مقالة منهجية

قياس حركية تقدم دورة الخلية مع وصفها الأيض والتدفق الخلوي

DOI:

10.3791/4045

⸱

مايو 22, 2012

 , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of British Columbia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن تحقيق بعض التغييرات الطفيفة في تتبع تطور وحركية من مراحل دورة الخلية عن طريق استخدام مزيج من العلامات الأيضية من الأحماض النووية مع BrdU ومجموع تلطيخ الحمض النووي الجيني عن طريق يوديد Propidium. هذا الأسلوب يتجنب الحاجة لتزامن الكيميائية من الخلايا ركوب الدراجات، وبالتالي منع إدخال الحمض النووي من التلف غير محددة، وهذا بدوره يؤثر على تقدم دورة الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكتسب السيطرة الدقيقة على بدء الدورة الخلوية والتقدم اللاحق عبر مراحلها المختلفة أهمية قصوى في الخلايا المتكاثرة. ويعد انقسام الدورة الخلوية جزءاً لا يتجزأ من النمو والتكاثر، وقد ارتبط خلل تنظيم المكونات الرئيسية للدورة الخلوية بالأحداث المسببة لنشوء السرطان 1,2. وغالباً ما تستهدف العوامل الجزيئية في علاجات مكافحة السرطان المسارات البيولوجية المسؤولة عن تنظيم وتنسيق انقسام الدورة الخلوية 3. ورغم أن حركية الدورة الخلوية تميل إلى التباين وفقاً لنوع الخلية، إلا أن توزيع الخلايا بين المراحل الأربع للدورة الخلوية يكون متسقاً إلى حد كبير ضمن خط خلوي معين، وذلك بسبب النمط الثابت للتعبير عن المروجات التضاعفية وعوامل النمو. ويمكن أن تؤدي الأحداث المسببة للسمية الجينية والضغوط الخلوية الأخرى إلى إيقاف مؤقت لتقدم الدورة الخلوية، مما يؤدي إلى توقف أو تعليق مؤقت في مرحلة معينة من الدورة الخلوية للسماح بتفعيل آلية الاستجابة المناسبة.

تعد القدرة على الملاحظة التجريبية لسلوك مجموعة من الخلايا فيما يتعلق بمرحلة تقدم دورة الخلية تقدماً هاماً في علم أحياء الخلية. تُستخدم إجراءات شائعة، مثل الفصل بالرج الانقسامي (mitotic shake off)، أو الطرد المركزي التفاضلي، أو الفرز القائم على قياس التدفق الخلوي، لعزل الخلايا في مراحل محددة من دورة الخلية 4-6. ثم تخضع هذه المجموعات المجزأة والمُثرى بمرحلة معينة من دورة الخلية لمعالجات تجريبية. وغالباً ما يتأثر العائد والنقاوة وحيوية الأجزاء المفصولة عند استخدام طرق الفصل الفيزيائية هذه. وبالمثل، فإن الفاصل الزمني بين فصل مجموعات الخلايا وبدء المعالجة التجريبية، والذي قد يسمح للخلايا المجزأة بالانتقال من مرحلة دورة الخلية المختارة، يمكن أن يفرض تحديات كبيرة في التنفيذ الناجح لهذه التجارب وتفسير نتائجها.

