Method Article

أداة تحليلية يحدد مقدار التغييرات الخلوية الصرف من التقاط صور ثلاثية الأبعاد الإسفار

DOI:

10.3791/4233

⸱

August 31st, 2012

 ,  , 
1Medications Development, Ernest Gallo Clinic and Research Center, University of California, San Francisco , 2Clinical Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of California, San Francisco , 3Translational Research Institute and the Institute for Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, Brisbane, Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وضعنا منصة البرمجيات التي تستخدم Imaris العلوم العصبية، وImarisXT MATLAB لقياس التغيرات في مورفولوجية شكل غير معروف مأخوذ من ثلاثي الأبعاد من الخلايا مبائر مضان واحد. ويمكن استخدام هذا النهج الجديد لقياس التغييرات في شكل الخلية بعد تفعيل مستقبلات وبالتالي يمثل أداة ممكنة إضافية لاكتشاف المخدرات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدوات تحليل البرامج الأكثر شيوعا المتاحة لقياس الصور الفلورية هي البيانات ثنائية الأبعاد (2D) التي تعتمد على الإعدادات اليدوية لتضمين واستبعاد نقاط البيانات ، والتعرف على الأنماط بمساعدة الكمبيوتر لدعم تفسير ونتائج التحليل. لقد أصبح من المهم بشكل متزايد أن تكون قادرا على قياس الصور الفلورية التي تم إنشاؤها من مجموعات بيانات ثلاثية الأبعاد (3D) من أجل التمكن من التقاط تعقيد الديناميكيات الخلوية وفهم أساس اللدونة الخلوية داخل الأنظمة البيولوجية. سمحت أدوات الفحص المجهري المتطورة بتصور صور مضان ثلاثية الأبعاد من خلال الحصول على صور مضان متعددة الأطياف وبرامج تحليلية قوية تعيد بناء الصور من الأكوام متحدة البؤر التي توفر بعد ذلك تمثيلا ثلاثي الأبعاد للصور ثنائية الأبعاد التي تم جمعها. تقدمت طرق التقسيم المتقدمة القائمة على التصميم من تقريب وافتراضات علم التعقيم الأصلي القائم على النموذج1 حتى في أقسام الأنسجة المعقدة2. على الرغم من هذه التطورات العلمية في الفحص المجهري ، لا تزال هناك حاجة إلى طريقة تحليلية آلية تستغل بشكل كامل البيانات ثلاثية الأبعاد الجوهرية للسماح بتحليل وقياس التغيرات المعقدة في مورفولوجيا الخلية وتوطين البروتين والاتجار بالمستقبلات.

تشمل التقنيات الحالية المتاحة لتحديد الصور الفلورية Meta-Morph (الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale ، CA) والصورة J (المعاهد الوطنية للصحة) التي توفر تحليلا يدويا. يوفر برنامج Imaris (Andor Technology, بلفاست, أيرلندا الشمالية) ميزة MeasurementPro ، والتي تسمح بالإنشاء اليدوي لنقاط القياس التي يمكن وضعها في صورة الحجم أو رسمها على سلسلة من الشرائح ثنائية الأبعاد لإنشاء كائن ثلاثي الأبعاد. هذه الطريقة مفيدة لقياسات نقطة النقرة الواحدة لقياس مسافة الخط بين كائنين أو لإنشاء مضلع يحيط بمنطقة ذات اهتمام ، ولكن من الصعب تطبيقها على هياكل الشبكة الخلوية المعقدة. يسمح Filament Tracer (Andor) بالكشف التلقائي عن خيوط الخلايا العصبية ثلاثية الأبعاد الشبيهة ب ، ومع ذلك ، فقد تم تطوير هذه الوحدة لقياس الهياكل المحددة مثل الخلايا العصبية ، والتي تتكون من التشعبات والمحاور والأشواك (هيكل يشبه الأشجار). تم استخدام هذه الوحدة ببراعة لإجراء قياسات مورفولوجية للخلايا غير العصبية3 ، ومع ذلك ، توفر بيانات الإخراج معلومات عن شبكة خلوية ممتدة باستخدام برنامج يعتمد على شكل خلية محدد بدلا من أن يكون نموذجا خلويا غير متبلور. للتغلب على مشكلة تحليل الخلايا غير المتبلورة وجعل البرنامج أكثر ملاءمة للتطبيق البيولوجي ، طورت Imaris Cell Imaris. كان هذا مشروعا علميا مع Eidgenössische Technische Hochschule ، والذي تم تطويره لحساب العلاقة بين الخلايا والعضيات. بينما يتيح البرنامج اكتشاف القيود البيولوجية ، عن طريق إجبار نواة واحدة لكل خلية واستخدام أغشية الخلايا لتقسيم الخلايا ، لا يمكن استخدامه لتحليل بيانات التألق غير المستمرة لأنه من الناحية المثالية يبني سطح الخلية بدون مساحات فارغة. على حد علمنا ، في الوقت الحالي ، لم يتم تطوير أي نهج آلي قابل للتعديل من قبل المستخدم يوفر معلومات مورفومترية من صور مضان ثلاثية الأبعاد تحقق المعلومات المكانية الخلوية ذات الشكل غير المحدد (الشكل 1).

