Method Article

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

DOI:

10.3791/4208

⸱

October 1st, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Center for Inflammatory Bowel Diseases, Division of Digestive Diseases, David Geffen School of Medicine, The University of California Los Angeles, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

زرع نخاع العظام يوفر وسيلة لتغيير التركيب الوراثي للخلايا نخاع العظام المستمدة. إذا يعبر عن الجينات ذات الأهمية في كل من خلايا نخاع العظام والخلايا المشتقة نخاع العظم غير المشتقة، يمكن زرع نخاع العظام تغيير خلايا نخاع العظام المستمدة إلى التركيب الوراثي مختلفة دون تغيير التركيب الوراثي غير العظام نخاع الخلية مشتقة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لفهم دور الجينات في تطوير التهاب القولون، قارنا ردود البرية من نوع الفئران والجينات في المصالح الفئران خروج المغلوب لنقص التهاب القولون. إذا يعبر عن الجينات في المصالح في كل من خلايا نخاع العظام والخلايا المشتقة نخاع العظام المستمدة غير للمضيف، ولكن من الممكن التفريق بين دور الجينات في المصالح في خلايا نخاع العظام ونخاع المستمدة غير العظام مشتقة من خلايا نخاع العظام تقنية الزرع. لتغيير التركيب الوراثي نخاع العظام المستمدة من الفئران الخلية، تم تدمير النخاع العظمي الأصلي من الفئران المتلقية من قبل التشعيع وبعد ذلك استبدال نخاع العظام المانحة الجديدة من النمط الجيني مختلفة. عندما تم زرع العظام من النوع البري المانحة الفئران الفئران خروج المغلوب لنخاع، يمكن أن تولد الفئران خروج المغلوب مع التعبير الجيني من النوع البري في خلايا نخاع العظام المستمدة. بدلا من ذلك، تم زرعها عند الفئران خروج المغلوب المانحة نخاع العظم للفئران المستفيدة من النوع البري والبرية من نوع الفئران دون الجينات في المصالح معربا عنمن نخاع العظم تم إنتاج الخلايا المشتقة. ومع ذلك، قد زرع نخاع العظم لا يكون 100٪ كاملة. ولذلك، تستخدم مجموعة من الجزيئات نحن (CD) التمايز (CD45.1 وCD45.2) كعلامات من الخلايا المانحة والمتلقية لتتبع نسبة من الخلايا المانحة نخاع العظام في الفئران المستمدة المستفيدة ونجاح زرع نخاع العظام. واستخدمت البرية من نوع الفئران مع الفئران خروج المغلوب وراثى CD45.1 مع CD45.2 الوراثي. بعد التشعيع من الفئران المتلقية، وغرست في خلايا نخاع العظام من المانحين الأنماط الوراثية في الفئران المتلقية. وعندما نخاع العظام الجديدة المجددة للاستيلاء على حصانتها، تحدى الفئران عن طريق وكيل الكيميائية (ديكستران كبريتات الصوديوم، 5٪ DSS) للحث على التهاب القولون. نحن هنا كما أظهرت طريقة للحث على التهاب القولون في الفئران وتقييم دور الجينات في المصالح وأعرب عن خلايا نقي العظم المشتقة. إذا كان الجين في المصالح من خلايا العظام المستمدة تلعب دورا هاما في تطور هذا المرض (مثل القولونيةTIS)، يمكن النمط الظاهري من الفئران المتلقية مع زرع نخاع العظام غيرت بشكل كبير. في نهاية التجارب التهاب القولون، ونخاع العظام المستمدة وصفت الخلايا في الدم ونخاع العظام مع الأجسام المضادة ضد CD45.1 وCD45.2، ويمكن استخدامها على نسبة الكمية من وجودها لتقييم نجاح زرع نخاع العظام بواسطة التدفق الخلوي. يجب ناجحة زرع نخاع العظام تظهر الغالبية العظمى من النمط الجيني المانحة (في فترة من علامة جزيء CD) على النمط الجيني المستلم في كل من نخاع العظام والدم من الفئران المتلقية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. قبل بدء أنت بين الاعتبارات الفنية

