1. خلية ثقافة
- ثقافة MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي البشري (مجموعة الثقافة الأمريكية نوع) في RPMI-1640 (إينفيتروجن، ألمانيا) أن تستكمل مع FCS 10٪ (سيغما، ألمانيا). الحفاظ على جميع الثقافات في ظل ظروف قياسية (37 درجة مئوية، والجو مرطب، أول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2) ومرور الخلايا 2-3 مرات في الأسبوع للحفاظ على النمو في لوغاريتمي. لنموذج حيواني هو موضح أدناه، ليست هناك حاجة لاستخدام العظام محددة sublines من MDA-MB-231 الخلايا، حيث وصل سعر تأخذ الورم أكثر من 90٪ 1.
- حصاد شبه متموجة الخلايا السرطانية بعد استخدام 2 ملم EDTA في برنامج تلفزيوني، (الفوسفات مخزنة المالحة دون كا 2 + و 2 ملغ +) و 0.25٪ التربسين (سيغما، Taufkirchen، ألمانيا). عدد MDA-MB-231 الخلايا في غرفة 1 نويباور وتعليقها في RPMI-1640 (5x10 5 خلايا في 1 مل).
2. عارية نموذج الفئران الانبثاث العظام
- تمت الموافقة على جميع التجارب التي أنيما الحكومية المسؤولةل لجنة للأخلاقيات.
- استخدام الفئران عارية في عمر من 6-8 أسابيع والاحتفاظ بها في ظروف خالية من مسببات الأمراض في نظام الحيوانات الصغيرة المناسبة (على سبيل المثال مصغرة حاجز النظام). إبقاء الحيوانات تحت ظروف خاضعة للرقابة (21 + / - 2 درجة مئوية درجة حرارة الغرفة والرطوبة 60٪، و 12 ساعة ضوء الظلام إيقاع)، وتقدم خدمة مشبع والمياه libitum الإعلانية للفئران.
- قبل جراحة الحيوان، حقن دواء مسكن (على سبيل المثال كاربروفين 4 ملغ / كلغ SC؛ بسبب إدارته واحدة وقصيرة العمر النصفي (حوالي 8 ساعات)، وينبغي أن لا يؤثر كاربروفين نمو الورم). تخدير الفئران مع خليط من الأكسجين (0.5 لتر / دقيقة)، وisoflurane (1-1.5 المجلد٪)، وتأكد من أن الفئران غير صحيح تخدير ويتنفس بانتظام قبل البدء في الإجراء التالي.
- وضع الحيوان تخدير تحت مجهر مجهر التشغيل المناسب (على سبيل المثال لايكا) والعمل مع تضخم من 16 أضعاف.
- البدء في إجراء العمليات الجراحية عن طريق قطع الجلد والنسيج تحت الجلد في inguإينال منطقة بطول 2-3 سم باستخدام المقص (BC060r ايريس مقص 108 مم). جميع الشرايين المتفرعة من الشريان الفخذي (FA) لا بد من تشريح بما في ذلك الشريان الشرسوفي السطحي (SEA)، الشريان الركبي النازل (DGA)، الشريان المأبضية (السلطة الفلسطينية) والشريان الصافن (SA).
- وضع مقاطع على شريان الفخذ القريبة من الأصل في البحر، وكذلك على DGA والسلطة الفلسطينية وSA إلى انسداد تدفق الدم مؤقتا المحلية. Ligate البحار في جانبها البعيدة للسماح بفتح هذه السفينة من دون نزف (الشكل 1A).
- قطع البحر باستخدام مقص (Vannas الصغرى، جمعية الهلال الأحمر السعودي، مخدد STR 85 مم) القريبة من الربط (الشكل 1B) وإدارة حل papaverin 1٪ على البحار، لتسهيل إدخال لاحق من إبرة بسبب استرخاء للسفينة ( الشكل 1C).