لقد قمنا بتطوير منصة تحليلية باستخدام وحدة البرامج الأساسية Imaris و Imaris XT المتصل ب MATLAB (Mat Works، Inc.). تسمح هذه الأدوات بالقياس ثلاثي الأبعاد للخلايا بدون شكل محدد مسبقا وبمكونات شبكة مضان غير متسقة. علاوة على ذلك ، ستسمح هذه الطريقة للباحثين الذين لديهم خبرة موسعة في الأنظمة البيولوجية ، ولكن ليس لديهم معرفة بتطبيقات الكمبيوتر ، بإجراء القياس الكمي للتغيرات المورفولوجية في ديناميكيات الخلية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحليل ثلاثي الأبعاد من المظهرية وحيدة الخلية التغييرات المظهرية

  1. وتقاس الكلى الجنينية البشرية (HEK293) مع خلايا هيماغلوتينين (HA)-الموسومة كورتيكوتروبين الإفراج عن عامل مستقبلات-2 (CRF-R2)، وهو بروتين G-يقترن مستقبلات (GPCR) كما هو موضح سابقا 4، 5.
  2. تركت دون علاج الخلايا (أي علاج، NT)، مع حفز يجند الذاتية CRF-R2، كورتيكوتروبين عامل الإفراج، CRF (1 ميكرومتر، 30 دقيقة)، أو سابقة التجهيز مع خصم CRF-R2 انتقائية، ومكافحة sauvagine 30 (AS -30، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) قبل العلاج ناهض.
  3. تم إصلاحها ثم الخلايا، وتعامل مع permeabilized HA للسامية. كان CRF-R2 تصور باستخدام اليكسا 594 نانومتر المتقارن المضادة للماوس (مفتش 1) الأجسام المضادة. وقد استخدم دابي لتصور المرحلة التفتلي نوى.
  4. للحد من الذاتية مجرب، لم تكن معروفة في الظروف التجريبية حتى بعد تم الحصول عليها من الصور وتحليلها.
  5. حصلنا على صورةS من الخلايا HEK293 الثابتة باستخدام خطة لامزيغ-63x/1.4 الهدف DIC النفط وزايس LSM المجهر متحد البؤر META 510 متصلة مترابطة متكاملة نظام ليزر ثنائي الفوتون تتكون من الليزر فيردي-V5 و900-F ميرا نظام ليزر.
  6. أثناء عملية الحصول على البيانات، ومجزأة الخلايا كل من باجتزاء متعددة الأطياف، NM 488، و 790 نانومتر (نانومتر ~ تحويلة 350 2ph.) وZ-تقسيم (0.5 ميكرومتر الزيادات) لتشمل البيانات من الغشاء النووي لمستقبلات للخارج الخلية الخارجي الأطراف.
  7. تمت معالجة البيانات أولا باستخدام مضان Imaris، والذي يسمح التصور وتجزئة بيانات المجهر 3D، وتم إنشاء نموذج 3D تتألف من voxels مكعب للتحليل المظهرية.
    ثم، تم استخدام وحدة لImaris XT Imaris التفاعل مع الكمبيوتر MATLAB لغة البرنامج لتحديد إحداثيات المكان ملحقات GPCR.
    على أن تأخذ في الاعتبار التباين الخلوية، وحصلنا على تحليل الصور مضان تاكEN من 22 الخلايا: يوجد علاج (NT) (ن = 7)، ناهض (CRF) العلاج (ن = 8) وقبل العلاج مع خصم (AS-30) قبل العلاج ناهض (ن = 7) (الشكل 2) .
