Method Article

Nanotopology من التصاق الخلايا على متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM)

DOI:

10.3791/4133

⸱

October 2nd, 2012

 ,  ,  , 
1Hochschule Aalen, Institut für Angewandte Forschung

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم قياس طوبولوجيا من التصاق الخلية على ركيزة بدقة نانومتر بواسطة متغير الزاوية الداخلية انعكاس مجموع المجهري مضان (VA-TIRFM).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تحديد سطح طوبولوجيا، على سبيل المثال من الخلايا المتزايد على ركيزة، بدقة نانومتر بواسطة متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM). تزرع الخلايا على شرائح شفافة وحضنت مع علامة نيون متجانس في توزيع غشاء البلازما الخاصة بهم. الإضاءة يحدث من قبل شعاع الليزر موازية تحت زوايا متغير من التأمل الداخلي الإجمالي (TIR) ​​مع اختراق أعماق مختلفة من المجال الكهرومغناطيسي زائل. تسجيل الصور مضان على التشعيع في حوالي 10 زوايا مختلفة يسمح لحساب الخلية الركيزة المسافات مع دقة بضعة نانوميتر. وبالتالي يتم تحديد الاختلافات في الالتصاق بين مختلف خطوط الخلايا، مثل الخلايا السرطانية والخلايا الخبيثة أقل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن فحص التغييرات المحتملة من التصاق الخلية عند الكيميائية أو العلاج الضوئي. بالمقارنة مع غيرها من أساليب فائقة القرار يتم الاحتفاظ المجهر التعرض للضوءومن المتوقع الضرر صغيرة جدا، وليس من الخلايا الحية أن تحدث.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عندما شعاع ضوء نشر من خلال وسيط من ن معامل الانكسار 1 يلتقي واجهة لوسيلة الثاني من معامل الانكسار ن 2 <ن 1، الانعكاس الداخلي الكامل يحدث في جميع زوايا Θ الإصابة، والتي هي أكبر من الزاوية الحرجة = Θ ج جيب الزاوية القوسي (ن 2 / ن 1). على الرغم من أن تنعكس تماما شعاع ضوء الحادث يثير حقل الكهرومغناطيسي التي تخترق زائل في المتوسطة الثانية ويضمحل بشكل كبير، مع عمودي المسافة Z من واجهة وفقا لI (ض) = I 0 EZ / د (Θ). I (ض) يتوافق مع شدة المجال الكهرومغناطيسي ود (Θ) إلى عمق الاختراق في الطول الموجي λ، كما تم تقديمها من قبل

د (Θ) = (λ/4π) ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. البذر والحضانة من الخلايا

  1. الخلايا الفردية البذور، مثل U373-MG أو خلايا ورم أرومي دبقي U-251-MG في مناطق ذات كثافة نموذجية من 100 خلية / مم 2 على شريحة زجاجية وزراعتها ل4872 ساعة في ثقافة المتوسط ​​(على سبيل المثال RPMI 1640 تستكمل مع مصل العجل 10٪ الجنين والمضادات الحيوية) باستخدام حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. احتضان خلايا الغشاء مع علامة، على سبيل المثال 6 dodecanoyl-2-dimethylamino النفثالين (laurdan) تطبق لمدة 60 دقيقة عند تركيز ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصف طريقة لقياس الخلايا بدقة الركيزة مسافات نانومتر. في الوقت الحاضر، وطرق فائقة القرار المجهر، مثلا على أساس منظم الإضاءة 7 أو على واحد 8-10 كشف جزيء وكذلك حفز استنفاد الانبعاثات (STED) المجهري 11 هي ذات أهمية كبيرة. أي من هذه التقنيات، ومع ذلك، يسمح قرار المحوري أقل من 50 نانومتر. وبالإضافة إلى ذلك، بدلا من الإشعاع عالية 50100 وهناك حاجة W / سم 2 للطرق وجزيء واحد أكثر من 3،000 2 W / سم للفحص المجهري STED. هذا يتجاو.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر لاند ولاية بادن فورتمبيرغ والاتحاد فندق Europäischer Europäische فون FÜR يموت ENTWICKLUNG regionale - للحصول على تمويل ZAFH الفوتون N، الفراء Bundesministerium Bildung اوند Forschung (BMBF) لتمويل منحة بحثية لا. 1792C08 وكذلك شركة محدودة ولاية بادن فورتمبيرغ، ستيفتونغ لتمويل مشروع "Aurami".

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم شركة نوع تعليقات
حاضنة نونك نونك Cellstar
QM1300SVBA
الصفحي تدفق HOLTEN الآمن S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10٪ + 1٪ FCS البنسلين / الستربتوميسين BIOCHROM زراعة المتوسطة
كائن الشرائح الزجاجية مارينفيلد بيضاء نقية الزجاج إجراء التنظيف المستخدمة خاصة
6 dodecanoyl-2-dimethylamino النفثالين (laurdan) الجزيئية مجسات الفلورسنت علامة (محلول المخزون: 2 مم في الإيثانول)
مجهر كارل زايس Axioplan 1
ليزر ديود PicoQuant LDH 400 مع السائق PDL 800-B الطول الموجي: 391 نانومتر
واحد وضع نظام الألياف نقطة المصدر kineFlex يستخدم مع عدسات الموازاة
EMCCD الكاميرا ANDOR DV887DC الكاميرا الخلفية مضاءة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gingell, D., Todd, I. Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement. Biophys. J. 26, 507-526 (1979).
  2. Reichert, W. M., Truskey, G. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Variable Angle TIRFMCell Adhesion TopologyFluorescence MicroscopyEvanescent Field PenetrationTotal Internal ReflectionFluorescent Membrane MarkerAdjustable Mirror CalibrationSubstrate Distance MeasurementCancer Cell ComparisonNanometer Resolution Imaging

Related Articles