تشمل النهج الأخرى لدراسة مراحل الدورة الخلوية استخدام المواد الكيميائية لمزامنة الخلايا. وتعد معالجة الخلايا بالمثبطات الكيميائية للعمليات الأيضية الرئيسية لكل مرحلة من مراحل الدورة الخلوية مفيدة في منع تقدم الدورة الخلوية إلى المرحلة التالية. على سبيل المثال، يقوم hydroxyurea، وهو مثبط لإنزيم ribonucleotide reductase، بإيقاف الخلايا عند نقطة التقاء G1/S عن طريق الحد من إمدادات deoxynucleotides، وهي اللبنات الأساسية لـ DNA. وتشمل المواد الكيميائية البارزة الأخرى المعالجة بـ aphidicolin، وهو مثبط لإنزيم polymerase alpha لإيقاف الخلايا في مرحلة G1، والمعالجة بـ colchicine و nocodazole، وكلاهما يتداخل مع تكوين المغزل الانقسامي لإيقاف الخلايا في المرحلة M، وأخيراً، المعالجة بـ 5-fluorodeoxyridine، وهو مادة تنهي سلسلة DNA لبدء إيقاف المرحلة S 7-9. وتعتبر المعالجة بهذه المواد الكيميائية وسيلة فعالة لمزامنة مجموعة كاملة من الخلايا في مرحلة معينة. ومع إزالة المادة الكيميائية، تعود الخلايا للدخول في الدورة الخلوية في آن واحد. وتضمن معالجة العامل المختبر بعد التحرر من المادة الكيميائية التي تعيق الدورة الخلوية أن تكون الاستجابة الدوائية الناتجة من مجموعة موحدة ومحددة لمرحلة معينة من الدورة الخلوية. ومع ذلك، وبما أن العديد من مواد المزامنة الكيميائية هي مركبات معروفة بأنها سامة للجينات، فإن الفصل بين مسارات الاستجابة المختلفة (للمزامنات مقابل العوامل المختبرة) يعد أمراً صعباً.

نصف هنا طريقة للوسم الأيضي لتتبع مجموعة فرعية من الخلايا التي تمر بدورة حياة نشطة خلال تقدمها من مرحلة تضاعف الـ DNA، وصولاً إلى انقسام وانفصال الخلايا الوليدة. يتيح هذا البروتوكول، عند اقترانه بالقياس الكمي باستخدام قياس التدفق الخلوي، قياس التقدم الحركي لدورة الخلية في غياب الإجهادات الخلوية المستحثة ميكانيكياً أو كيميائياً والتي تصاحب عادةً منهجيات مزامنة دورة الخلية الأخرى 10. وسنناقش في الأقسام التالية هذه المنهجية، بالإضافة إلى بعض تطبيقاتها في الأبحاث الطبية الحيوية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية التحضير

figure-protocol-1

  1. خلايا لوحة لتحقيق كثافة ما يقرب من 60٪ confluency. يجب أن تكون الخلايا في مرحلة سجل في وقت جمع. لmcf7 الخلايا، ويتم ذلك عن طريق زرع البذور في 5 خلايا × 5 10/10 لوحة سم في وسائل الإعلام المناسبة. وبذرت HT29 وLS180 الخلايا في الخلايا 6 × 5 10/6 لوحة سم. استخدمنا وسائل الاعلام DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و1X البنسلين / الستربتومايسين عقار. تأكد من لوحات البذور لعناصر الصحيحة الموجبة والسالبة فيبالإضافة إلى عينات الاختبار. وهي تشمل ما يلي:
أنا إيجابي مراقبة BrdU فقط
الثاني إيجابي مراقبة بي فقط
ثالثا السلبية السيطرة BrdU سلبي، PI سلبي

(وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن استخدام تجربة أولية مع timepoints متعددة مثل تلك المبينة في هذا البروتوكول لتقليص الفترة الزمنية خلالها لتنفيذ المجموعات في المستقبل.)

  1. يتم تحضين الخلايا مطلي ب 37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2 لمدة 24-48 ساعة، مما يتيح لاستعادة خلايا ونعلق.
  2. إلى نبض الخلايا التسمية مع bromodeoxyuridine (BrdU)، يتم استبدال DMEM وايالطازجة وسائل الاعلام عشر التي تحتوي على 10 BrdU ميكرومتر. يتم تحضين الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 للسماح لدمج BrdU الى الحمض النووي. مما لا شك فيه أن يترك لوحة واحدة غير المعالجة لتكون بمثابة مراقبة سلبية.
  3. تتم إزالة وسائل الإعلام نبض وضع العلامات وتشطف الخلايا لفترة وجيزة مع PBS 1X.
  4. يضاف سائط النمو الطازجة (ناقص BrdU)، ويسمح للخلايا على مواصلة احتضان عند 37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2 حتى يتم التوصل الى timepoint المناسب للحصاد.