    1. يجب المنطقة الاهتمام (ROI) تشمل خلية واحدة غير موجود في المرحلة التفتلي بالموقع وليس على مقربة من الخلايا الأخرى. بهذه الطريقة، سوف تشمل تحليل الخلايا لا مع نواة واحدة فقط وملحقات مستقبلات مضطرب من جراء قربها من الخلايا الأخرى.
    2. أعيد بناؤها أولا هيكل 3D من البيانات الخلوية متعددة الأطياف باستخدام مضان Imaris (v.7.1.1).
    3. بعد الخوارزمية التي صممها Imaris، واستخدم لأول مرة لتمثيل تقديم السطحية الغشاء النووي. سوف Imaris تحديد إذا كان هناك أكثر من واحد في النواة ROI.
    4. ثم تم استخدام خوارزمية البقع-إنشاء ملحق لتحديد موقع CRF-R2. واستخدم البقع لأنه كشف يعوض عن الضوضاء الخلفية وكثافة غير النظامية للشبكة معقدة غير متبلور على شكل الخلايا.
    5. لتحقيق أقصى قدر من إدراج كل وحدة من كشف مضان من CRF-R2، أنشئت قطر للبقع 'إلى 0.2 ميكرون، وهو أصغر وحدة في الصورة لاستقراء المعلومات متميزة في شكل كثافة يقاس باستخدام فلتر التمويه. تأسست تصفية بقعة في إنشاء المواقع عملية آلية. البرنامج، ومع ذلك، يعطي المستخدم المرونة اللازمة لاستخدام الفلاتر لتحديد المعلمات.
    6. لتجنب اقتطاع البيانات، تم تحويل مجموعة من البيانات 8 بت (غير موقعة) نقطة ثابتة، إلى 32 بت عشرية.
    7. وتبادل البيانات فوكسل شدة على الفور باستخدام إحداثيات البيانات Imaris XT حدة تفاعل مع MATLAB والمكان المحدد المكاني للكل بقعة تم تحديد عن طريق إجراء التحول المسافة باستخدام الغشاء النووي كنقطة مرجعية (الشكل 3).
  8. يمكن كميا البيانات الناتجة وعرضها في شكل رسوم بيانية لياليtatistical التحليل. وأجريت مقارنات بين المجموعات باستخدام اتجاهين ANOVA والبعدي Bonferroni. يتم عرض البيانات كما يعني ± SD. وتعتبر فروق ذات دلالة إحصائية في * 0،05 وأدلى حسابات مع بريزم GraphPad 5.02 (الشكل 4).

2. ممثل النتائج

للتدليل على قوة نهجنا، ونحن كميا التغيرات الخلوية التي تنتج عن التفاعل بين مستقبلات البروتين يقترن G (GPCRs) والموجهة القشرية عامل الإفراج عن مستقبلات-2 (CRF-R2) مع يجند لها CRF الذاتية في الخلايا HEK293 بالنقل.

نعرض التي تقع CRF-R2 المستقبلات في الغشاء البلازمي والمشروع من مناطق محدودة من غشاء الخلايا (الشكل 2A والفيلم 1). باستخدام التحليل التقليدي 2D، فمن الممكن الكشف عن هذه المجموعة الفرعية من مستقبلات CRF-R2 خارج الخلية إلا إذا حللنا مستقبلات الالتصاق بورجات على زجاج يغطي. وبالتالي نفقد أي معلومات أخرى مستمدة من البيانات Z-مكدسة متعددة الأطياف (الشكل 5).