- قطع ما يقرب من نصف قطرها في البحر مع مقص وادخال ابرة (0.3 مم القطر و 42 ملم طول) في التجويف من البحر بينما holdiنانوغرام في نهاية قطع من السفينة مع ملقط (1D الشكل، E). عندما تكون متاحة، وإصلاح الإبرة في جهاز خارجي للحد من تحركات غير النظامية التي يمكن أن تؤدي إلى ثقب في جدار الوعاء الدموي. ربط حقنة لإبرة. إزالة مقطع من اتحاد كرة القدم القاصي ووضعه على الشريان الصافن (الشكل 1F).
- حقن الخلايا MDA-MB-231 تعليق في وسائل الإعلام 0.2 مل ببطء الى البحر. بحكم من لقطات وتوجه MDA-MB-231 الخلايا إلى DGA والسلطة الفلسطينية. إزالة الإبرة وligate البحر لمنع النزيف قبل أن تقلع لقطات الشريان. إغلاق الجرح باستخدام مقاطع الجراحية وإنهاء التخدير عن طريق الاستنشاق.
- لمرحلة ما بعد إجراء الرصد، ويصرح باستخدامها عادة الفئران 7-8 أسابيع بعد تلقيح الخلية السرطانية لتجنب المضاعفات الهيكل العظمي الشديد. خلال هذا الوقت، يجب مراقبة الحيوانات يوميا لتقييم حجم الورم وأية أدلة من الألم (على سبيل المثال، الانحرافات السلوكية، وفقدان الوزن، وعيوب السيارات). إذا تبين وجود ورم الحيواناتحجم يتجاوز الحد المسموح به أخلاقيا أو أدلة من الألم أثناء نمو الورم، لديهم ليتم التخلص.
- واستخدمت المناعية التي تعاني من نقص (عارية) الفئران لزرع أجنبي المنشا من الإنسان MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي. لم يكن اختيار الفئران عارية لتصور أفضل للورم متزايد.
3. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)
- بعد تلقيح الخلية السرطانية، والسماح حوالي 25-30 يوما من نمو الورم قبل بدءا من التصوير. بالنسبة للسيد التصوير استخدام ماسح ضوئي مخصص التجريبية أو نظام MR الإنسان مع الحيوان لفائف المناسبة. استخدمنا الإنسان السيد نظام (السمفونية، وسيمنز، ألمانيا)، وملف محلي الصنع لإثارة موجات اللاسلكية، والكشف، والتي صممت لتكون حجم أسطواني مرنان مع قطرها الداخلي 83 ملم وبطول 120 ملم صالحة للاستعمال من (الشكل 2A).
- تخدير الفئران مع الاوكسجين وisoflurane على النحو الوارد أعلاه. وضع قسطرة في الوريد الذيل واصلاحها على الذيل باستخدام الصنبور ه. ربط حقنة تحتوي على النقيض من وكيل (على سبيل المثال 0.1 ملمول / كغم GD-DTPA في ما يقرب من 0.5 مل؛ Magnevist، وباير شيرينغ، وألمانيا).
- وضع فأر في نظام MR الحفاظ على التخدير عن طريق الاستنشاق. يبدأ تسلسل MR المورفولوجي لتحديد الانبثاث العظام (على سبيل المثال T2 المرجحة: توربو تسلسل صدى تدور، TR 3240 مللي، الشركة المصرية للاتصالات 81 مللي، مصفوفة 152 × 256، 90 × 53،4 FOV 2 مم، سماكة 1.5 ملم شريحة، و 3 متوسطات والمسح الضوئي الساعة 3:40 دقيقة).
- تحديد شريحة من الانبثاث العظام التي لديها أكبر قطر وبدء تسلسل لDCE، التصوير بالرنين المغناطيسي (مثل التشبع تسلسل استرداد فلاش توربو، TR 373 مللي، الشركة المصرية للاتصالات 1.86 مللي، مصفوفة 192 × 144، 130 × 97،5 FOV 2 مم، سماكة شريحة 5 مم، وقياسات 512، المتوسطات 1، مسح دقيقة 06:55 الوقت). بعد ما يقرب من 30 ثانية، والبدء في حقن عامل تباين على مدى فترة زمنية من 10 ثانية. الوقت الإجمالي للإجراءات المذكورة أعلاه لإجراء فحص التصوير بالرنين المغناطيسي هو 15-20 دقيقة تقريبا لكل حيوان.
