وضعنا نهجا جديدا لإدارة جراحية داخل الرغامى وكلاء النشطة بيولوجيا في الجنين الماوس. الطريق التسليم أكثر كفاءة في استهداف الرئتين الماوس الجنين من الحقن داخل السلى مستخدمة بشكل شائع. هذا الإجراء له حتى الآن لم يتم وصفها في نموذج الفأر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وسيلة جديدة لإدارة الجراحية داخل الرغامى وكلاء الحيويه في نموذج الفأر الجنينية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن تسليم الرئوي قبل الولادة من الخلايا والجينات أو وكلاء الدوائية توفر الأساس لاستراتيجيات علاجية جديدة لمجموعة متنوعة من الأمراض الوراثية والمكتسبة. وتعتبر وبصرف النظر عن التشوهات الخلقية أو الموروثة لشرط على المدى الطويل التعبير عن الجينات المسلمة، عدة منظمات غير موروثة الظروف المحيطة بالولادة، حيث على المدى القصير التعبير الجيني أو التدخل الدوائي يكفي لتحقيق الآثار العلاجية، ومؤشرات محتملة في المستقبل لهذا النوع من النهج. يمكن أن الأمراض مرشح لتطبيق العلاج على المدى القصير قبل الولادة يكون نقص عابر حديثي الولادة من البروتين السطحي B يسبب متلازمة الضائقة التنفسية الوليدية 1،2 أو إصابات في الرئة مفرط التأكسج حديثي الولادة 3. الأمراض مرشح لتصحيح العلاجية دائمة هي التليف الكيسي (CF) 4، المتغيرات الجينية من أوجه القصور السطحي 5 و α1-انتيتريبسين نقص 6. <ف الطبقة = "jove_content"> وبشكل عام، ومن المزايا المهمة لالعلاج الجيني قبل الولادة هو القدرة على بدء التدخل العلاجي في وقت مبكر من التنمية، أو حتى في قبل المظاهر السريرية في المرضى، وبالتالي منع ضرر لا يمكن إصلاحه للفرد. وبالإضافة إلى ذلك، وأجهزة الجنين يكون لها معدل تكاثر الخلايا زيادة بالمقارنة مع أجهزة الكبار، والتي قد تسمح لأكثر كفاءة الجينات أو الخلايا الجذعية في نقل الجنين. وعلاوة على ذلك، في إيصال الجينات الرحم عندما يتم تنفيذ النظام المناعي للفرد ليست ناضجة تماما. ولذلك، ينبغي أن زرع الخلايا مغاير أو مكملات من البروتين غير وظيفية أو غير موجودة مع الإصدار الصحيح لا تسبب حساسية المناعي للخلية، أو منتج ناقلات التحوير الذي تم مؤخرا ثبت أن هذا هو الحال مع العلاجات الخلوية والجينية 7 .
في هذه الدراسة، ونحن التحقيق القدرة على استهداف مباشرة القصبة الهوائية الجنين في الماوس مodel. هذا الإجراء هو في استخدامها في النماذج الحيوانية أكبر مثل الأرانب والأغنام 8، وحتى في عملية إعداد سريرية 9، ولكن لديها حتى الآن لم يتم تنفيذها قبل في نموذج الفأر. عند دراسة إمكانيات العلاج الجيني للأمراض الوراثية الجنين مثل CF، الفأر نموذج مفيد جدا لأول إثبات صحة مفهوم بسبب توافر واسعة من مختلف السلالات المعدلة وراثيا الماوس، ومرحلة التطور الجنيني موثقة جيدا ونمو الجنين، أقل صرامة الأنظمة الأخلاقية، الحمل قصيرة وحجم القمامة الكبيرة.
وقد وصفت وسائل مختلفة لاستهداف الرئة القوارض الجنين، بما في ذلك داخل السلى حقن 10-12، (الموجات فوق الصوتية الموجهة) داخل الرئة الحقن في الوريد والإدارة 13،14 في الأوعية كيس المح أو الوريد السري 15،16 17. الإجراء الجراحي لدينا رواية تمكن الباحثون لحقن وكيل لاختيار مباشرة في القصبة الهوائية الماوس الجنين الذي يسمحلتسليم أكثر كفاءة للخطوط الجوية من التقنيات الموجودة 18.