عندما يتم التعامل مع الخلايا CRF، وتقلص إلى حد كبير المستقبلات خارج الخلية، ويتضح ذلك من انخفاض في المسافة من البقع من غشاء البلازما. وإعادة توزيعها أيضا أنها من مواقع محدودة في المقام الأول إلى عدد من المواقع المتميزة (2B الشكل والفيلم 2).

يتم منع تأثير على توزيع CRF الغشاء مستقبلات من المعالجة المسبقة مع خصم CRF-R2 محددة، antisavagine 30 (AS-30) ونجد أن ملحقات CRF-R2 لا تتغير (الشكل 2C والفيلم 3).

توزيع البعيدة من البقع، وتآمر في فترات 5 ميكرومتر لون الطيف مشفرة، ويستخدم لتصور المسافة بين voxels من الغشاء النووي. ويوجد علاج مضاد pretreatmالأنف والحنجرة (AS-30، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) قبل بدء العلاج ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) لا تظهر أي مهمة (م) الفرق في الانكماش GPCR. علاج الخلايا مع ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) يقلل تدريجيا من عدد CRF-R2 المحتوية على voxels بالمقارنة مع أي علاج، 0-5 ميكرومتر (م)، 6-15 ميكرون (** p < 0.01) و> 15 ميكرون (*** p <0.005)، أو مقارنة AS-30 معاملة، 0-10 ميكرون (NS)، 11-15 ميكرومتر (** p <0.01) و> 15 ميكرون (*** p <0.005) (الشكل 4).

figure-protocol-1
الشكل 1. الرسم البياني من التقنيات المتاحة حاليا والحد من أجل تحليل الصور مضان. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

figure-protocol-2
1)، وكان يستخدم لتصور دابي نوى. تم الحصول على الصور مبائر المجهر مع الليزر (CLS) المسح. مقياس بار 5 ميكرون.

figure-protocol-3
الشكل 3. إعادة بناء نموذج 3D من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع HEK293 HA-CRF-CLS R2 من الصور باستخدام برامج Imaris. تقديم سطح نواة وخلق بؤر تصف ملحقات GPCR تحويلها إلى حويصلات صغيرة. تمت معالجة البيانات أولا باستخدام مضان Imaris الذي يسمح للتجزئة والتصور 3D المجهر من مجموعة البيانات. ثم، تم استخدام Imaris XT لImaris التفاعل مع MATLAB. تم تبادل شدة فوكسل فيبقعة الإحداثيات. البقع الطيف ترميز الألوان (الأزرق 0-5 ميكرون، الأخضر، 6-10 ميكرون، ميكرومتر 11-15 الأصفر والأحمر> ميكرون 15) تمثل النموذج المسافة الغشاء النووي. مقياس تقييم من 5 ميكرون.

figure-protocol-4
ويستخدم الشكل 4. تمثيل بياني لتوزيع البعيدة من البقع المرسومة في لون الطيف مشفرة في 5 ميكرومتر فترات لتصور المسافة بين voxels من الغشاء النووي. يوجد علاج والمعالجة المسبقة مع خصم (AS-30، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) قبل بدء العلاج ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) لا تظهر أي مهمة (م) الفرق في الانكماش GPCR. علاج الخلايا مع ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) يقلل تدريجيا المسافة بين عدد من CRF-R2 المحتوية على voxels بالمقارنة مع أي علاج 0-5 ميكرون (NS)، 6-15 ميكرون (ع ** <0.01) و> 15 ميكرون (*** p <0.005)، أو AS-30 ميكرومتر العلاج 0-10 (م)، 11-15 ميكرومتر (** p <0.01) و> 15 ميكرون (*** P <0.005).

figure-protocol-5
الشكل 5. الحد من تحليل المظهرية 2D من الخلايا transfected مع HEK 293 HA-CRF-R2. تصور المقطع منتصف الطائرة من الخلايا (3-4μm فوق ساترة الزجاج) تظهر وسط النوى مع دابي وHA-R2-CRF بحثها استخدام الألغام المضادة للHA وتصور باستخدام اليكسا 488nm مترافق المضادة للماوس (مفتش 1) الثانوية والأجسام المضادة المكتسبة مع CLS لا يظهر أي فرق بين عدم المعالجة (A) (NT) و (B) ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة)، في حين أن نقطة التصاق مستقبلات مختلفة بشكل كبير.