عنوان "> 4. الحجمي التصوير المقطعي (VCT)
- اختيار نظام CT المناسبة، سواء للإنسان أو ماسح التجريبية. هنا، استخدمنا نموذجا أوليا لالمسطحة مجهزة الحجمي جهاز التصوير المقطعي المحوسب (الشكل 2B، حجم CT، سيمنز، ألمانيا).
- تخدير الفئران مع الاوكسجين وisoflurane على النحو الوارد أعلاه. وضع قسطرة في الوريد الذيل واصلاحها على الذيل باستخدام الشريط. ربط حقنة تحتوي على وكيل النقيض من (مثل اليود 1 غرام لكل كيلوغرام في ما يقرب من 0.5 مل؛ Imeron 400، براكو، ألمانيا).
- وضع فأر على الماسح الضوئي تحت التخدير عن طريق الاستنشاق. استخدم المعلمات التالية لمسح VCT: أنبوب الجهد 80 كيلو فولت، أنبوب الحالي 50 سرعة دوران مللي أمبير، والمسح مرة 51 ثانية، 10 ثانية، لقطة في 120 ثانية، مصفوفة 512 × 512 وشريحة سمك 0.2 ملم. حقن عامل تباين خلال التناوب الثانية من نظام المسطحة. الوقت الإجمالي للإجراءات المذكورة أعلاه لإجراء فحص VCT هو 5-10 دقيقة تقريبا لكل أنيمآل.
- إعادة بناء الصور مع FDK المحورة (Feldkamp-ديفيس، كريس) مخروط الشعاع الإعمار الخوارزمية (نواة H80a، عفراء، ألمانيا).
5. الموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة)
- التجريبية والسريرية نظم الولايات المتحدة تتوفر لهذا الغرض. استخدمنا السريرية نظام ACUSON سيكويا نظام الموجات فوق الصوتية مع 512 محول خطي 15L8 (الشكل 2C؛ سيمنز ACUSON، ماونتن فيو، كاليفورنيا).
- تخدير الفئران مع الاوكسجين وisoflurane على النحو الوارد أعلاه. وضع قسطرة في الوريد الذيل واصلاحها على الذيل باستخدام الشريط. ربط حقنة تحتوي على عامل تباين microbubble (على سبيل المثال 1.6 مل / كغ في ما يقرب من 0.5 مل؛ SonoVue، براكو، ايطاليا). إصلاح محول الولايات المتحدة في مباراة الذهاب للهند منها باستخدام ترايبود وتطبق الولايات المتحدة هلام بين محول والساق الخلفية.
- أداء B-طريقة التصوير (تواتر نقل: 17 ميغاهرتز؛ مؤشر الميكانيكية: 0.51) لتحديد أكبر قطر الانبثاث العظام وإصلاح محول تي فيموقفه. إضافة دوبلر إشارة على B-وضع الصور للحصول على معلومات عن نضح الأنسجة. يرجى الأخذ في الاعتبار أن الآفات فقط والتي تعطل العظام القشرية هي في متناول موجات الولايات المتحدة.
- لدينامية على النقيض المعززة الولايات المتحدة (DCE والولايات المتحدة) تعيين الجهاز الولايات المتحدة في المقابل إيقاع نبض التسلسل (CPS) واسطة (وتيرة انتقال: 7 ميغاهيرتز، مؤشر الميكانيكية: 0.18)، حقن microbubbles وتسجيل حلقة سينمائية ثانية من طول 90. الوقت الإجمالي للإجراءات المذكورة أعلاه لإجراء فحص الولايات المتحدة ما يقرب من 10-15 دقيقة لكل حيوان.