البروتوكول
1. التزاوج للفئران الحصول المرغوب مرحلة الحمل
الوقت زميله حامل الفئران NMRI بحيث تكون 18 يوما (E18) حامل (الحمل إجمالي E19.5) في وقت الجراحة. قبل وبعد الجراحة يتم إيواؤهم في أقفاص الأعلى تصفية في درجة حرارة الغرفة العادية والنهار طبيعية مع حرية الوصول إلى المياه وتشاو.
2. الجنين داخل الرغامى (IT) حقن (الشكل 1)
- تقديم أول الماوس NMRI الحوامل إلى التخدير العام مع 1.5٪ isoflurane في خليط من O 2 عند 1.5 لتر / دقيقة. مستوى isoflurane يعتمد على عمر وسلالة من الفأرة، ولكن بشكل عام يجب أن يكون isoflurane عند مستوى يضع الحيوانات في ولاية مخدر. ثم وضع الماوس على الحوامل وسادة التدفئة (37 ° C) للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة.
- يتم تنفيذ الإجراء بأكمله من قبل اثنين من الجراحين الجراحية. واحد الجراح إجراء تشريح الماوس الحوامل والتعرض لاحقة من الالجنين ه للحقن داخل الرغامى. سوف الجراح إجراء الحقن 2 الجنين داخل الرغامى نفسها. يتم تنفيذ الإجراء الجراحي باستخدام أدوات معقمة وتقنية العقيم.
- تطهير البطن مع يوديد البوفيدون وإجراء فتح البطن للكشف عن متوسط الرحم الحامل. Exteriorize قرن واحد الرحم في وقت وحساب عدد الأكياس الحمل. ويتم تشغيل واحد على الجنين في القرن اختيار واستنادا إلى الموضع الأمثل لمن الاهتمام لأمور ظاهرية رأس الجنين في الخطوات اللاحقة. يتم تحديد أنسب الجنين بواسطة التصوير من خلال جدار الرحم. يجب أن الأنف من الرأس الجنين ما إزاء الجراح الذي سوف تضخ في القصبة الهوائية بعد تعريض رأس الجنين وتحديد ذلك إلى الوراء (كما هو موضح في الخطوة اللاحقة 2.5).
- تمر لأول مرة 6-0 البولي بروبلين سلسلة محفظة (البرولين) خياطة حوالي 1 سم في القطر من خلال جدار الرحم والأغشية الجنينية (MEMBRAN السلويه والجداري كيس الصفار) فوق منطقة سوف في وقت لاحق حيث على رأس الجنين يتعرض من خلال. هذا الدرز يحافظ على الجنين داخل الرحم ثابتة ابتداء من الكتفين. المقبل، وجعل شق في الرحم داخل محفظة سلسلة من حوالي 0.8 سم باستخدام مقص حاد.
- الضغط بلطف على الرأس والرقبة للجنين من خلال بضع الرحم. سحب الخيط بلطف سلسلة محفظة ضيق حول الرقبة واصلاحها في موقف مع ملقط البعوض الصغير 2. يتم الاحتفاظ رأس الجنين في تمدد مفرط من قبل خياطة polyglactin 5-0 (Vicryl) 910 على اثنين من ملقط وضعت في فم حول الفك العلوي.
- تحت المجهر تكبير مجسمة (X10 التكبير) القصبة الهوائية الجنين هو تصور من خلال جعل شق عمودي الرقبة باستخدام تشريح حادة وغير حادة. شق في منطقة الرقبة حوالي 5 مم. فمن شق سطحي، ويتم تشريح الأنسجة الكامنة زيادة استخدام تشريح حادة لتصل إلى القصبة الهوائية. تحت الرؤية المباشرة من خلال المجهر تكبير مجسمة، حقن حجم ما مجموعه 30 ميكرولتر من مادة (الخرز الفلورسنت مثل ناقلات فيروسية أو) في القصبة الهوائية باستخدام الزجاج بنسبة 50 ميكرولتر هاميلتون المحاقن مع إبرة 30 غ حادة. بعد إزالة الإبرة، هروب رأس المال الحد الأدنى من السائل حقن يضمن حقن الصحيح. لم يتم إغلاق الجرح بعد الحقن.
