Method Article

Nanotopology من التصاق الخلايا على متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM)

DOI:

10.3791/4133

⸱

October 2nd, 2012

 ,  ,  , 
1Hochschule Aalen, Institut für Angewandte Forschung

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم قياس طوبولوجيا من التصاق الخلية على ركيزة بدقة نانومتر بواسطة متغير الزاوية الداخلية انعكاس مجموع المجهري مضان (VA-TIRFM).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تحديد سطح طوبولوجيا، على سبيل المثال من الخلايا المتزايد على ركيزة، بدقة نانومتر بواسطة متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM). تزرع الخلايا على شرائح شفافة وحضنت مع علامة نيون متجانس في توزيع غشاء البلازما الخاصة بهم. الإضاءة يحدث من قبل شعاع الليزر موازية تحت زوايا متغير من التأمل الداخلي الإجمالي (TIR) ​​مع اختراق أعماق مختلفة من المجال الكهرومغناطيسي زائل. تسجيل الصور مضان على التشعيع في حوالي 10 زوايا مختلفة يسمح لحساب الخلية الركيزة المسافات مع دقة بضعة نانوميتر. وبالتالي يتم تحديد الاختلافات في الالتصاق بين مختلف خطوط الخلايا، مثل الخلايا السرطانية والخلايا الخبيثة أقل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن فحص التغييرات المحتملة من التصاق الخلية عند الكيميائية أو العلاج الضوئي. بالمقارنة مع غيرها من أساليب فائقة القرار يتم الاحتفاظ المجهر التعرض للضوءومن المتوقع الضرر صغيرة جدا، وليس من الخلايا الحية أن تحدث.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عندما شعاع ضوء نشر من خلال وسيط من ن معامل الانكسار 1 يلتقي واجهة لوسيلة الثاني من معامل الانكسار ن 2 <ن 1، الانعكاس الداخلي الكامل يحدث في جميع زوايا Θ الإصابة، والتي هي أكبر من الزاوية الحرجة = Θ ج جيب الزاوية القوسي (ن 2 / ن 1). على الرغم من أن تنعكس تماما شعاع ضوء الحادث يثير حقل الكهرومغناطيسي التي تخترق زائل في المتوسطة الثانية ويضمحل بشكل كبير، مع عمودي المسافة Z من واجهة وفقا لI (ض) = I 0 EZ / د (Θ). I (ض) يتوافق مع شدة المجال الكهرومغناطيسي ود (Θ) إلى عمق الاختراق في الطول الموجي λ، كما تم تقديمها من قبل

د (Θ) = (λ/4π) (ن 1 2 2 الخطيئة Θ - ن 2 2) -1 / 2

كما ورد في الأدب 1،2، I 0 يتوافق مع شدة الضوء الساقط مضروبا I ه مع ناقل حركة T عامل (Θ) ونسبة ن 2 / ن 1. إذا كان الحقل الكهربائي المتجه من هذا شعاع ضوء عمودي الاستقطاب لطائرة من الإصابة (أي طائرة امتدت من جراء الحادث وينعكس شعاع)، ويرد هذا العامل انتقال المرض من خلال

T (Θ) = 4 جتا 2 Θ / [1 - (ن 2 / NL 1) 2]

لكثافة مضان الكشف في القياسات TIRFM، امتصاص الضوء يجب أن تكون متكاملة على جميع طبقات من العينة وتضاعفت مع العائد مضان η الكم من الصبغة ذات الصلة وكذلك مع زاوية صلبة من Ω الكشف. وكما ذكر سابقا 3 يمكن أن توصف هذه الكثافة من قبل

I F (Θ) = AT (Θ) شو (ض) E-Z / د (Θ) DZ

إذا جميع العوامل التي هي مستقلة و يمكن حلها المضغوط يتم تضمين زاوية السقوط Θ وZ تنسيق داخل المعادلة A. ثابت التجريبية 3 التحليلية، إذا تم اعتبار تركيز ج (ض) من fluorophores أن تكون ثابتة تقريبا

- إما في جميع Δ ≥ Z إحداثيات، على سبيل المثال داخل السيتوبلازم من الخلايا وجود Δ المسافة من واجهة. في هذه الحالة، لابد من لا يتجزأ من حساب Δ = Z = ∞ إلى الياء مما أدى إلى

I F = A ج T (Θ) د (Θ) E-Δ / د (Θ)

- أو بين Z = Δ - T / 2 و z = Δ + T / 2، أي في غضون طبقة رقيقة من سمك ر، على سبيل المثال غشاء الخلية تقع على مسافة Δ من واجهة. في هذه الحالة، يمكن حساب كثافة مضان كما

I F = A ج T (Θ) TE-Δ / د (Θ)،

إذا ر صغير بالمقارنة مع Δ.

