مقالة منهجية

A بروتوكول بسيط لاستخراج اليرقات من Hemocytes البرية

DOI:

10.3791/4173

⸱

نوفمبر 15, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, The George Washington University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hemocytes الحشرات تنفيذ العديد من الوظائف الهامة، سواء المناعي وغير المناعة، في جميع مراحل التنمية الحشرات. معرفتنا الحالية للأنواع كرية دموية وظيفة يأتي من الدراسات على نماذج جينية الحشرات. هنا، نقدم طريقة لاستخراج، وقياس تصور hemocytes من اليسروع البرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hemocytes الحشرات (أي ما يعادل الثدييات خلايا الدم البيضاء) تلعب دورا هاما في العديد من العمليات الفسيولوجية في جميع أنحاء دورة حياة حشرة 1. في مراحل اليرقات من الحشرات تنتمي إلى أوامر من قشريات الجناح (الفراشات والعث) وذوات الجناحين (الذباب الحقيقي)، وتشكل hemocytes من الغدة الليمفاوية (جهاز متخصص المكونة للدم) أو الخلايا الجنينية ويمكن حملها حتى المرحلة الكبار. ويشارك في الهجرة hemocytes الجنينية الخلايا خلال تنظيم وتطوير الكيميائي أثناء الالتهاب. كما تشارك في موت الخلايا المبرمج الخلية وضرورية لمرحلة التطور الجنيني 2. Hemocytes توسط الذراع الخلوية للاستجابة المناعة الفطرية الحشرات التي تضم عدة وظائف، مثل انتشار الخلايا تجميع الخلية، وتشكيل عقيدات، البلعمة والتغليف من الغزاة الأجانب 3. كما أنها مسؤولة عن تدبير محدد الدفاعات الخلطية الحشرات خلال العدوى، مثل العلاقات العامةoduction من الببتيدات المضادة للميكروبات والجزيئات الأخرى المستجيب 4، 5. وقد تم أساسا مورفولوجيا كرية دموية وظيفة درس في نماذج الحشرات وراثية أو فسيولوجية، بما في ذلك ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا 6، 7، الزاعجة المصرية البعوض وأنوفيليس غامبياي 8 و 9 وhornworm التبغ، ماندوكا سيكستا 10 و 11. ومع ذلك، توجد معلومات قليلة حول التنوع حاليا، والتصنيف، ومورفولوجيا وظيفة hemocytes في أنواع الحشرات غير نموذج، وخصوصا تلك التي تم جمعها من البرية ال 12.

نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة وفعالة لاستخراج hemocytes من اليسروع البرية. ونحن نستخدم ما قبل الأخيرة الطور Lithacodes المتورقة (أصفر الكتف فراشة سبيكة) (الشكل 1) وEuclea delphinii (البلوط شائك سبيكة) اليسروع (قشريات الجناح: Limacodidae) وتبين أن كميات كافية من الدملمف (الدم الحشرات)يمكن أن تكون معزولة وأرقام كرية دموية عد من اليرقات الفردية. ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة كفاءة أنواع كرية دموية في هذه الأنواع وكذلك في غيرها من اليسروع lepidopteran ذات صلة تحصد من الميدان، أو يمكن أن الجمع بين المقايسات المناعية بسهولة مع مصممة للتحقيق وظيفة كرية دموية بعد العدوى الميكروبية أو الكائنات مع الطفيلي 13.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير المواد

  1. إعداد الإبر (1-2 و 3-4 ميكرون تلميح تفتق مم) باستخدام أنابيب زجاجية البورسليكات الشعرية ومجتذب micropipette. ضبط الصك: منحدر: 561؛ السرعة: 20؛ الحرارة: 560؛ التأخير: 1؛ سحب: 100؛ الضغط: 500.
  2. إعداد الحل ال: 60٪ من متوسط ​​غريس (GM) تستكمل مع 10٪ من مصل بقري جنيني (FBS) و 20٪ من الاحتياطي تخثر (98 ملي مول هيدروكسيد الصوديوم، 186 مم كلوريد الصوديوم، 1.7 ملي مول EDTA و 41 حمض الستريك ملي، ودرجة الحموضة 4.5 ). ويتم إعداد الحل أعلاه الطازجة تحت ظروف معقمة ويحرص على الجليد في جميع الأوقات.
  3. إعداد الحل عازلة الحضانة: 90٪ من GM تستكمل مع FBS 10٪ من. كما يتم إعداد هذا الحل الطازجة وأبقى على الجليد في جميع الأوقات.
  4. إعداد ما مجموعه لا يقل عن 15 × ميكرولتر عدد من الحشرات لجمع كل من والحلول الحضانة.