- ليحل محل رئيس في الرحم، وتطبيق ضغط لطيف على الأنف. ثم الرقبة يذهب أول مرة إلى داخل الرحم، عن طريق الرأس. الأنف في واد آخر. المقبل، أغلق بضع الرحم من خلال تشديد سلسلة محفظتك. ثم حقن ما مجموعه حوالي 0.5 مل من محلول فيزيولوجي في تجويف السلوي لمنع قلة السائل السلوي. للقيام بذلك، اضافة الى وجود إبرة في شق داخل سلسلة محفظتك. المقبل، أغلق خياطة حول إبرة، وبعد ذلك يتم حقن محلول ملحي. في الخطوة الأخيرة، سحب الإبرة، تليها إغلاق تماما عurse السلسلة.
- إغلاق جدار البطن الأمهات (الصفاق والداخلية والخارجية طبقة العضلات) والجلد مع خياطة Vicryl 5-0 على التوالي في طبقتين منفصلتين. بعد ذلك، شق التسلل مع الزيلوكائين 0.2٪ لتخفيف الألم بعد الجراحة. فمن المستحسن استخدام البوبرينورفين (0،05 حتي 0،1 ملغ / كغ أو SC IP) لتخفيف الألم بعد الجراحة. لا تستخدم المضادات الحيوية ولا tocolytics قائية. يتم الاحتفاظ الفئران على وسادة التدفئة (37 ° C) حتى يتم استرداد بشكل كامل (حوالي 1 ساعة).
3. الجنين داخل السلى (IA) حقن
- انظر 2.1
- تطهير البطن مع يوديد البوفيدون وإجراء فتح البطن للكشف عن متوسط الرحم الحامل. Exteriorize قرن واحد الرحم في وقت وحساب عدد الأكياس الحمل.
- لا يمكن أن يؤديها على جميع IA حقن الأجنة لأنه يأخذ وقتا أقل لتنفيذ. وعلاوة على ذلك، فإن موقف الجنين ليس critiكال مقارنة حقن داخل الرغامى. كما جدار الرحم هو شبه شفافة، وهياكل الجنين مثل الرأس والأطراف والذيل وموقف المشيمة مرئية بشكل جيد.
- باستخدام إبرة حقنة ونفس النحو الوارد أعلاه (2.7)، وضخ 30 ميكرولتر من المواد الموجودة في محيط الفم الجنين. ويمكن أن يتم هذا بسهولة أكثر إما بين رأس الجنين والأمامية، أو بين الأطراف السفلية وذيل. يتم تنفيذ سوى حقن بعد دراسة متأنية لموقف الإبرة لضمان عدم هياكل الجنين على اتصال مع طرف في وقت الحقن.
- وأعادت الرحم في البطن وجدار البطن والجلد مغلقة كما هو موضح أعلاه (2.9).
4. تقييم الأجنة المصبوبة و الصليب تعزيز-
- قتل السد باستخدام أسلوب القتل الرحيم وافق 36 ساعة بعد تدخل الجنين (في E19.5). خلع عنق الرحم دون إضافيةوالتخدير يكون أفضل طريقة، وجميع الأشكال الأخرى من القتل الرحيم التي تشمل التخدير (isoflurane على سبيل المثال، بنتوباربيتال) سوف تخدير أو حتى قتل الأجنة، والتي كنت ترغب في تجنب في جميع الأوقات. تسليم الأجنة تعمل على قيصرية. يتم تحديد الأجنة في الرحم تعمل من موقفهم. يتم ترقيم الأكياس الذي يحيط بالجنين ابتداء من نهاية المبيض الرحم ذو قرنين.
- بعد الولادة، يتم استخدام المعايير التالية لتقييم جدوى من الأجنة: وجود دقات قلب (1)، (2) لون البشرة الوردي (مقابل مزرقة) و (3) الحركات العفوية. وضع الجراء فقط الوفاء بهذه المعايير في القمامة أم فوستر تحتوي على الجراء ليوم واحد من العمر. حسب الخبرة ونحن نعلم أن الجراء مع ضربات القلب ضعيفة أو لون البشرة مزرقة و / أو الحركات العفوية الحد الأدنى من البقاء على قيد الحياة في كثير من الأحيان لا بسبب الرفض من القمامة الأم الحاضنة أو عن طريق أكل لحوم البشر الأمهات.
