الطفرات بيسلفيت هو معيار الذهب لتحليل الحامض النووي. لدينا بروتوكول تعديل يسمح لتحليل الحامض النووي على مستوى وحيدة الخلية والتي صممت خصيصا لالبويضات الفردية. ويمكن أيضا استخدامه لانشقاق في مرحلة الأجنة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
علم التخلق يتفرد بها كل الموروثة وتعديلات عكسها على لونين من شأنها أن تغير الجينات إمكانية الوصول، وبالتالي هي الآليات الأساسية لتنظيم النسخ الجيني 1. الحامض النووي هو تعديل اللاجينية التي تعمل في الغالب على أنه علامة القمعية. من خلال إضافة التساهمية لمجموعة الميثيل على cytosines في dinucleotides الدليل السياسي الشامل، فإنه يمكن توظيف البروتينات القمعية إضافية وتعديلات بسيطة لبدء العمليات التي ينطوي عليها التكثيف لونين وإسكات الجينات 2. الحامض النووي أمر ضروري للتطور الطبيعي لأنه يلعب دورا حاسما في البرمجة التنموية، تمايز الخلايا، وقمع العناصر فيروسات، تعطيل كروموسوم X-والبصمة الجينية.
واحدة من أكثر الوسائل قوية لتحليل الحامض النووي هو الطفرات بيسلفيت. بيسلفيت الصوديوم هو المغير الحمض النووي التي deaminates cytosines إلى uracils. بعد التضخيم PCR وseque ncing، تم الكشف عن هذه الأحداث تحويل كما thymines. محمية cytosines ميثليته من نزع الأمين وهكذا تظل كما cytosines، مما يتيح تحديد الحامض النووي على مستوى فردي النوكليوتيدات 3. وقد تقدمت تطوير بيسلفيت فحص الطفرات من تلك التي ذكرت في الأصل 4-6 نحو تلك التي هي أكثر حساسية وقابلية للتكرار 7. وكان واحد تقدم مفتاح تضمين كميات صغيرة من الحمض النووي في حبة الاغاروز، ومن ثم حماية الحمض النووي من معاملة قاسية بيسلفيت 8. إلى أن يتم تنفيذ هذا التحليل مثيلة تمكين على برك من البويضات والأجنة في مرحلة الكيسة 9. والطفرات بيسلفيت الأكثر تطورا حتى الآن هو بروتوكول للأجنة في مرحلة الكيسة فرد 10. ومع ذلك، منذ blastocysts يكون على الخلايا متوسط 64 (التي تحتوي على 120-720 خريج من الحمض النووي الجيني)، وهذا الأسلوب غير فعال للدراسات مثيلة في البويضات أو الأجنة الفردية الانقسام المرحلة. خيمة "> أخذ القرائن من تضمين الاغاروز كميات الحمض النووي بما في ذلك البويضات الدقيقة 11، هنا نقدم وسيلة يتم من خلالها مباشرة جزءا لا يتجزأ من البويضات في الاغاروز وتحلل حبة حل استرجاع التالية فورا وإزالة الشفافة زونا من البويضة، وهذا يتيح لنا تجاوز التحديات الرئيسيان من بويضة واحدة الطفرات بيسلفيت: حماية كمية ضئيلة من الحمض النووي من تدهور، وفقدان لاحق خلال خطوات عديدة بروتوكول الأهم من ذلك، كما يتم الحصول على البيانات من البويضات واحد، هو القضاء مسألة التحيز PCR داخل حمامات وعلاوة على ذلك. ، غير مقصود تلوث الخلية الركامية قابلا للاكتشاف من قبل هذه الطريقة منذ يجوز استبعاد أي عينة مع نمط مثلأيشن واحد أو أكثر من تحليل 12. هذا البروتوكول يوفر طريقة أفضل للتحليل ناجحة وقابلة للتكرار من الحامض النووي على مستوى وحيدة الخلية، ويعتبر مثاليا لالبويضات الفردية، وكذلك الأجنة في مرحلة الانقسام.