يمكن الأنف والحنجرة "> من المعادلات (4) و (5) مسافات الخلايا الركيزة تحسب Δ، إذا سجلت صور كثافة مضان I F لمتغير الزوايا Θ، وإذا LN (I F / T د) (مكافئ 4) أو يتم تقييم LN (I F / T) (مكافئ 5) بوصفها وظيفة من 1 / د لهذه الزوايا. للغشاء laurdan علامة المستخدمة في هذه الورقة (س. أدناه) تم إجراء تقييم وفقا للمعادلة 5.

وكما ذكر سابقا 3 الحصول على الصور، ويتطلب التقييم
- توزيع متجانس للضوء أكثر إثارة العينة،
- صلاحية نموذج 2-طبقة (مع مؤشرات الانكسار ن 1 ن 2 لوالركيزة والسيتوبلازم، على التوالي). هذا يحمل، إذا كان غشاء البلازما هي رقيقة جدا، وإذا كانت الطبقة المتوسطة من خارج الخلية (بين الخلية والركيزة) صغير مقارنة مع الطول الموجي للضوء الحادث.

وبالإضافة إلى ذلك، فتحة معتدلة العددية(عادة A ≤ 0.90) من عدسة المجهر الهدف هو مفيد لتجنب الانحرافات من السطوع بسبب تباين الإشعاع في حقل بالقرب من واجهة عازلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. البذر والحضانة من الخلايا

  1. الخلايا الفردية البذور، مثل U373-MG أو خلايا ورم أرومي دبقي U-251-MG في مناطق ذات كثافة نموذجية من 100 خلية / مم 2 على شريحة زجاجية وزراعتها ل4872 ساعة في ثقافة المتوسط ​​(على سبيل المثال RPMI 1640 تستكمل مع مصل العجل 10٪ الجنين والمضادات الحيوية) باستخدام حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. احتضان خلايا الغشاء مع علامة، على سبيل المثال 6 dodecanoyl-2-dimethylamino النفثالين (laurdan) تطبق لمدة 60 دقيقة عند تركيز من 8 ميكرومتر (في ثقافة المتوسط) 4، أو علامة السيتوبلازم، على سبيل المثال calcein acetomethlyester بطلب للحصول على 40 دقيقة في تركيز من 5 ميكرومتر 3، أو غشاء المرتبطة الضيائي، على سبيل المثال بروتوبرفيرين التاسع الناجمة على حضانة ساعة 4 مع السلائف 5-أمينوليفولنيك حمض (5-ALA؛ 1 ملم) 4،5.
  3. غسل الخلايا مع مستنبت أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) قبل المجهري مضان.

2. VA-TIRFM

  1. استخدام المجهر تستقيم، على سبيل المثال زايس Axioplan، واستبدال مكثف من قبل جهاز الإضاءة، كما هو موضح في المرجع. 3 مع نصفي كروية أو منشور زجاجي أسطواني نصفي بالإضافة إلى الشريحة بصريا كائن (انظر الشكل 1).
  2. استخدام شعاع الليزر موازية موازى التي كتبها بعد التصوير منظور الزجاج والمكونات البصرية أخرى (مثل مرآة مقعرة) مرة أخرى في شعاع نتائج موازية على سطح العينة (telecentric راي التلميذ). الحرص على أن الناقل هو مجال كهربائي عمودي الاستقطاب لطائرة من الإصابة.
  3. استخدام مرآة للتعديل الموجود داخل المكثف الذي التقط في الطائرة العينة وينير العينة تحت زاوية متغير من الإصابة (راي كائن). قد يكون الدافع وراء المرآة قابل للتعديل بواسطة محرك الخطوة، حيث كل موقف يتوافق مع زاوية محددة جيدا من الإصابة، على النحو الذي يحدده القياسات goniometric 3 سوب>.
  4. معايرة موقف الزاوي من المرآة للتعديل باستخدام الزاوية الحرجة = Θ ج 61،3 ° للانتقال الزجاج المياه كقيمة ثابتة. Θ يمكن ج يمكن تصور بناء على الاختلاف من Θ عندما يذوب صبغة الفلورسنت (على سبيل المثال 1 ملي النوكليوتيد فلافين، أحادي نوويد الفلافين) في الماء. موقف المرآة في Θ Θ = ج يتم تخزينها في المرآة برنامج تحديد المواقع.
  5. تعيين المعلمات من الكاميرا (عودة مضيئة أندور Ixon EMCCD، DV887DC، ANDOR التكنولوجيا، بلفاست، المملكة المتحدة 6)، بما في ذلك درجة الحرارة زيادة وقت التسجيل، وسرعة التحول.
  6. استخدام عدسة التكبير الهدف من الفتحة المناسبة والمعتدلة تفضيلي الرقمية (على سبيل المثال 40 × / 63 × 0،75 أو / 0،90 الغمر بالماء) وتوطين الشريحة الكائن في المجهر. استخدام زيت الغمر لضمان الاتصال البصري للعينة مع المنشور الزجاجي. تسجيل صور مضان من عينات متطابقة على الاختلاف منزاوية الإضاءة (Θ ≥ Θ Θ ج ج مع المقابلة إلى 64.5 ° للخلية واجهة من الزجاج). ويوصى مجموعة الزاوي من 66 ° -74 ° بخطوات من 0.5 ° ° 1 أو. استخدام تمريرة طويلة أو مناسبة الفرقة تمرير مرشح للكشف مضان.