- بعد تسليم ساتحاد كرة القدم صبغة مرئية عبر IT أو IA الحقن (مثل جزيئات نيون أحمر)، فمن الممكن أن أؤكد حقنة الصحيح من خلال وجود هذه الصبغة (اللون الوردي من fluospheres الأحمر حقن) في الصدر (عن طريق الحقن المباشر في الرئتين بعد IT حقن، أو عن طريق الاستنشاق إلى الرئتين بعد الحقن IA) أو تجويف البطن (عن طريق الابتلاع). هذا ممكن يرجع ذلك إلى حقيقة أن الفئران حديثي الولادة هي شبه شفافة مما يسمح للفي تقييم المجراة في الرئتين والمعدة.
- بمناسبة الجراء حقن الحبر بشكل صحيح مع الصينية تحت الجلد فوق أساس الذيل. إخضاع جميع الجراء، والتى تلبى المتطلبات المذكورة في 4.2 في القمامة الأم فوستر.
- لضمان قبول القصوى والبقاء للالجراء تعمل على، لا تترك الجراء أكثر من 10 في المجموع في القمامة الأم فوستر (سواء بلدها الجراء يوم 1 القديمة، فضلا عن الجراء عبر تعزيز). قبل وضع الجرو تعمل علىق في القمامة الأم فوستر، تغطيتها في الفراش المواد من الأم الحاضنة، تحتوي على كل من البراز والبول لها لإخفاء أي روائح غير مألوفة.
- وضع القفص في بيئة هادئة وعدم الإزعاج القمامة لا يقل عن 12 ساعة (بين عشية وضحاها).
- في اليوم التالي، بعناية تقييم معدل البقاء على قيد الحياة عن طريق عد من تعزيز جميع الجراء، مما يجعل التمييز بين الجراء الأم الحاضنة والجراء تعمل على (بحبر الصينية في المتوسط وأصغر من الجراء الأخرى). تقليل الوقت التلاعب في هذه الجراء لتجنب الرفض من قبل الأم وتجنب انخفاض حرارة الجسم. بشكل عام، إذا لم يكن لديك الجراء أي الحليب في بطونهم (وهو أمر واضح نظرا لطبيعة شبه شفافة من الجراء الوليد)، والتكهن سيئة للغاية من أجل البقاء المزيد من هذه الحيوانات.
5. ممثل النتائج
وصفت الخطة الشاملة للتجربة في الارقام ..ه 2.
تحديد حجم الأمثل للحقن داخل الرغامى
لتحديد حجم الأمثل لتكنولوجيا المعلومات الحقن، واخترنا تجريبيا أحجام مختلفة تتراوح بين 10 و 20 إلى 30 ميكرولتر (ن = 3/volume). للكشف سهلة، اخترنا لحقن جزيئات نيون أحمر (fluospheres، مجسات الجزيئي، ليدن، هولندا) الحجم 100 نانومتر. بعد أن حقن الأجنة في E18 القديمة، كانت تحصد الرئتين 24 ساعة في وقت لاحق، ثابتة في بارافورمالدهيد 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية و 6 ميكرون وأدلى أقسام المجمدة. كانت ملطخة النوى وخيوط الأكتين مع هويشت 33258 (سيغما الدريخ، Bornem، بلجيكا) واليكسا فلور 488 phalloidin (إينفيتروجن، Merelbeke، بلجيكا) على التوالي لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وأدلى الصور مبائر باستخدام المجهر Biorad التألق 2100 متحد البؤر LaserSharp2000.6 مع البرنامج عن طريق كارل زايس. ومضان النسبي (نسبة إلى الأحمر fluospheres مضان زرقاء تمثل وstainin النوويةوكميا غرام على التوالي) باستخدام يماغيج البرمجيات عبر الإنترنت (الشكل 3). على الرغم من أن في وقت جراحة الجنين، تم الكشف عن ارتجاعي فقط بعد الحقن من 30 ميكرولتر، مشيرا إلى وجود فائض من السوائل حقن، وقدم 30 ميكرولتر أكبر قدر من إشارة الفلورسنت في لحمة الرئة وكميا عن طريق قياس مضان النسبي (تحليل التباين ، مقارنات لكل زوج باستخدام الطالب اختبار t، * P <0.05 ***، P <0.001).