2. حصاد والتثبيت

  1. وتعتبر الخلايا غير المعالجة من الخطوة 1.3 في timepoint صفر. ويمكن حصاد هذه العينة مع timepoint ح (1) التي يتم جمعها فورا بعد العلاج BrdU.
  2. لحصاد الخلايا، تتم إزالة وسائل الاعلام وتشطف لوحات ذات مرة في برنامج تلفزيوني مع 1X.
  3. وtrypsinized الخلايا، التي تم جمعها في وسائل الاعلام والتثقيف مكعبات في وقت لاحق عن طريق الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق سوبيتم تجاهل ernatant.
  4. شطف 1-10 × 10 6 خلايا في 5 مل PBS الجليد 1X الباردة. يتم تجاهل الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لالطافي (Supernatant) 5 دقائق.
  5. ومعلق ثم بيليه الخلية في 100 ميكروليتر من الجليد الباردة PBS FBS٪ 1 /. بالإضافة إلى ذلك من FBS 1٪ في برنامج تلفزيوني الإيدز في منع تكتل الخلية.
  6. إضافة هذه الخلايا قطرة قطرة إلى 5 مل من -20 درجة مئوية، والإيثانول بنسبة 70٪ لإصلاح الخلايا.
  7. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة أو متجر عند 4 درجات مئوية خلال الليل. هذا هو خطوة مثالية في أي لوقف جمع عينات من مختلف timepoints. ويمكن ترك هذه العينات في الايثانول لعدة أيام، مما يسمح لتتم معالجتها في وقت واحد خلال الفترة المتبقية من هذا البروتوكول.

3. BrdU وPI تلطيخ

  1. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة.
  2. إزالة مثبت، ولكن ترك ~ 50 ميكرولتر التي لتخفيف بيليه بواسطة vortexing.
  3. لتفسد على الحمض النووي، وإضافة ببطء 1 مل من HCL 2N / تريتون X-100قطرة قطرة في حين vortexing. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  4. خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي عينات لمدة 5 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة. نضح وتجاهل طاف.
  5. Resuspend وبيليه خلية في 1 مل من 0.1M tetraborate الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.5، لتحييد خطوة تمسخ.
  6. منبذة الخلايا لمدة 5 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة. نضح وتجاهل طاف.
  7. Resuspend وبيليه الخلية في 75 ميكرولتر من مزيج تلطيخ BrdU (50 ميكرولتر 0.5٪ توين 20/1٪ جيش صرب البوسنة / PBS + 20 FITC مترافق ميكرولتر مكافحة BrdU + 5 ميكرولتر ريبونوكلياز 10 ملغ / مل).
  8. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة محمية من الضوء.
  9. إلى خلايا بيليه، منبذة العينات لمدة 5 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة. نضح وتجاهل طاف.
  10. Resuspend وبيليه خلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 5 ميكروغرام / مل يوديد propidium.