الفيلم 1. الدورية بحرية نموذج 3D في وضع "فق" من HEK 293 الخلايا transfected مع CRF-HA-R2، أي علاج، لتقييم الاختلافات بين النمط الظاهري الخلوية البروتينات المستقبلة. مقياس بار 5 حتي 20 ميكرون./ files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.

فيلم 2. الدورية بحرية نموذج 3D في وضع "فق" من HEK 293 الخلايا transfected مع HA-CRF-R2، والعلاج ناهض، CRF (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) لتقييم الاختلافات بين النمط الظاهري الخلوية البروتينات المستقبلة. شريط نطاق 5 حتي 20 ميكرون. انقر هنا لمشاهدة الفيلم.

الفيلم 3. بحرية 3D الدورية في وضع "فق" من HEK 293 الخلايا transfected مع CRF-HA-R2، المعالجة مع خصم (AS-30، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) قبل بدء العلاج ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة ) لتقييم الاختلافات بين النمط الظاهري الخلوية البروتينات المستقبلة. شريط نطاق 5 حتي 20 ميكرون. انقر هنا لمشاهدة الفيلم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثبتنا أن يسببها العلاج CRF تغييرا كبيرا في التشكل وموقع CRF-R2. وقد تحول دون التغيير في CRF-R2 عن طريق العلاج خصم انتقائية. أثبتنا أن التعديلات لم يتم اكتشاف مستقبلات ويمكن أن لا تقاس باستخدام معيار تقنيات متعددة الأطياف 2D. القدرة على دراسة الصور 3D المعقدة أمر بالغ الأهمية لإدراج تعقيد العوامل البيولوجية لتحليل المظهرية. كنا قادرين على إجراء قياسات 3D من الخلايا دون شكل محدد مسبقا مع مكونات شبكة الاتصال غير متناسقة مضان. نا جناح أساليب الآلي المستخدم للتعديل يمكننا من قياس دينا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مركز التنمية التصوير البيولوجي (BIDC) جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو لاستخدام Imaris، XT Imaris ومطلب. نشكر V. Kharazia للمساعدة التقنية وAT هنري، LK Floren، L. Daitch لمساهماتها في التحرير من المخطوطة. وأيد هذا العمل من خلال تمويل من الدولة للأبحاث الطبية في كاليفورنيا الإسراف في تناول الكحول والمخدرات من خلال UCSF لSEB، والمعاهد الوطنية للصحة: ​​1R21DA029966 NIH-01 وجائزة المسار السريع لفحص جمع MLSMR لUCSF SEB مدرسة، الصيدلة ( مكتب العميد والصيدلة الإكلينيكية) وكلية الطب (علم الأدوية السريري والعلاج التجريبي) لCLHK.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
الجنينية البشرية الكلى (HEK293) كوكتيل الأمريكية نوع الثقافة CRL-1573
Dulbecco في معدلة النسر متوسطة (DMEM) إينفيتروجن 11965118
الجنين المصل البقري (FBS) إينفيتروجن SH30070.03
AlexaFluor-488 (IgG2b) إينفيتروجن A-11001
وحيدة النسيلة المضادة للHA.11 (مفتش 1) كوفانس 16B12
دابي ناقلات المختبرات H-1200 ؛
CRF سيجما C2917
Antisauvagine-30 (AS-30) سيجما A4727

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  2. Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262(2009).
  3. Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
  4. Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
  5. Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
  6. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
  7. Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
  8. Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
  9. Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
  10. Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
  11. Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Fluorescence ImagingCellular Morphology AnalysisConfocal MicroscopyImaris SoftwareMATLAB IntegrationGPCR Receptor TrackingAutomated Morphometric QuantificationReceptor Trafficking AnalysisDrug Discovery AssayFluorescence Image Segmentation

Related Articles