  1. نوصي باستخدام كل C57/BL6 البرية من نوع الفئران والفئران خروج المغلوب للتجربة لأنه يمكن شراؤها الفئران مع جزيئات CD المقابلة من الباعة الماوس كبيرة.
  2. لأنه من الصعب تتبع الفئران البرية من نوع الفئران خروج المغلوب وتستمد الخلايا المانحة بعد زرع نخاع العظام، فمن الضروري استخدام CD45.1 الفئران لتمثيل البرية من نوع الفئران. (WT CD45.1 الفئران C57/SJL الأسهم المختبرات جاكسون # 002014).
  3. معظم المستعمرات الماوس هي ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب إذا كان الجين في المصالح تلعب دورا هاما في الخلايا المناعية خلال تطوير التهاب القولون، والفئران تلقي نخاع العظم من النمط الجيني المختلفة من خلال زرع نخاع العظم (WT إلى KO KO أو لWT) لديها تغيير في الاستجابة للالتهاب القولون DSS. واحدة من أهم المعايير لتحديد شدة التهاب القولون هو تلطيخ H & E من أنسجة القولون. يمكن القولون التغييرات بنية الأنسجة وعلامات التهاب تقييم كميا بواسطة H & E نظام التسجيل الأنسجة. يمكن للمعايير H & E الأنسجة نموذج التسجيل لالتهاب القولون وجدت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا زرع نخاع العظم نهج مناسبة للبحوث المناعة التهاب القولون، والعدوى، والسرطان، والسمنة وأمراض أخرى. هناك حاجة لذلك زرع نخاع العظم عند تجربة أعرب عن الجينات في المصالح في كل من نخاع العظم والخلايا المشتقة نخاع العظام المستمدة غير ويشتبه الجين في المصالح للتوسط المرض عن طريق الخلايا إما من السكان. على سبيل المثال، يظهر مضادات الميكروبات الببتيد cathelicidin التهاب القولون الحاد لتعديل. ولكن يتم التعبير عن ذلك في كل من الخلايا الظهارية وخلايا المناعة (مثل الضامة). ثم استخدمنا زرع ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الطيار والجدوى منحة دراسة من جامعة كاليفورنيا-CURE سنتر، والتهاب القولون كرون ومؤسسة جائزة الوظيفي أمريكا التنمية (# 2691) والمعهد الوطني للصحة NIDDK K01 (DK084256) لتمويل هون واي KOON.

وساعد عملية التشعيع نخاع العظام من ليفين وبرنار سكوت مطبخ مركز UCLA للبحوث الإيدز ماوس / مرفق الإنسان الأساسية الوهم. وساعد تدفق الخلوي بواسطة عملية منشأة UCLA الأساسية المتجهات.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

النائب Biomedicals

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم
خلية تلطيخ العازلة Biolegend # 420201
10X العازلة تحلل RBC Biolegend # 420301
FITC الماوس نمط إسوي السيطرة Biolegend # 400207
PE الماوس نمط إسوي السيطرة Biolegend # 400211
PE مكافحة الماوس CD45.2 Biolegend # 109807
FITC مكافحة الماوس CD45.1 Biolegend # 110705
مكافحة الماوس CD16/32 حظر Biolegend # 101301
40 ميكرومتر مصفاة الخلية Fisherbrand # 22363547
PBS 1X # 1860454
الهيبارين Fisherbrand # BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (فيشر)
اللايسول IC Andwin العلمية NC9745686 (فيشر)
Vaccutainer BD # 8000813
الماوس restrainer برينتري العلمية # TV-150
Irradiator JL الراعي والمنتسبين بمناسبة I 68A
تدفق عداد الكريات BD BD FACSCanto II
أنبوب تدفق عداد الكريات اختبار صقر # 352052
الفرجار الرقمية Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult تكنولوجيا المعلومات والاتصالات بيكمان كولتر G0328QW

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).
  2. Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameli....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow TransplantationFlow CytometryColitis InductionDextran SulfateCD45 1 CD45 2 MarkersWild Type MiceKnockout MiceBone Marrow IsolationHistology AnalysisCell Staining

Related Articles