4. تدفق الخلوي

  1. لتحليل الخلايا، وتدفق عداد الكريات مجهزة ليزر 488 نانومتر والمرشحات المناسبة أمر ضروري. برامج التحليل مثل CellQuest هو ضروري لخلق المساحات المبينة أدناه.
  2. عند تشغيل نموذج من خلال تدفق عداد الكريات، إنشاء المبعثر إلى الأمام (SSC-H) في مقابل الجانب مبعثر (FSC-H) مؤامرة لضمان التوزيع المناسب لحجم الخلايا (الشكل 1A). يتم رسم كل من هذه المعايير على نطاق والخطية.
  3. عرض في وقت واحد قطعة من FL3-H (PI صمة عار) في مقابل FL2-W (الشكل 1B). وتستخدم هذه مؤامرة لإنشاء بوابة (R3) لعزل جزء من الخلايا التي تقع ضمن نمط التوزيع العادي للدورة الخلية. بشكل عام، ويتميز هذا النمط التوزيع من قبل اثنين من مجموعات من الخلايا من محتوى الحمض النووي 2N و4N من تلطيخ PI تمثل G1 و G2 مراحل من دورة الخلية، على التوالي. سلسلة من الخلايا التي تقع بين هذه المجموعات 2 هو ممثل تكرار الحمض النووي الجارية التي تحدث في مرحلة من مراحل دورة الخلية.
  4. إنشاء displayi مؤامرةنانوغرام الخلايا المغلقة (R3) من الخطوة 4.3، مع FL1-H (FITC، سجل مؤامرة) على محور y و PI (مؤامرة خطي) على محور س (الشكل 1C). وسوف تستخدم هذه المؤامرة لتعيين المعلمات المتبقية باستخدام عناصر التحكم المختلفة المبينة في 1.1، وكذلك لجمع البيانات لتحليلها.
  5. وضع الباحث عينة فقط الملون على لعداد الكريات. ضبط مكسب لوضع G1 في ~ 200 على المحور س. هذا سوف يكون من الأسهل تصور في مؤامرة الرسم البياني للPI وصمة عار.
  6. والثانية تشمل مراقبة تشغيل عينة BrdU فقط على تدفق عداد الكريات. ضبط الربح بحيث السكان 2 من الخلايا (BrdU إيجابي مقابل BrdU السلبية) تظهر في هذه المؤامرة. من الناحية المثالية، يتم وضع الخلايا BrdU السلبية لتظهر فقط أقل من 10 -1.
  7. التحكم النهائي هو عينة BrdU / PI سلبي. تشغيل هذا الشاهد السلبي للتأكد من أن الخلايا لا تظهر في أي من الأرباع اليد العليا أو اليمين.
  8. بمجرد أن يتم تعيين المعلمات من المؤامرات المختلفة،يتم معايرة عداد الكريات تدفق وعلى استعداد لمعالجة الخلايا BrdU وPI الملون. يجب أن تقرأ ما لا يقل عن 10000 الخلايا التي هي بوابات في جزء PI الصحيح (الرجوع إلى الخطوة 4.3) لكل مجموعة.
  9. لتحليل البيانات التي تم جمعها، ويتم استخدام البرمجيات مثل FlowJo أو FacsDiva. ويمكن أن يعاد كل من المؤامرات المذكورة في هذه البرامج وإجراء التحليل الكمي والإحصائي.
  10. نقطة النهاية لتحليل ينطوي على عدة خطوات متتالية. خلق قطعة FITC مقابل PI مع الخلايا المغلقة كما PI إيجابية من مؤامرة PI مقابل FL2 W-يسمح احد لتمييز السكان ركوب الدراجات. يتم إنشاء بوابة ثانية من هذه المؤامرة من خلال عزل السكان BrdU إيجابي. معربا عن هذه الفئة من السكان مميزة على قطعة أرض المدرج مع PI على المحور س يسمح احد لتتبع مسار الوقت للتقدم دورة الخلية. وهذا يمكن أن يكون أبعد تصور من قبل المتهم بالتآمر في عدد من BrdU إيجابية الخلايا مع G1 أو محتوى G2 بوصفها وظيفة من الزمن.

5. ممثل النتائج

عادة خلايا الدراجات ملطخة يوديد propidium لها قمم متميزة في G1 و G2، الموافق الخلايا التي تحتوي على 2N و4N محتوى الحمض النووي، وعلى التوالي (الشكل 2). نبض الوسم مع BrdU يسمح لوضع العلامات الانتقائية للسكان شبه من الخلايا التي يتم تجميع بنشاط الحمض النووي (أي مرحلة S). بعد وقت قصير من إزالة كاشف BrdU، كل الخلايا وصفت في مرحلة S (الشكل 3). عن طريق تقييد وضع العلامات على نبض قصير واحد قادر على متابعة هذه متميزة الآن شبه السكان من الخلايا طوال الوقت نقاط عديدة لأنها تمر من خلال مراحل لاحقة من دورة الخلية. يمكن أن يكون هذا التصور عند نقطة ح 1 مرة في الشكل (3) ونقص واضح في G1 و G2 القمم.