6. تحليل نتائج العمل من بيانات التصوير
- استخدام المعلومات الصرفية من التصوير بالرنين المغناطيسي، VCT والولايات المتحدة لوصف ورم الأنسجة الرخوة (التصوير بالرنين المغناطيسي، الولايات المتحدة) وتدمير الهيكل العظمي (VCT) من الانبثاث العظام، وتحديد موقع وحجم الآفة وحجم الآفات مع المشاهد ديكوم (على سبيل المثال سيريكس ديكوم المشاهد).
- للحصول على نمط المتفرعة من السفن في الانبثاث العظام (القسطرة)، ويمكن استخدام البيانات VCT. إعادةبناء الصور 2D أو 3D باستخدام المعلومات للمرحلة شرياني مع أو بدون تقنيات الطرح (على سبيل المثال سيريكس ديكوم المشاهد).
- من أجل تحديد معالم الأوعية الدموية من DCE-MRI، DCE VCT-DCE والولايات المتحدة، واستخدام أدوات برامج محددة لطرائق. لDCE، التصوير بالرنين المغناطيسي، وتحديد السعة المعلمات الأوعية الدموية A (المرتبطة حجم الدم) وسعر الصرف ثابت ك EP (المرتبطة نضح والنفاذية السفينة) في الانبثاث العظام مع مختبر داينا (Mevis بحوث، بريمن، ألمانيا) على أساس حل الدولتين، نموذج مقصورة من 8،9 بركس. نماذج بديلة لتقييم الدوائية المتاحة، على سبيل المثال نموذج Tofts 10.
- لتحديد DCE-VCT البيانات، وإجراء التحليل الوصفي للبيانات لحساب البارامترات مثل المنطقة تحت المنحنى (AUC) أو ذروة تعزيز (PE) مع مختبر داينا (Mevis بحوث، بريمن، ألمانيا).
- كمية المعلومات في الوقت الحقيقي من الولايات المتحدة وDCE باستخدام برامج التحليل الكمي (على سبيل المثال Qontrasتي، براكو، ايطاليا) عن طريق تحليل سينمائى الحلقات وفقا للنموذج البلعة حقن تنفيذها. وضع المنطقة من اهتمام (ROI) على مدى الانبثاث العظام، وتحديد العوامل إما وصفي مثل المنطقة تحت المنحنى أو العوامل الكمية من مرمزة خرائط، على سبيل المثال حجم الدم الإقليمية والإقليمية من تدفق الدم وملء الوقت.
7. ممثل النتائج
بعد حقن intraarterial من MDA-MB 231-خلايا في البحر (الشكل 1)، الانبثاث العظام في مواقع محددة في وضع الساق الخلفية الخاصة بكل من الفئران عارية. آفات عظمية تقتصر على عظم الفخذ، ويمكن تصوير الظنبوب والشظية غير جراحية بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي، VCT والولايات المتحدة (الشكل 2) ابتداء حوالي 25-30 حقن آخر أيام ومتابعتها، لعدة أسابيع. عند الجمع بين التصوير بالرنين المغناطيسي، والولايات المتحدة بما في ذلك VCT الأم وتقنيات متقدمة على النقيض، يمكن تقييم المعلومات التكميلية في الانبثاث العظام التي تتكون من الأنسجة الرخوةورم (الخلايا السرطانية وسدى) وآفة عظمية كل منها (تدمير العظام). لمقارنة البيانات بين كل التقنيات، ويمكن استخدام كل طرائق التصوير 3 بالتتابع في الفأر نفسه. التصوير بالرنين المغناطيسي يعرض التشكل من أنسجة العظام لينة النقيلي أن يقتصر في البداية حتى العظم تجويف نخاع العظم ويزيد في وقت لاحق القشرية في مسيرة التنمية. ويمكن الحصول على المعايير الفنية مثل الإقليمية نضح الدم، وحجم والنفاذية السفينة من التصوير بالرنين المغناطيسي، DCE وكميا (الشكل 3). الهيكل العظمي، والتغييرات في عظمية خاصة في الانبثاث يتم تقييمها بدقة عالية من قبل VCT. مكملة لنتائج التصوير بالرنين المغناطيسي، وتقع بالقرب من آفات عظمية داخل النقي نمو الورم. VCT تصوير الأوعية يكشف عن بنية macrovessel تتغير من الانبثاث العظام، وDCE-VCT يعرض الجوانب ذات الصلة من دوران الأوعية الدقيقة (الشكل 4). بسبب تدمير المحلية من العظام القشرية في metastatiج الآفات، الولايات المتحدة ينطبق على تقييم الميزات الشكلية والوظيفية للورم الأنسجة اللينة من خلال استخدام B-وضع وتقنيات دوبلر. بناء على طلب من microbubbles، DCE والولايات المتحدة يسمح في الوقت الحقيقي التصوير من الأوعية الدموية في الانبثاث العظام (الشكل 5).