3. تحليل البيانات

  1. قراءة الصور (على سبيل المثال في شكل ASCII) سجلت في زوايا مختلفة Θ، فضلا عن إعدادات الكاميرا (على خلفية التمييز)، والطول الموجي الإثارة ومعاملات الانكسار للزجاج (ن 1 = 1.52) وخلايا (ن 2 = 1.37) في برنامج التقييم (ابفيف؛ NanoCell). لتحسب كل مجموعة من المعلمات اختراق عمق د (Θ) ونقل عامل T (Θ) تلقائيا.
  2. حدد الصور المستخدمة لتقييم الخلايا الركيزة المسافات وفقا لمعادلة Δ 5 (علامة الغشاء) أو المعادلة 4 (السيتوبلازم علامة) والصور فردية مع غير متجانسةويجوز منع الإضاءة (ه كاشفة، ز. المشارب).
  3. صور حساب الخلايا الركيزة طوبولوجيا وحدد رمز اللون المناسب للعرض. يمكن عرض ملامح خلال تقييم بكسل الفردية، كما هو مبين في الشكل 2. ويمكن استخدام هذه التشكيلات كمؤشر لجودة مناسبة.
  4. تخزين بروتوكول التقييم.

4. ممثل النتائج

وتجرى التجارب مع الممثلين إلى الخلايا المهندسة وراثيا ورم أرومي دبقي U251-MG المقدمة من السادة الأستاذ يناير Mollenhauer، قسم علم الأورام الجزيئي، جامعة جنوب الدنمارك، أودنسي. في اثنين من تلك الخلايا subclones U251 هي الجينات الكابتة للورم أو TP53 PTEN الإفراط في استخدام أعرب تيت على اساس نظام محرض التعبير، بحيث تظهر هذه الخلايا إلى احتمال انخفاض مكون للأورام ويمكن ان تعتبر أقل الخبيثة. وتستخدم الخبيثة للغاية U251-MG خلايا الجينات القامع ودون ضوابط، و-U251MG نوع الخلايا البرية عمل لمزيد من المقارنة. ويستخدم كمصدر للإثارة ليزر ديود التي ينبعث منها A سلسلة شبه مستمرة من البقول بيكو ثانية (40 ميغاهيرتز LDH400 مع سائق PDL 800-B، Picoquant، برلين، ألمانيا؛ الطول الموجي: 391 نانومتر؛:؛ نبض الطاقة معدل الرسوب 12 PJ).

في الشكل 3 صور TIRFM من U251-MG الخلايا ورم أرومي دبقي مع الجين المنشط ورم القامع TP53 وحضنت مع laurdan (8 ميكرومتر، و 60 دقيقة) وصفت للزوايا الإصابة 66،0 °، 69.0 ° و 73.0 ° الموافق أعماق تغلغل زائل المجال الكهرومغناطيسي من حوالي 140 نانومتر و 75 نانومتر نانومتر و60، على التوالي. مع تناقص عمق الاختراق مضان يقلل كثافة في (انظر جداول)، وتنبع من مواقع أكثر سطحية من الخلايا (على سبيل المثال تنسيق الاتصالات على حوافها). خلية الركيزة مسافات (تصور في 3D الشكل من قبل رمز اللون تتراوح 0-600 نانومتر) تختلف بشدة على الخلايا بين علىلي بضعة نانوميتر (أبيض والأصفر) و250-300 نانومتر (الأحمر الداكن)، مثل الأسماء والتنسيق مسافات أكبر خلية الركيزة في منطقة قريبة. وينطبق ذلك على U251-MG ورم أرومي دبقي الخلايا مع الجينات القامع PTEN تنشيط (الشكل 4D)، في حين الخلايا الركيزة مسافات ثابتة بدلا عن U251-MG التحكم والخلايا النوع البري مع القيم النموذجية 80-100 نانومتر (أصفر؛ الشكل 4B ) و150-200 نانومتر (البرتقالي والاحمر، الشكل 4A).

figure-protocol-1
الشكل 1. جهاز الإضاءة لVA-TIRFM في المجهر تستقيم. مرآة للتعديل يقودها محرك الخطوة يسمح قرار الزاوي ° ± 0.25.