البروتوكول
يوم 1
إعداد الحلول التالية العذبة في اليوم من جمع البويضة مع الماء، وعقيمة مثل الماء المقطر GIBCO. لتقليل فرصة التلوث الحمض النووي، وتغيير في كثير من الأحيان واستخدام قفازات نصائح مرشح. إبقاء الأنابيب الزاوية بعيدا عندما فتحها، وخلاصة كل أنابيب عندما لا تكون قيد الاستعمال. من المستحسن أن تتم الحلول كما ن +1.
3٪ LMP الاغاروز
30 ملغ نقطة انصهار منخفضة (LMP) الاغاروز
يصل إلى 1 مل GIBCO O 2 H
حل @ 70 درجة مئوي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا الفحص بويضة واحدة تحتوي على العديد من الخطوات مع عدد التي تعتبر بالغة الأهمية وتتطلب رعاية خاصة. الأول هو غسل البويضة. من المهم بشكل خاص لغسل كل بويضة عدة مرات في المتوسط الطازجة يسقط بعد العلاج هيالورونيداز لإزالة الركام وخلايا أكبر عدد ممكن. وعلاوة على ذلك، عند نقل البويضات إلى حل الحمضية tyrode لإزالة الشفافة زونا تأكد المحيطة المتوسط هو واضح من الخلايا الركامية. البويضة غير لزجة جدا بعد إزالة زونا، ويمكن بسهولة أي الخلايا الركامية المحيطة تصبح عالقا إلى البويضة. من الص.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل جامعة ويسترن اونتاريو، وقسم التوليد وأمراض النساء، ومنحة ER06-02-188 من البحوث Ministryof والابتكار، في وقت مبكر جائزة الباحث. وأيدت الاحزاب من قبل برنامج التدريب CIHR في التكاثر، والتنمية في وقت مبكر وتأثير ذلك على الصحة منحة دراسات عليا (REDIH).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
جدول معين من الكواشف والمعدات.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| مجموعة سيت | |||
| هيالورونيداز | سيغما | H4272 | |
| الحمضية Tyrode | سيغما | T1788 | |
| بروتين K | سيغما | P5568 | |
| 10٪ IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| تحلل الحل | |||
| تريس 7.5 درجة الحموضة | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | سيغما | L9650 | & Nباهوجان ساماج؛ |
| EDTA 8.0 درجة الحموضة | سيغما | E5134 | |
| اغطية | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | إينفيتروجن | P2325 | |
| SDS تحلل الواق | |||
| الشركة المصرية للاتصالات 7.5 درجة الحموضة | Bioshop (تريس) سيغما (EDTA) | TRS001.5 E5134 | |
| 10٪ SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| بيسلفيت التحويل | |||
| هيدروكسيد الصوديوم | سيغما | S8045 | |
| Hydrogensulfite الصوديوم (بيسلفيت الصوديوم) | سيغما | 243973 | ؛ |
| هيدروكينون | سيغما | H9003 | |
| منخفض الانصهار نقطة (LMP) الاغاروز | سيغما | A9414 | |
| الزيوت المعدنية | سيغما | M8410 | |
| M2 متوسط | سيغما | M7167 | |
| GIBCO ماء مقطر | إينفيتروجن | 15230-196 | |
| المعقمة مزدوج المقطر (د د) المياه | |||
| PCR | |||
| Illustra ميكس بداية ساخنة RTG | جنرال إلكتريك للرعاية الصحية | 28-9006-54 | |
| 240 نانوغرام / مل الحمض الريبي النووي النقال خميرة | إينفيتروجن | 15401-011 | |
| 5X رد الفعل GoTaq الأخضر الواق | المؤيدميجا | M7911 | |
| متداخلة الاشعال الداخلي والخارجي | سيغما | ||
| رباط | |||
| Promega pGEM-T المتجهات سهل | فيشر العلمية | A1360 | |
| TA الاستنساخ | |||
| الخلايا المختصة القولونية | الإنزيم بحوث كورب | T3009 | |
| معدات | |||
| تشريح مجهر | |||
| 70 درجة مئوية و 90 درجة مئوية الحرارة كتل | |||
| 37 درجة مئوية و 50 درجة مئوية Waterbaths (42 درجة مئوية لمدة التحولات) | |||
| المهزة | |||
| PCR آلة |
المراجع
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic bio....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