يمكن الحصول على معلومات إضافية من خطوة ووضع العلامات BrdU. لا يمكن إلا أن يكون قياس نسبة الخلايا بنشاط الفاصل، وإنما هو بتوقيت شرق الولايات المتحدةويمكن تحديد imate من دورة الخلية مرحلة التوزيع بين عينتين كذلك. من خلال جمع الخلايا على فترات زمنية متساوية بعد إزالة كاشف BrdU، يمكن تتبع الخلايا لأنها لا تزال تقدم، دورة لG2 والانتقال في نهاية المطاف من خلال لانقسام الخلايا من الخلايا الأصلية، الناشئة أخيرا كما الخلايا الوليدة BrdU إيجابية مع G1 محتوى الحمض النووي (الشكل 4). وتقدم مثالا للدورة الخلية الكمي مرحلة والتحليل الحركي في الشكل 5.

figure-protocol-2
الشكل 1. (A) مبعثر الأمام مقابل الجانب مؤامرة مبعثر من السكان ممثل خلية mcf7. (ب) PI مقابل العرض (FL-W) قطعة من مجموعة من السكان ممثل خلية mcf7. ويرد النابضة لاستبعاد الحلل خلية في التحليل النهائي (R3). والحلل خلية لديها أكبر عرض النبضة من خلية واحدة، لأنها تأخذ وقتا أطول لتمر من خلال شعاع الليزر وtherefويمكن استبعاد خام من التحليل. (C) PI مقابل FITC (BrdU) مؤامرة خلية سكان ممثل mcf7. ويرد النابضة لتشمل فقط (BrdU) الخلايا FITC إيجابي (R4).

figure-protocol-3
الشكل 2. الممثل مؤامرة الرسم البياني من إجمالي عدد السكان من الخلايا عادة ركوب الدراجات.

figure-protocol-4
الشكل 3. مؤامرة الرسم البياني للخلايا التي تم جمعها 1H بعد إزالة نبض BrdU، بعد النابضة للخلايا (BrdU) إيجابية FITC. BrdU إيجابية في الخلايا 1 timepoint في وقت مبكر بعد إزالة التسمية تظهر ملامح PI التي تتوافق مع عينات من عرض محتوى الحمض النووي بما يتفق مع الخلايا التي هي في S-مرحلة من مراحل دورة الخلية، مؤكدا على وضع العلامات الناجحة من الخلايا فقط خلال تركيب الحمض النووي.

figure-protocol-5 LT = "الشكل 4" />
الشكل 4. مقارنة بين حركية تقدم دورة الخلية بين خطوط الخلايا السرطانية، سرطانات القولون والمستقيم HT29 (أ) و LS180 (B)، فضلا عن سرطان الثدي mcf7 (C). وقد تم جمع الخلايا في كل ساعة لمدة 8 ساعات، وبعد زوال نبض BrdU. في هذه التجربة، لاحظنا صورة واضحة من تسارع تقدم دورة الخلية من خلال المرحلة G2 من دورة الخلية في LS180 خلية خط القولون والمستقيم. مقارنة بين حركية ملامح اثنين من خلايا سرطان القولون والمستقيم، وظهور ذروة G1 هو واضح في = T 4H بعد BrdU في الخلايا LS180، بالمقارنة مع نقطة وقت المقابلة للخلية HT-29 خط الذي يفتقر الى هذه الذروة. بالمقارنة مع أي واحد من هذين الخطين خلية القولون والمستقيم، mcf7 الخلايا وركوب الدراجات بمعدل انخفاض كبير. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

إعادة 5 "/>
الشكل 5. (A) دورة الخلية مرحلة التحليل الكمي للخلايا السرطانية BrdU المسمى. تم تطبيق خوارزمية العميد / جيت / فوكس إلى LS180، HT29 وmcf7 (موضح باللون الأخضر). وأعرب عن دورة الخلية توزيعات المرحلة الناتجة عن كل عينة مثل خلايا٪ BrdU إيجابية الإجمالي لكل مرحلة. يتم عرض فقط تحديد نقاط الوقت لكل خط الخلية، كما في تحليلات لبعض النقاط وقت سابق أسفرت عن نتائج غير صحيحة. في هذه النقاط وقت سابق، كل الخلايا BrdU إيجابية هي في مرحلة-S ولذا فهي تفتقر G1 متميزة وقمم G2، التي هي ضرورية لتطبيق الخوارزمية. (ب) المدرج الإحصائي من الخلايا السرطانية تظهر من خلال حركية تقدم G2 / M مراحل دورة الخلية. تقدم من خلال G2 / M مراحل هي أسرع لLS180 الخلايا، تليها HT29 وmcf7. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