2. حقن اليرقات مع الحل كوكتيل

  1. تخدير الإضافية قبل الأخيرةاليرقات من القطران تقشعر لها الأبدان منهم على الجليد لمدة 20 دقيقة قبل استخراج كرية دموية.
  2. تناسب نهاية حادة من إبرة نظيفة الشعرية (عيار 16) إلى أنابيب متصلة حقنة 20 مل زجاج (الشكل 2). ترك الأنبوب الذي يحتوي على حل جمع فتح على مقاعد البدلاء المختبر وملء ببطء مع الشعرية المخزن المؤقت. يتم تعبئة عادة مع حوالي 10-15 الشعرية ميكرولتر من حل جمع، وهذا يتوقف على حجم الدودة (حل ما يقرب من 1 ميكرولتر من 10 ملغ لكل كتلة الجسم الكلي CATERPILLAR = 0.01٪ من مجموع كتلة الجسم). ضع الإبرة على الكرة من الطين التي يتم وضعها بجوار المجهر تشريح.
  3. وضع كاتربيلر في طبق بتري. وينبغي وضع الحشرة على جانبها بحيث spiracles واضحة للعيان (الشكل 3).
  4. أثناء عرض تشريح تحت المجهر، عقد في مكان مع يرقة زوج من ملقط ووضع وثيقة الإبرة إلى واحدة من spiracles، حيث فيبشرة أكثر نعومة الطائفة عموما. اضغط بلطف إبرة الشعرية ضد جسم الحشرة. وبمجرد أن الإبرة قد اخترقت بشرة، وضخ الحجم الكلي للحل في CATERPILLAR (الشكل 3). من المهم تجنب فقاعات الهواء عن طريق الحقن في CATERPILLAR. وجسم اليرقة لتنتفخ (على سبيل المثال، زيادة في حجم التداول بنسبة 20٪) بعد الحقن ولكن لا ينبغي أن تنفجر أو طين.
  5. العودة الدودة إلى الجليد، وتحديد المواقع الحشرة ظهريا لمنع العازلة من تسرب للجرح (الشكل 3).
  6. كرر الخطوات من 2،1-2،4 لكل كاتربيلر المستخدمة لاستخراج الدملمف. في هذه المرحلة، السماح لجميع الحشرات لفتور على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل المتابعة.

3. استخراج Hemocytes

  1. وضع كاتربيلر في طبق بتري تحت المجهر تشريح.
  2. جعل الضحلة (2-3 مم) شق في المنطقة الخلفية لCATERPILLAR باستخدام معقم scalpe L (الشكل 3). والحرص على عدم الإضرار الأمعاء أو الأعضاء الداخلية الأخرى، والهدف من ذلك هو ثقب بشرة بعناية وجمع مزيج العازلة / الدملمف تحتوي على hemocytes من الحشرات الفردية.
  3. ضغط على CATERPILLAR بلطف باستخدام ملقط بلاستيكية مرنة في حين جمع المزيج الدملمف (تقريبا 10-20 ميكرولتر) مع نصيحة 10 ميكرولتر ماصة، مع الحرص على عدم مرة أخرى تجرح الأنسجة الداخلية (الشكل 3). يتم جمع الدملمف من قطرات ضغط من جسم اليرقة ل. تجاهل بقايا الدودة ل.
  4. جمع الدملمف من كل CATERPILLAR الفردية في منفصلة المسمى siliconized 0،5 مل أنابيب microcentrifuge.
  5. إضافة حجم مساو من الحل الحضانة (تقريبا 10-20 ميكرولتر) إلى كل عينة تم جمعها من الدملمف CATERPILLAR الفردية. الحفاظ على عينات الدملمف على الجليد في جميع الأوقات.
  6. كرر الخطوات من 3،1-3،5 لكل كاتربيلر المستخدمة في التجربة.
جنيه "> 4. الكمي لHemocytes

