkes, R. Transverse zones in the vermis of the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 412, 95-111 (1999).
  6. Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
  7. Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. J. Comp. Neurol. 519, 1781-1796 (2011).
  8. Sarna, J. R., Marzban, H., Watanabe, M., Hawkes, R. Complementary stripes of phospholipase Cbeta3 and Cbeta4 expression by Purkinje cell subsets in the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 496, 303-313 (2006).
  9. Demilly, A., Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Neurofilament heavy chain expression reveals a unique parasagittal stripe topography in the mouse cerebellum. Cerebellum. 10, 409-421 (2011).
  10. Larouche, M., Hawkes, R. From clusters to stripes: the developmental origins of adult cerebellar compartmentation. Cerebellum. 5, 77-88 (2006).
  11. Marzban, H., Chung, S., Watanabe, M., Hawkes, R. Phospholipase Cbeta4 expression reveals the continuity of cerebellar topography through development. J. Comp. Neurol. 502, 857-871 (2007).
  12. Blank, M. C., Grinberg, I., Aryee, E., Laliberte, C., Chizhikov, V. V., Henkelman, R. M., Millen, K. J. Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis. Development. 138, 1207-1216 (2011).
  13. Sawada, K., Sakata-Haga, H., Fukui, Y. Alternating array of tyrosine hydroxylase and heat shock protein 25 immunopositive Purkinje cell stripes in zebrin II-defined transverse zone of the cerebellum of rolling mouse. Nagoya. Brain Res. 1343, 46-53 (2010).
  14. Sawada, K., Fukui, Y., Hawkes, R. Spatial distribution of corticotropin-releasing factor immunopositive climbing fibers in the mouse cerebellum: Analysis by whole mount immunohistochemistry. Brain Res. 1222, 106-117 (2008).
  15. Marzban, H., Hawkes, R. On the architecture of the posterior zone of the cerebellum. Cerebellum. 10, 422-434 (2011).
  16. Pakan, J. M., Graham, D. J., Wylie, D. R. Organization of visual mossy fiber projections and zebrin expression in the pigeon vestibulocerebellum. J. Comp. Neurol. 518, 175-198 (2010).
  17. Iwaniuk, A. N., Marzban, H., Pakan, J. M., Watanabe, M., Hawkes, R., Wylie, D. R. Compartmentation of the cerebellar cortex of hummingbirds (Aves: Trochilidae) revealed by the expression of zebrin II and phospholipase C beta 4. J. Chem. Neuroanat. 37, 55-63 (2009).
  18. Sarna, J. R., Larouche, M., Marzban, H., Sillitoe, R. V., Rancourt, D. E., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease. J. Comp. Neurol. 456, 279-291 (2003).
  19. Sarna, J. R., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell loss in the ataxic sticky mouse. Eur. J. Neurosci. 34, 79-86 (2011).
  20. El-Bizri, N., Guignabert, C., Wang, L., Cheng, A., Stankunas, K., Chang, C. P., Mishina, Y., Rabinovitch, M. SM22alpha-targeted deletion of bone morphogenetic protein receptor 1A in mice impairs cardiac and vascular development, and influences organogenesis. Development. 135, 2981-2991 (2008).
  21. Mondrinos, M. J., Koutzaki, S., Lelkes, P. I., Finck, C. M. A tissue-engineered model of fetal distal lung tissue. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, 639-650 (2007).
  22. Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest. Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).
  23. Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2. Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).
  24. Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).
  25. Davis, C. A. Whole-mount immunohistochemistry. Methods Enzymol. 225, 502-516 (1993).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

II C K DAB

مقالات ذات صلة