تقييم الكمي في الأنسجة الرئوية fluospheres وbiodistribution إلى القناة الهضمية
المقبل، أردنا لمقارنة كفاءة الرئة استهداف الماوس الجنين بعد أن حقن مقابل IA. للقيام بذلك، تم تنفيذ 30 ميكرولتر من fluospheres مع رئة الجنين بعد الماوس إما حقن أو IA في الفئران E18 NMRI الحوامل (ن = 5 لكل مجموعة). أدى حقن IT في تسليم أعلى بكثير من fluospheres مع رئة الجنين مقارنة IA. الطريق (1.43 ± 0.56 و 0.05 ± 0.02 مضان النسبي (نسبة إلى fluospheres هويشت على التوالي، تحليل التباين، طالبة تي اختبار ***، P <0.001) (الشكلان 4 AC). استخدمت الأجنة مراقبة دون علاج لتطبيع الفلورسنت خلفية الإشارة. والقناة الهضمية كان إيجابيا لتكنولوجيا المعلومات على حد سواء والحيوانات IA حقن (الشكل 4 د). ولم يلاحظ أي مضان أحمر في الأنسجة الأخرى من المعاملة أو الأجنة في الحيوانات السيطرة السلبية (المعطيات غير معروضة).
مقارنة بين الحقن داخل الرغامى الذي يحيط بالجنين داخل و-rAAV2/6.2 بعد توصيل الجينات بوساطة في الرئة الجنين
بعد مقارنة كل من طرق التسليم عن طريق حقن جزيئات نيون، أردنا أن تقييم كفاءة تنبيغ الفيروسية والتعبير الجيني لاحقة بعد أن والحقن باستخدام ناقلات IA rAAV. rAAV2/6.2 ترميز يراعة luciferase (fLuc) (3x10 10 GC / الجنين)تحت سيطرة المروج (CBA) β-الدجاجة الأكتين تم حقن IT (ن = 8) أو IA (ن = 6) في الفئران NMRI الجنين في E18. وتلت بعد العملية القيصرية، وتعزيز، على قيد الحياة الجراء بنسبة التصوير تلألؤ بيولوجي غير الغازية (BLI) ورصد للنشاط fLuc (الفوتونات / ثانية، ع / ق) في 1 أسبوع من العمر (الشكل 5). وكان تدفق الفوتون الإجمالية للمجموعة IT أعلى بكثير من تلك التي في المجموعة IA والسيطرة السلبية (تحليل التباين، المقارنات لكل زوج باستخدام الطالب اختبار t، * P <0.05). كان متوسط إشارة BLI في المجموعة IA يست أعلى بكثير من السيطرة على المجموعة في السلبية.
التمييز بين الصحيح وغير صحيح حقن الجنين داخل الرغامى
التمييز بين الصحيح وincorrectI.T ملف. ويمكن تقييم الحقن على مستويات عدة. عند نقطة وقت الجراحة، خلال الحقن في القصبة الهوائية الجنين، وسوف يكون لاحظت أي مقاومة عندما needlيتم وضع البريد في القصبة الهوائية. ومع ذلك، سيتم لاحظت وجود ارتفاع المقاومة عند حقن في الفضاء رغامى. الثانية، في عملية قيصرية كما الجنين هو شبه شفافة، فمن الممكن أن نرى الرئتين وبالتالي وجود صبغة مرئية (الحبر الصيني على سبيل المثال، جزيئات الفلورسنت). وثمة خيار آخر لتقييم حقنة الصحيح هو عن طريق التصوير الضوئي وبشكل أكثر تحديدا التصوير تلألؤ بيولوجي. BLI هو نظام أنيقة لغير جراحية التعبير الجيني متابعة من وسيفيراز الجينات مراسل اليراع، لكنها محدودة القرار المكانية والمعلومات التشريحية. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) على ارتفاع القرار، والصور التي تحتوي على معلومات تشريحية تصوير الشعاعي الطبقي تفصيلا. التحقيق بالتالي فإننا مزيج من BLI مع التصوير بالرنين المغناطيسي للحصول على صورة التراكب، والذي يجمع بين الإشارة BLI السطح مع التصور من الهياكل التشريحية العميقة (الأعضاء الداخلية). كان هدفنا الحصول على معلومات أكثر تفصيلا في الجسم الحي من المحليةسعودة في التعبير الجيني لتكون قادرة على التمييز بين الصحيح من الخطأ الحقن IT.
