إإكسبلنتس زراعة العصبية من تشريح القيطم المورق الأجنة التي تعبر عن البروتينات الفلورية الانصهار يسمح للتصوير من مخروط النمو ديناميات هيكل الخلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
والدافع إلى حد كبير عملية معقدة من التوجيه من قبل محور عصبي مخروط النمو، والذي هو بنية ديناميكية متحركة في الطرف الجنوبي من محور عصبي المتنامية. خلال ثمرة محور عصبي، يجب على مخروط النمو تكامل مصادر متعددة من المعلومات جديلة التوجيه لتعديل الهيكل الخلوي في لدفع النمو قدما المخروط والتنقل للعثور بدقة أهدافها محددة 1. كيف يحدث هذا التكامل على المستوى هيكل الخلية والناشئة لا تزال، وفحص البروتين وديناميات هيكل الخلية المستجيب داخل مخروط النمو يمكن أن تسمح لتوضيح هذه الآليات. الأقماع القيطم المورق النمو كبيرة بما فيه الكفاية (10-30 ميكرون في القطر) لأداء عالية الدقة التصوير الحي للديناميات هيكل الخلية (على سبيل المثال 2-4) وسهلة لعزل والتلاعب في إعداد مختبر مقارنة الفقاريات الأخرى. الضفدع هو نظام النموذج التقليدي للدراسات التنموية بيولوجيا الأعصاب، والأفكار الهامة في وقت مبكر هيئة التصنيع العسكري مخروط النموتم العثور في البداية ديناميات rotubule باستخدام هذا النظام 5-7. في هذه الطريقة 8، يتم جمع البيض والمخصبة في المختبر، مع حقن الترميز RNA الموسومة fluorescently هيكل الخلية البروتينات الانصهار أو بنيات أخرى للتلاعب التعبير الجيني، ثم تترك لتطوير لمرحلة الأنبوب العصبي. يتم عزل الأنابيب العصبية عن طريق تشريح ومثقف ثم يتم، ويتم تصوير مخاريط النمو على neurites التي تعدى. في هذه المقالة، ونحن تصف كيفية تنفيذ هذه الطريقة، والهدف منها هو القيطم المورق الثقافة مخاريط النمو اللاحقة لتحليل الصور عالية الدقة. بينما نحن نقدم مثال TIP + البروتين GFP-EB1 الانصهار، يمكن تطبيق هذه الطريقة إلى أي عدد من البروتينات لتوضيح تصرفاتهم داخل مخروط النمو.
البروتوكول
ملاحظة: نحن تصف الخطوات في القسمين الأول فقط في سطور، كما تم نشر البروتوكولات ممتازة مع معلومات مفصلة في مكان آخر أن التركيز بشكل خاص على الخطوات التالية (على سبيل المثال 8-12). بالإضافة إلى ذلك، تم بروتوكول عام من العمل مع الخلايا العصبية في العمود الفقري في القيطم زراعة الخلايا الحية التي تم نشرها مسبقا في مقالة مفصلة أساليب 8. ونحن نوصي بشدة مراجعة تلك المادة على أنه مكمل لهذا الفيديو، على الرغم من أننا هنا تقديم معلومات كافية لتنفيذ بنجاح وإصلاحها تشريح الأنبوب العصبي وبروتوكول الطلاء في الخطوة 3.
1. الإخصاب في الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
القيطم المورق إإكسبلنتس العصبية ترسل neurites التي بطريقة قوية للغاية من 24 ساعة بعد الطلاء على laminin / بولي يسين الركيزة إذا كانت الظروف مناسبة. مع هذا الركيزة، والأقماع هي النمو متحركة للغاية ويمكن تحقيق أطوال تصل إلى محوار 1 ملم، وتمتد في كل الاتجاهات من الخارج يزدرع، على الرغم من أطوال النموذجية هي 100 ميكرون أو أكثر. إذا neurites التي لا تنمو خارج، وهناك عدد محدود من الأسباب لهذا أن يكون عليه الحال. أحد الاحتمالات هو أن العصبية إإكسبلنتس لم تلتزم بشكل صحيح إلى الطب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر بوب فريمان للتدريب ومختبر كيرشنر لاستخدام المرفق الضفدع، وأعضاء المختبر Vactor فان حصول على الدعم. نشكر مركز التصوير نيكون في كلية هارفارد الطبية للحصول على المساعدة مع المجهر الضوئي للصور في الشكل 1. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال ما يلي: NRSA NIH الزمالة والزمالة NIH K99 إلى LAL، العلوم الأساسية الشراكة تمويل ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) لAEF، والمعاهد الوطنية للصحة لRO1 NS035909 DVV
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف | شركة | كتالوج رقم | |
| موجهة الغدد التناسلية المشيمائية | آرجنت الكيميائية المختبرات | C-HCG-ON-10 | |
| السيستين | سيغما الدريخ | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine عدة | Ambion | AM1340 | |
| إبر الشعرية Borosil 1.2 مم (OD) × 0.9 مم (ID) | FHC | 30-31-0 | |
| Ficoll | سيجما | F2637 | |
| دومون # 5 البيولوجيا صدأ ملقط | أدوات العلوم الجميلة | 11252-20 | |
| كولاجيناز | سيغما الدريخ | 9001-12-1 | |
| أطباق ماتيك | شركة تيك حصيرة | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | إينفيتروجن | 21083-027 | |
| بولي-L-lysiشمال شرق | سيجما | P-1399 | |
| Laminin | سيجما | L2020 | |
| NT3 | سيجما | N1905 | |
| BDNF | سيجما | B3795 |
المراجع
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosc....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