figure-protocol-2
الملف الشخصي التقييم الرقم 2. لمدة PIX ش (التخطيطي). عندما LN [I F / T (Θ)] يتم رسم بوصفها وظيفة من د / 1 (Θ)، المنحدر يمثل الركيزة الخلية Δ المسافة. عادة يتم تحديد هذا المنحدر مع دقة نحو ± 10٪. تم وضع علامة وتستبعد من التقييم - قيمة واحدة - الناتجة عن الإضاءة غير متجانسة.

figure-protocol-3
الرقم 3 صور TIRFM من U251-MG ورم أرومي دبقي مع الخلايا الجينات TP53 تنشيط القامع على الحضانة مع laurdan (8 ميكرومتر، و 60 دقيقة). سجلت في زوايا مختلفة من الإضاءة (AC)؛ الخلية الركيزة مسافات تتراوح بين 0-600 نانومتر أظهرت من قبل رمز اللون (د)؛ الطول الموجي الإثارة: 391 نانومتر، وكشف: ≥ 420 نانومتر؛ حجم الصورة: 210 × 210 ميكرومتر ميكرومتر اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

ogether.within صفحة = "دائما"> figure-protocol-4
الشكل 4 الخلوي الركيزة مسافات U251-MG الخلايا glioblatoma في مجموعة من 0-600 نانومتر يتضح من رمز اللون؛ (أ) نوع البرية (ب) الضوابط، (ج) خلايا الجينات القامع مع المنشط TP53، (د) الخلايا مع المنشط PTEN الجينات القامع؛ الطول الموجي الإثارة: 391 نانومتر، وكشف: ≥ 420 نانومتر؛ حجم الصورة: 210 × 210 ميكرومتر ميكرومتر اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصف طريقة لقياس الخلايا بدقة الركيزة مسافات نانومتر. في الوقت الحاضر، وطرق فائقة القرار المجهر، مثلا على أساس منظم الإضاءة 7 أو على واحد 8-10 كشف جزيء وكذلك حفز استنفاد الانبعاثات (STED) المجهري 11 هي ذات أهمية كبيرة. أي من هذه التقنيات، ومع ذلك، يسمح قرار المحوري أقل من 50 نانومتر. وبالإضافة إلى ذلك، بدلا من الإشعاع عالية 50100 وهناك حاجة W / سم 2 للطرق وجزيء واحد أكثر من 3،000 2 W / سم للفحص المجهري STED. هذا يتجاو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر لاند ولاية بادن فورتمبيرغ والاتحاد فندق Europäischer Europäische فون FÜR يموت ENTWICKLUNG regionale - للحصول على تمويل ZAFH الفوتون N، الفراء Bundesministerium Bildung اوند Forschung (BMBF) لتمويل منحة بحثية لا. 1792C08 وكذلك شركة محدودة ولاية بادن فورتمبيرغ، ستيفتونغ لتمويل مشروع "Aurami".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم شركة نوع تعليقات
حاضنة نونك نونك Cellstar
QM1300SVBA
الصفحي تدفق HOLTEN الآمن S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10٪ + 1٪ FCS البنسلين / الستربتوميسين BIOCHROM زراعة المتوسطة
كائن الشرائح الزجاجية مارينفيلد بيضاء نقية الزجاج إجراء التنظيف المستخدمة خاصة
6 dodecanoyl-2-dimethylamino النفثالين (laurdan) الجزيئية مجسات الفلورسنت علامة (محلول المخزون: 2 مم في الإيثانول)
مجهر كارل زايس Axioplan 1
ليزر ديود PicoQuant LDH 400 مع السائق PDL 800-B الطول الموجي: 391 نانومتر
واحد وضع نظام الألياف نقطة المصدر kineFlex يستخدم مع عدسات الموازاة
EMCCD الكاميرا ANDOR DV887DC الكاميرا الخلفية مضاءة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gingell, D., Todd, I. Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement. Biophys. J. 26, 507-526 (1979).
  2. Reichert, W. M., Truskey, G. A. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence. J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).
  3. Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device. J. Microsc. 211, 19-29 (2003).
  4. Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -P., Schneckenburger, H. Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields. Adv. Opt. Technol. 2008, 254317(2008).
  5. Lassalle, H. -P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM). J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).
  6. Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution. J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).
  7. Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).
  8. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
  10. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).
  11. Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. STED microscopy with continuous wave beams. Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).
  12. Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells. J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).
  13. Dougherty, T. J. Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours. Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).
  14. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).
  15. Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).
  16. Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
  17. Schneckenburger, H. Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Variable Angle TIRFMCell Adhesion TopologyFluorescence MicroscopyEvanescent Field PenetrationTotal Internal ReflectionFluorescent Membrane MarkerAdjustable Mirror CalibrationSubstrate Distance MeasurementCancer Cell ComparisonNanometer Resolution Imaging

Related Articles