تم الحصول عليها مجتمعة BL-MR الصور على العديد من الحيوانات حقنه مع rAAV2/6.2 CBA-CBA fLuc وLacZnls-(3x10 10 GC / الجنين لكل ناقل، ن = 10) في أسبوع واحد من العمر (الشكل 6). كشفت BL التصوير إشارة الصادرة من الرقبة ومنطقة الصدر. شارك في تسجيل MRI مع BLI التعبير الجيني الموجود في المنطقة وسيفيراز الرئوي بعد الحقن الصحيح (الشكل 6 أ)، ولكن في العنق ومنطقة البطن بعد حقنة غير صحيحة (الشكل 6 ب) وأكد التحليل النسيجي بواسطة X-غال وتلطيخ في الجسم الحي شارك في التسجيل.
البقاء على قيد الحياة بعد الحقن داخل الرغامى الذي يحيط بالجنين داخل و-
- Fluorospheres
حقن بقاء لتسليم E18 الأجنة NMRI القديمة IT أو IA مع 30 ميكرولتر الأحمر 100 نانومتر fluorescenكان جزيئات ر 100٪ في كلا المجموعتين، وكان يعرف بأنه عدد من الأجنة على قيد الحياة حقن في وقت الحصاد، بعد 24 ساعة الإجراء الجراحي الجنين (الجدول 1). - rAAV ناقلات
حقن بقاء لتسليم الأجنة IT أو IA مع rAAV2/6.2، الذي يعرف بأنه عدد من الأجنة على قيد الحياة في وقت ولادة قيصرية نقطة الحقن قسم آخر 36h الجنين، وكان 85.3٪ و٪ 86.3، على التوالي (الجدول 1). كان معدل البقاء في وقت مبكر حديثي الولادة 53.3٪ (IT) و 74.5٪ (IA)، على التوالي، وكان يتم حسابه عن طريق ربط عدد من الجراء على قيد الحياة بعد 1 يوم مع تعزيز عدد من الأجنة الأولية حقن. للحصول على هذه المعدلات النهائية بقاء، إلى أقصى حد أننا الجراحية بروتوكول الإجراء شبه المنطوق باستخدام (1) استنشاق isoflurane والتخدير بدلا من الإدارة من مزيج من الكيتامين (75 ملغ / كغ IP) وmedetomidine (1 ملغ / كغ IP) ، (2) وسادة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم أثناء الجراحة، (3)،المجهر تكبير مجسمة و (4) مشغلي الحصول على المزيد من الخبرة مع إجراء العمليات الجراحية.
الشكل 1. حقن الفئران داخل الرغامى في E18 الجنين. في هذا الرقم وصفت الخطوات الرئيسية لإجراء العمليات الجراحية لحقن IT الجنين. في الخطوة الأولى هي exteriorized 1 الرحم القرن. في الخطوة التالية، يتم تمرير الخيط من خلال سلسلة محفظة جدار الرحم والأغشية الجنينية (الغشاء الذي يحيط بالجنين والكيس المحي الجداري) على المنطقة التي في وقت لاحق على رأس الجنين سوف يتعرض من خلال. المقبل، وexteriorized الرأس والرقبة للجنين من خلال بضع الرحم، وبعد ذلك يتم الاحتفاظ رأس الجنين في تمدد مفرط من قبل خياطة 5-0 910 polyglactin على اثنين من بين فكي ملقط. تحت المجهر تكبير مجسمة (X10 التكبير) القصبة الهوائية الجنين هو تصور من خلال جعل incis العنق عموديأيون باستخدام تشريح حادة وغير حادة. في الخطوة الأخيرة، يتم حقن حجم ما مجموعه 30 ميكرولتر من مادة إلى القصبة الهوائية تحت الرؤية المباشرة من خلال المجهر تكبير مجسمة.