الشكل 1. الساق الخلفية من الفئران عارية المعدة للتلقيح الخلية السرطانية كما التقط من خلال مجهر العملية. وثمة نمط، المتفرعة من الشريان الفخذي (FA) بما في ذلك الشريان الشرسوفي السطحي (SEA)، الشريان الركبي النازل (DGA)، الشريان المأبضية (السلطة الفلسطينية) والشريان الصافن (SA). مقاطع الشرايين وضعت على SA والسلطة الفلسطينية والاتحاد الداني، فضلا عن ربط من البحر، B، وقطع البحر القريبة من الربط، C، استرخاء العضلات من البحر بعد إضافة بابافيرين، D، شق البحار (التي تولاها الملقط)، E، إدخال الإبرة في البحر، F، إبرة تركز اهتمامها في البحار (فاي خارجي xating الجهاز)، والحقن من MDA-MB 231-الخلايا السرطانية عن طريق البحر الى DGA والسلطة الفلسطينية بموجب مقاطع.

الشكل 2 أ، الإنسان السيد نظام (السمفونية، وسيمنز، ألمانيا)، وملف محلي الصنع لإثارة موجات اللاسلكية، وكشف وضعت في الماسح الضوئي، (ب)، المسطحة مجهزة الحجمي جهاز التصوير المقطعي المحوسب (CT الحجم، وسيمنز، ألمانيا)؛ C، الموجات فوق الصوتية السريرية نظام ACUSON Sequioa 512 (سيمنز، ACUSON، ماونتن فيو، كاليفورنيا).

الشكل 3. محوري أقسام MR. اليسار لوحة، T2w التصوير بالرنين المغناطيسي، لوحة المتوسطة، سعة ألف (DCE-MRI)؛ لوحة الحق، سعر الصرف ثابت ك EP (DCE-MRI). الأسهم تشير في الانبثاث العظام. الخريطة اللون لنطاقات البيانات DCE، التصوير بالرنين المغناطيسي من أحمر (القيم الأعلى) إلى الأزرق (القيم المنخفضة).
78/4178fig4.jpg "/>
الشكل 4. اعادة البناء VCT 3D من الانبثاث العظام عظمية (اللوحة اليسرى)، وتصوير الأوعية (وسط لوحة)، وكذلك قسما للDCE-VCT في اتجاه محوري من المعلمة تعزيز الذروة (لوحة على اليمين). الخريطة اللون لنطاقات البيانات DCE-VCT من أحمر (القيم الأعلى) إلى الأزرق (القيم المنخفضة).

الشكل 5. صور الولايات المتحدة من وضع-B (التشكل، لوحة على اليسار)، دوبلر (التروية، وسط لوحة)، وCEUS (لوحة الحق، وتعزيز الذروة بعد حقن من microbubbles من الوقت الحقيقي التصوير من الأوعية الدموية) لالانبثاث العظام.
فيلم تكميلية 1. اضغط هنا لمشاهدة فيلم إضافي .