JPG "ALT =" S1 الشكل "/>
S1 شخصية. ضوابط التدفق الخلوي. وتظهر الخلايا كما mcf7 (أ) مراقبة سلبية حيث الخلايا ليست ملطخة بي ولا BrdU. (ب) PI ملطخة فقط. (C) وصفت BrdU-FITC العينات.

figure-protocol-6
الرقم S2. التوضيح تخطيطي يبين العلاقة بين طيف الانبعاث فلوري من PI مقابل FITC (BrdU). وتظهر مجموعة من النوافذ الطيفية لقناة فلوري 1 (FL1، لFITC) وقناة فلوري 3 (FL3، لPI) في المربعات المقابلة. لا يوجد تداخل بين أطياف fluorophore FL1 وكشف FL3. من الواضح، مضان التعويض ليس من الضروري عندما البيانات التجريبية من PI وFITC BrdU، يتم جمع المشترك المسمى الخلايا في قنوات FL1/FL3 على التوالي. وقد تم الحصول على أطياف مضان من موقع العلوم البيولوجية دينار بحريني:الهدف = "_blank"> http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من خلال الجمع بين التدفق الخلوي مع دمج BrdU، لدينا الأدوات اللازمة لدراسة حركية دورة الخلية. الخاصية المميزة للBrdU في أداء وظيفته التماثلية ثيميدين هو ما يسمح لتقدير محتوى الحمض النووي للخلية وركوب الدراجات. إدماج BrdU إلى حبلا ابنة الحمض النووي للنمو خلال مرحلة التوليف من دورة الخلية هو ما يسمح احد لمتابعة جزء من السكان من الخلايا ركوب الدراجات من خلال تكرار الحمض النووي في مرحلة S، إلى فترة من النمو في G2، وفي نهاية المطاف إلى انقسام الخلايا . ويمكن ابنة BrdU إيجابية الخلايا يت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر اندي جونسون من مركز البحوث الطبية الحيوية في جامعة كولومبيا البريطانية للحصول على المساعدة مع تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. يتم توفير التمويل للبحوث السرطانية في المختبر وونغ من قبل المعهد الكندي لابحاث السرطان في المجتمع (منحة التشغيل # 019250)، وإعادة الاستثمار من أموال البحوث التابع لكلية العلوم الصيدلية، جامعة كولومبيا البريطانية. ويدعم JMYW من كراسي البحث وكندا، ومايكل سميث مؤسسة لبرامج الصحة بحوث التطوير الوظيفي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكاشف شركة فهرس العدد تعليقات
bromodeoxyuridine بيكتون ديكنسون 55089
propidium يوديد سيغما 287075 1mg/ml الأوراق المالية
FITC مكافحة BrdU بيكتون ديكنسون 347583
الصوديوم tetraborate الصياد S80172 0.1M، ودرجة الحموضة 8.5
FACS العيار بيكتون ديكنسون

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).
  2. Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention. Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).
  3. Dickson, M. A., Schwartz, G. K. Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy. Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).
  4. Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).
  5. van Opstal, A., Boonstra, J. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells. Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).
  6. Gasnereau, I. Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis. Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).
  7. Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).
  8. Pedrali-Noy, G. Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin. Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).
  9. Merrill, G. F. Cell synchronization. Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).
  10. Fleisig, H. B., Wong, J. M. Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells. Oncogene. , (2011).
  11. Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9. Cancer Res. 66, 435-444 (2006).
  12. Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry. Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).
  13. Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry. Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BrDU DNA

مقالات ذات صلة