الشكل 2. لمحة عامة من التجربة.
الشكل 3. تحديد حجم الأمثل للحقن داخل الرغامى. لتحديد حجم الأمثل لتكنولوجيا المعلومات الحقن، 10، 20 أو 30 الحجم ميكرولتر (ن = 3/volume) من fluospheres الأحمر 100 نانومتر كانت تدار في الأجنة E18 القديمة وكانت تحصد الرئتين 24 ساعة في وقت لاحق. كانت ملطخة النوى وخيوط الأكتين مع هويشت 33258 واليكسا فلور 488 phalloidin على التوالي. ومضان النسبي (نسبة إلى مضان أحمر أزرق تمثل fluosphوكميا ERES وتلطيخ النووية على التوالي) باستخدام يماغيج البرمجيات عبر الإنترنت. يعني ± SD، تحليل التباين، المقارنات لكل زوج باستخدام الطالب اختبار t، * P <0.05 ***، P <0.001.
الشكل 4. التقييم الكمي للفي الأنسجة الرئوية fluospheres وbiodistribution إلى القناة الهضمية. تم تنفيذ 30 ميكرولتر من fluospheres الأحمر إلى الرئة الماوس الجنين بعد (أ) IT أو (ب) IA حقن الفئران في E18 NMRI الحوامل للمقارنة بين كفاءة الاستهداف الرئة الماوس الجنين. واستخدمت الأجنة مراقبة دون علاج لتطبيع إشارة الخلفية الفلورية. كانت ملطخة النوى وخيوط الأكتين مع هويشت 33258 واليكسا فلور phalloidin 488، على التوالي. (ج) مضان النسبي (نسبة إلى مضان أحمر أزرق تمثل fluospوكميا هيريس وتلطيخ النووية على التوالي) باستخدام يماغيج البرمجيات عبر الإنترنت. (د) القناة الهضمية كان إيجابيا لتكنولوجيا المعلومات على حد سواء والحيوانات IA حقن. يعني ± SD، تحليل التباين، طالبة تي اختبار ***، P <0.001. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 5. مقارنة بين الحقن داخل الرغامى الذي يحيط بالجنين داخل و-rAAV2/6.2 بعد توصيل الجينات بوساطة في الرئة الجنين. BLI إشارة في 1 الاسبوع بعد حقن rAAV2/6.2 (3 × 10 10 GC / الجنين CBA-fLuc) مع الكمي المقابلة من إجمالي تدفق الفوتون . تم فحص كافة الحيوانات، مفصولة أقسام الأسود، لتفادي تشتت الفوتونات على الحيوانات المجاورة. مقياس تدفق pseudocolor يصور فوتون في الثانية، لكل سنتيمتر مربع في ستيراديان (ع / ق / سم 2 / ريال سعودي). تم الحصول على قياسات في منطقة مستطيلة 4.3 2 سم من الفائدة. يعني ± SD، تحليل التباين، المقارنات لكل زوج باستخدام الطالب اختبار t، * P <0.05. الرقم مقتبس من كارلون وآخرون، 2010. طبع بإذن من ماكميلان للنشر المحدودة: [العلاج الجزيئي] (دوى: 10.1038/mt.2010.153)، حقوق الطبع والنشر (2010). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 6. التمييز بين الصحيح وغير صحيح حقن الجنين داخل الرغامى بعد rAAV2/6.2 توصيل الجينات بوساطة في الرئة الجنين. جنبا إلى جنب تم الحصول عليها BL-MR الصور على العديد من الحيوانات حقنه مع rAAV2/6.2 CBA-fLuc وCBA-LacZnls (3x10 10 GC / الجنين لكل vectoص) في أسبوع واحد من العمر. كشفت BL التصوير إشارة الصادرة من الرقبة ومنطقة الصدر. شارك في تسجيل MRI مع BLI التعبير الجيني الموجود في المنطقة وسيفيراز الرئوي بعد الحقن الصحيحة (أ)، ولكن في العنق ومنطقة البطن بعد حقنة غير صحيحة (ب) وأكد التحليل النسيجي في الجسم الحي وشارك في التسجيل. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. الشكل مقتبس من كارلون وآخرون، 2010. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
| حقن مادة | طريقة الحقن | البقاء على قيد الحياة لتسليم أحد | معدل البقاء على قيد الحياة لتعزيز ب | في وقت مبكر معدل البقاء على قيد الحياة حديثي الولادة ج |
| fluospheres | IT | 100 (8/8) | NA | NA |
| IA | 100 (5/5) | NA | NA | |
| rAAV2/6.2 | IT | 85،3 (64/75) | 62،5 | 53،3 (40/75) |
| IA | 86،3 (44/51) | 86،4 | 74،5 (38/51) |
الجدول 1. البقاء على قيد الحياة بعد حقن الجنين داخل الرغامى الذي يحيط بالجنين داخل و. البقاء على قيد الحياة لأي التسليم بعد جراحة الجنين والولادة القيصرية في، قبل تعزيزها وتقويتها. وعززت فقط الجراء ب لو كانوا الوردي، والانتقال والتنفس بشكل طبيعي. ج في وقت مبكر معدل البقاء على قيد الحياة ويعبر عن الأطفال حديثي الولادة بوصفها وظيفة من عدد من الجراء الأولي حقن. الاختصارات: IT الحقن داخل الرغامى، IA داخل السلى الحقن؛ NA لا ينطبق.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الحاسمة
- سلالة الماوس اخترنا العمل مع الفئران هو NMRI لأن لديهم فرة عدد من الجراء (متوسط حجم القمامة 14،4 ± 1.8، البيانات الخاصة)، تحمل التدخلات بشكل جيد ولها خصائص جيدة الأمهات.
- وضع سلسلة محفظة من خلال جدار الرحم والأغشية الجنينية خطوة حاسمة كما تريد فقط لفضح رأس الجنين وليس الكتفين، وإلا اعادة تموضع يكاد يكون من المستحيل دون أن تسبب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وMC AVdP هي الزملاء الدكتوراه بدعم من المنح المقدمة من معهد لتعزيز الابتكار من خلال العلوم والتكنولوجيا في فلاندرز (IWT فلاندر). JT حاصل على زمالة بدوام جزئي البحوث السريرية (كور) من لوفين UZ. DV هو زميل الدكتوراه بدعم من منحة مقدمة من لوفين KU، DBOF/10/062. MMdC هو زميل الدكتوراه بدعم من منحة مقدمة من دي ناسيونال Conselho Desenvolvimento ه Pesquisa (CNPq) وإيراسموس موندوس. وقد تم تمويل البحث من قبل IWT فلاندر، من قبل DIMI منحة EC (LSHB-CT-2005-512146) والتي في الجسم الحي الجزيئي مجموعة بحوث التصوير (IMIR) من لوفين KU. نود أن نعترف الأساسية المتجهات UPenn التي أسسها جيمس ويلسون M. هدية نوعها للعبوة AAV6.2 البلازميد لإنتاج النواقل rAAV.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | كتالوج رقم | التعليقات (اختياري) |
| الفئران NMRI | جانفييه، لو Genest سانت جزيرة، فرنسا | ||
| Isoflurane | Isoba، إنترفيت / شيرينغ بلاو صحة الحيوان، ميلتون كينز، المملكة المتحدة | ||
| البرولين 6-0 | Ethicon، غروت Bijgaarden، بلجيكا | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon، غروت Bijgaarden، بلجيكا | ||
| 50 ميكرولتر الحقنة الزجاج هاملتون، النموذج 1710،5 TLLX SYR | هاملتون، رينو، NV، الولايات المتحدة الأمريكية | 5495-20 | |
| إبرة 30G حادة | هاملتون، رينو، NV، الولايات المتحدة الأمريكية | 7762-03 | |
| 2٪ الزيلوكائين | استرا زينيكا، زويتيرمير، هولندا |
المراجع
- Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
- Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
- Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
- Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
- Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
- Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
- Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
- Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
- Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
- Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
- Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
- Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
- Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
- Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
- Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
- Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
- Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
- Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