  1. خلط العينة الدملمف والحل الحضانة على الفور قبل hemocytes العد. هذا العلاج يسمح لفصل الصحيح من hemocytes ويمنع تراكمها.
  2. استخدام تلميح ماصة نظيفة لنقل 10 ميكرولتر من العينة الدملمف مختلطة مع الحل الحضانة على عدادة الكريات.
  3. باستخدام المجهر المركب، عد وتسجيل عدد من hemocytes في ما لا يقل عن 15 من الساحات الكبيرة (مساحة مربع واحد: 0.04 مم 2، العمق: 0.1 ملم) من الشبكة المركزية للعدادة الكريات (الشكل 3). إضافة هذه القيم للحصول على المجموع الكلي لعدد hemocytes في الساحات 15.
  4. شطف عدادة الكريات وتراجعه غطاء جيدا باستخدام زجاجة غسل بالماء المقطر منزوع الأيونات وجففي ومع Kimwipes (كيمبرلي كلارك) بين كل عينة.
  5. كرر الخطوات من 4،1-4،4 لكل عينة الدملمف.
  6. حساب متوسط ​​عدد hemocytes لكل مل من VOLUM الدملمفه لكل يرقة، على النحو التالي:

الحجم الكلي للكل مربع من الشبكة عدادة الكريات: (0.04 مم 2 منطقة) × (0.1 مم العمق) = 0.004 × 15 مم 3 = 0.06 مم الساحات 3 = الحجم الكلي للجميع الساحات 15 فرزها.

(مجموع العدد الإجمالي للhemocytes في الساحات عد 15 / الحجم الكلي للجميع الساحات عد 15) × 2 = عامل تخفيف عدد hemocytes / مم 3 × 1000 = عدد hemocytes / مل من الدملمف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للجمع وحدة تخزين الحد الأدنى من 10-20 ميكرولتر من الدملمف الحشرات من اليسروع الفردية. Hemocytes جمعها باستخدام هذه الطريقة خالية من التثاقل الخلية، وعيوب التصبغ، والحطام الأنسجة أو غيرها من الملوثات. بالتالي يمكن بسهولة ملاحظة hemocytes وعدها تحت المجهر، ويمكن ملاحظة العديد من الحشرات داخل هوسور قليلة. لاحظنا أن أغلبية hemocytes في عينات لدينا يتألف من plasmatocytes 3 ​​(hemocytes نشر غير متماثلة) (الشكل 4). نحن حاليا تميز الأ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سبق طرق لاستخراج hemocytes من الحشرات الهامة طبيا والحشرات نموذج lepidopteran ذكرت 9 و 14. يتم تكييفها طرق استخراج كرية دموية وفقا لأنواع الحشرات، والمرحلة التنموية للحشرة ومميزاته المورفولوجية. على سبيل المثال، يمكن عزل اليرقات من الدملمف ماندوكا يقوم بسهولة من قبل القص القرن المنحني قرب نهاية البطن 15. لأن اليسروع سبيكة (Limacodidae) تفتقر هذه البنية في البطن، وقد وضعنا بروتوكولا متميزة لاستخراج الدملمف من اليرقات الصغيرة الحجم التي تم جمعها ميداني...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد من قبل TMS زمالة الاستئماني هارلان (GWU) خلال هذه الدراسة. تمويل الجمع الميداني وتربية L. المتورقة وE. وقدمت منحة delphinii من قبل NSF DEB 0642438 لJTL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم تعليقات
Micropipette مجتذب سوتر الآلات P-1000
أنابيب زجاجية البورسليكات سوتر الآلات B100-50-10 OD: 1.0، ID: 0.50 مم
غريس متوسطة سيجما G8142
المصل البقري الجنين الحرارية فيشر العلمية SH3007102 الحرارة المعطل
دومون # 5 ملقط أدوات العلوم الجميلة 11252-40
عدادة الكريات نويباور Hausser العلمية 3200
البلاستيك TUBIنانوغرام ثلاثي التقنية TT-3-32OD OD: 3/32''، ID: 1/32 '
الزجاج حقنة طبية فورتونا اوبتيما D-97877 حجم 50 مل
إبرة حادة نهاية قطع صغيرة NE-162PL-25 16 مقياس س 1 "طول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677(2006).
  2. Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542(2007).
  3. Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1(2008).
  4. Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373(2011).
  5. Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743(2011).
  6. Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651(2011).
  7. Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249(2011).
  8. Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218(2010).
  9. Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891(2006).
  10. Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181(2010).
  11. Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840(2009).
  12. Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417(2006).
  13. Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805(2004).
  14. Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63(2008).
  15. Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695(2010).
  16. Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة