مقالة منهجية

مقايسة لتقييم سلوك يزدرع الخلوية من اللحمة المتوسطة القحف

DOI:

10.3791/4245

⸱

يناير 20, 2013

 , 
1Center for Neuroscience Research, Children's Research Institute, Children's National Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويخضع اللحمة المتوسطة الجمجمة الحركات المثيرة التي توفر morphogenic المرجح قوة دافعة للارتفاع طيات العصبية 1،2. نحن هنا وصف بسيط خارج الجسم يزدرع مقايسة لتوصيف سلوكيات الخلوية من خلال اللحمة المتوسطة الجمجمة تكون العصيبة. هذا الاختبار لديها العديد من التطبيقات بما في ذلك كونها قابلة للتلاعب الدوائية والتحليلات التصوير الحية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويستمد الجهاز العصبي المركزي من لوحة العصبية التي تمر سلسلة من الحركات المعقدة تخلقية مما أدى إلى تشكيل الأنبوب العصبي في عملية تعرف باسم تكون العصيبة. تكون العصيبة أثناء، ويعتقد التشكل من اللحمة المتوسطة والذي أدى إلى لوحة العصبية لدفع أضعاف الارتفاع العصبية. وتتألف الجمجمة من اللحمة المتوسطة الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور والخلايا العصبية قمة. خلايا اللحمة المتوسطة شكل الجمجمة وشبكه pourous يتألف من خلايا النجمية الشكل والاختلاط خارج الخلية المصفوفة (ECM) التي تدعم مسارات طيات العصبية. تكون العصيبة خلال واللحمة المتوسطة الجمجمة يخضع النمطية مما أدى إلى إعادة ترتيب توسعها ويعتقد هذه الحركات لتوفير قوة دافعة للارتفاع أضعاف العصبية. ومع ذلك، لا تزال سيئة درس المسارات الخلوية والسلوكيات التي تدفع الجمجمة التشكل اللحمة المتوسطة. التفاعلات بين ECM وخلايا اللحمة المتوسطة تسا الجمجمة underlyالسلوكيات ه الخلية. نحن هنا وصف فيفو السابقين بسيطة مقايسة يزدرع وضعت لوصف سلوك هذه الخلايا. هذا الاختبار هو قابلة للتعديل لتلاعب الدوائية لتشريح إشارات الممرات المشتركة والتحليلات التصوير الحي لوصف سلوك مزيد من هذه الخلايا. نقدم تجربة ممثل مما يدل على فائدة هذا الاختبار في تشخيص خصائص المهاجرة من اللحمة المتوسطة الجمجمة على مجموعة متنوعة من المكونات ECM.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إغلاق أنبوب العصبي في المنطقة الجمجمة يحدث بين 8.5 يوم الجنينية (E8.5) و 9.5 في جنين فأر. فشل لإغلاق الأنبوب العصبي بشكل صحيح في نتائج الرئيسي في انعدام الدماغ، وهو عيب خلقي شائع في البشر والهيكلية غير متوافق مع الحياة. يتم إنشاء القوات التي تدفع رأسي إغلاق الأنبوب العصبي من الأنسجة العصبية نفسها على حد سواء والبشرة المحيطة بها واللحمة المتوسطة 3. في التوسع معينة من اللحمة المتوسطة الجمجمة يعتقد أنه ضروري لرفعة لل1،2 أضعاف العصبية الجمجمة. واللحمة المتوسطة الجمجمة غنية في البروتينات البروتينات في الغليكوزيلاتي ECM معينة مثل كبريتات الهيبارين بروتيوغليكان، الكبريتات شوندروتن و 4-8 هيالورونات.

خلافا لما حدث في جنين الدجاج حيث الخلايا العصبية قمة الهجرة من الأنبوب العصبي الظهري بعد إغلاق الأنبوب العصبي، وقمة العصبية في جنين فأر يهاجر في نفس الوقت أن نبدأ في طيات العصبية صISE (بعد مرحلة الجسيدة 5). وبالتالي تكون العصيبة خلال الماوس في الجنين، ويتكون من الجمجمة اللحمة المتوسطة الخلايا المشتقة من قمة العصبية الأديم المتوسط ​​ومجاور للمحور. هي التي يسببها قمة العصبية الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور والسكان في أوقات مختلفة في التنمية؛ المترجمة في مواقع مختلفة في الجنين وتطوير في الهياكل المختلفة 9،10. والأديم المتوسط ​​مجاور للمحور تنبع من خط البدائية ويهاجر إلى المنطقة الأمامية من الجنين لوحة تكمن وراء المفترض العصبية. هو فعل قمة العصبية عند تقاطع العصبية لوحة الأديم الظاهر والبشرة، ليخضع لالظهارية اللحمة المتوسطة والانتقال delaminates قبيل الارتفاع أضعاف العصبية في الأجنة القوارض. الخلايا العصبية قمة على طول مسارات الهجرة النمطية في الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور تحت الأديم الظاهر إلى قوس خيشومي، الجبهية الأنفية واللحمة المتوسطة المحيط بالعين. الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور فإن المساهمة في بعض من عظام الجمجمة قبو والعضلات في الوجه، أما الوه العرف العصبي تسهم في عظام الجمجمة أخرى من وجهه بالإضافة إلى الأعصاب القحفية 9-11. ويمكن للالأديم المتوسط ​​مجاور للمحور والأنساب قمة العصبية تتميز بشكل مختلف من قبل لجنة المساواة العرقية، وMesp1 Wnt1-خطوط الماوس المعدلة وراثيا لجنة المساواة العرقية، على التوالي 9.

وقد يستدل على الدور الأساسي للاللحمة المتوسطة الجمجمة في إغلاق الأنبوب العصبي من حيث التجارب علاج الأجنة القوارض مع ECM تعطيل عوامل مثل هيالورونيداز، chondroitinase ABC، heparitinase أو ديازو OXO نورلوسين-(DON) خلال ضعاف تكون العصيبة إغلاق الأنبوب العصبي 7، 12-14. في هذه التجارب، وكشف التحليل النسيجي للأقسام ثابتة بعد dysmorphogeneis تكون العصيبة المرتبطة من اللحمة المتوسطة الجمجمة 7،12-14. ومع ذلك، منذ كان وكيل ماسخة الوصول إلى الأنسجة المتعدد، فإنه لا يزال يتعين تحديد إذا كان هو حقا اللحمة المتوسطة الجمجمة والأنسجة المستهدفة. لدعم الاستنتاج بأن هذا النسيجأمر ضروري لتكون العصيبة، ويبدو غير طبيعي في الجمجمة اللحمة المتوسطة على التحليلات النسيجية في بعض المسوخ الماوس مع اختراج الدماغ 15-17. ومع ذلك، في معظم الحالات، لم يتم تأثير الطفرة على سلوك الخلوية من اللحمة المتوسطة الجمجمة معالجتها.

وقد وضعت لدينا يزدرع فيفو السابقين لدراسة مقايسة مباشرة نتيجة لطفرة جينية أو التلاعب الدوائية على سلوك الخلايا اللحمة المتوسطة الجمجمة 15. هذا الاختبار هي مماثلة لتلك التي نشرتها Tzahor وآخرون 2003 للوصول إلى إمكانية التفريق من اللحمة المتوسطة الجمجمة الذي يكمن وراء rhombomeres 18 سنة ما عدا لدينا تعديل تشريح يزدرع لدراسة خصائص السكان المهاجرة من أكثر من اللحمة المتوسطة الجمجمة الأمامية التي تكمن وراء العصبية الأمامي لوحة. أسلوبنا هو أيضا تعديل المقايسات يزدرع أجريت في الجنين الدجاج لتحليل السلوك المهاجرة من قمة العصبية مع كهالخلافات ذ. وقد explanted الاستعدادات السابقة للقمة العصبية أو الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور الخلفي أكثر 19،20. وعلاوة على ذلك، خلال الارتفاع أضعاف العصبية في الجنين الدجاج، قمة العصبية لم هاجر بعد من أنبوب من العصبية الظهرية، وبالتالي اتخذت من إإكسبلنتس الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور الأمامي ولن تحتوي على خلايا العصبية قمة. في مقايسة لدينا، يتم إعداد إإكسبلنتس اللحمة المتوسطة الجمجمة التي تتكون من الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور، والأديم الظاهر العصبي قمة السطحية ومطلي على ركيزة. لا يمكن أن يؤديها التلاعب التجريبية بما في ذلك عزل إإكسبلنتس من المسوخ الجينية، تصفيح إإكسبلنتس على ECM مختلفة أو العلاجات الدوائية. ويمكن تحليل الخلايا تهاجر من يزدرع والمسافة، عدد والسلوك ومقارنة بين مجموعات العلاج. وبالإضافة إلى ذلك، هذا هو إعداد قابلة للتعديل لتحليل الهجرة الخلوية بواسطة تقنيات التصوير الحية. بعد التجربة الهجرة، يمكن أن تكون ثابتة إإكسبلنتس وتعرض لتحليل المناعى إلى الفراءTHER توضيح تأثير العلاجات. وعلى العموم، وبروتوكول المعروضة هنا هي فيفو السابقين بسيطة الفحص للتحقيق في سلوك اللحمة المتوسطة الجمجمة. كتجربة ممثل، ونحن الاستفادة من هذه مقايسة لدراسة الهجرة من اللحمة المتوسطة الجمجمة على ركائز مختلفة خارج الخلية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد أطباق ECM الثقافة المغلفة أو Coverslips

  1. إعداد محلول المخزون ECM عن طريق إذابة الركيزة ECM في PBS (Dulbecco في الفوسفات مخزنة المالحة، إينفيتروجن، # 14040-133). تصفية باستخدام حقنة 0.2 ملم فلتر (VWR، # 28145-495) وتجميد مأخوذة في -80 ° C.
  2. تمييع الحل ECM الأسهم في PBS إلى التركيز المطلوب. لMaxGel، في تمييع DMEM (لDulbecco معدلة النسر متوسطة، إينفيتروجن، # 11995-065).
  3. إذا كان سيتم إجراء المناعي، تعقيم 12 مم coverslips الزجاج الدائرية (VWR، # 89015-724) عن طريق غمس في الإيثانول والسماح للهواء الجاف. وينبغي أن يتم ذلك في غطاء محرك السيارة الصفحي العقيمة. إذا لن يتم تنفيذ المناعي انتقل إلى الخطوة 1.5.
  4. المكان تعقيم coverslips في كل بئر من لوحة بئر 24 (كورنينج، # 3526).
  5. إضافة 0.5 مل من محلول مخفف إلى الركيزة كل بئر من 24 لوحة جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعة.
  6. نضح قبالة حل ECM ويغسل ثلاث،ه مرات في برنامج تلفزيوني.
  7. نضح قبالة PBS واستخدامها على الفور أو ملفوفة في parafilm وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.

2. إعداد أدوات تشريح

يتم إعداد لوحات Sylgard مع الفحم المضافة لكل بروتوكول صناعة لل. الخلفية السوداء للمقاومة هذه اللوحات تقدم الدعم لأسفل تعلق الجنين ولون جيد يقدم النقيض مما يسهل تصور الجنين شفافة.

  1. لإعداد لوحات تزن مباشرة إلى كأس ثلاثي صب على الجزء التوازن A 150 غ ز السائل الجزء 15 B، و 1 غرام مسحوق الفحم (أدوات دقيقة العالمي، # SYLG184). مزيج معا باستخدام عصا خشبية أو المصاصة اللسان خافضة. تصب في الزجاج أو البلاستيك الأطباق 100 سم. استخدام البوتان الشعلة الصغيرة التي عقدت حوالي 10 إلى 12 بوصة فوق أطباق لحرق أي فقاعات. أغطية مكان على لوحات والسماح للجلوس لا يقل عن 24 ساعة لتعيين.
  2. لإعداد أدوات تشريح إدراج دبوس Minutien (0.1 مم diameteويمكن استخدام R) إلى حامل دبوس (الأدوات العلمية الجميلة، # # 26018-17 26002-10 و، على التوالي) بدلا من الإبر قياس 26 (BD، # 309597) عازمة بزاوية قائمة مع المعونة من ملقط تشريح والصكوك. شحذ طالب دومون # 5 ملقط (أدوات العلوم الجميلة، # 91150-20) باستخدام الحجر شحذ (الأدوات العلمية الجميلة، # 29008-22).
  3. تعقيم جميع الأدوات تشريح مع الايثانول 70٪ قبل الاستخدام.

3. جمع الأجنة

  1. الموت ببطء الماوس توقيت الحوامل عند 8.5 coitum آخر أيام وفقا للوائح لجنة استخدام الحيوان وإزالة الرحم.
  2. الرحم مكان في صحن بتري بلاستيكية مع PBS العقيمة.
  3. غسل الرحم مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
  4. تحت المجهر تشريح الجنين إزالة بعناية من deciduas باستخدام زوج من ملقط.
  5. إزالة الأغشية خارج الجنين وانقاذ لالتنميط الجيني إذا لزم الأمر.
  6. الجنين عن طريق عد somites المرحلة. المراحل المثالية لجعل إإكسبلنتس لتحليل الخلوية بيهوavior خلال الارتفاع أضعاف العصبية أن يكون بين المراحل 6 و 10 الجسيدة عندما طيات العصبية هي مجرد بداية لرفع وقبل التشكل الرئيسية للاللحمة المتوسطة الجمجمة تأخذ مكان.
  7. غسل الجنين في برنامج تلفزيوني. المكان في لوحة سوداء مع sylgard DMEM التي لا تحتوي على الفينول الحمراء (إينفيتروجن، # 21063-029). إزالة الأغشية خارج الجنين وانقاذ لالتنميط الجيني إذا لزم الأمر.

4. إعداد إإكسبلنتس

  1. إعادة تركيز المجهر على التكبير أعلى مستوى ممكن على المنطقة رئيس الجنين.
  2. إجراء تخفيضات بإبرة تشريح في كل يد. استخدم أحد إبرة لعقد الأنسجة في مكان والآخر لجعل التخفيضات.
  3. قطع رأس الجنين سابقة لrhombomeres.
  4. قطع على طول خط الوسط لرئيس شطر إلى نصفين متساويين.
  5. قطع حول هامش الخارجي من الرأس وخط الوسط. وهذه التخفيضات إزالة قمة premigratory والأديم الظاهر السطحي على الحدود الخارجي ولوحة أمام القردود في خط الوسط. فإن الأنسجة المتبقية تكون يزدرع وسوف تحتوي على ترحيل قمة العصبية الجمجمة، الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور والأديم الظاهر السطحي.
  6. كما يتم قطع الأنسجة، وإزالة الحطام من تشريح الطبق باستخدام معقم باستور ماصة. هذا يمنع الخلط بين يزدرع مع الحطام تشريح.
  7. يغسل بلطف بواسطة يزدرع pipeting صعودا وهبوطا مع طرف ماصة ميكرولتر 20 وpipetman. سيؤدي هذا إلى إزالة الخلايا المرفقة فضفاضة ومنع حواف خشنة على إإكسبلنتس.
  8. اختيار بعناية كل يزدرع في حوالي 10 ميكرولتر من السائل باستخدام ماصة 20 ميكرولتر نصيحة وpipetman ومكان في مركز للثقافة المغلفة جيدا.
  9. إضافة 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام تستكمل مع FBS الثقافة 15٪ لتغطية يزدرع.
  10. لوحة مكان في حاضنة مرطب زراعة الأنسجة (5٪ CO 2، 37 ° C) لمدة 1-2 ساعة للسماح لليزدرع لنعلق على الجزء السفلي من الطبق. عرض بشكل دوري للتأكد من أن لا تجف يزدرعمن.
  11. عندما تولى يزدرع، إضافة إلى كل بعناية DMEM 250 ميكرولتر جيدا تستكمل مع FBS 10٪ التي تم تحسنت إلى 37 ° C في بالحمام المائي. بمجرد أن تعلق إإكسبلنتس أنها لن تتحرك عندما تهتز برفق لوحة تحت المجهر.
  12. العودة إلى صحن زراعة الأنسجة حاضنة.
  13. بعد 24 ساعة، سيتم إإكسبلنتس ترتبط بقوة والخلايا تبدأ في الهجرة. يمكن في هذا الوقت أن تضاف كلاء الدوائية الى وسائل الاعلام.
  14. 48 ساعة بعد الطلاء، وسوف هاجروا من الخلايا إإكسبلنتس. يمكن للمسافة هاجر يمكن تصور والمصورة. نتوقف عادة الثقافة في هذه المرحلة منذ إإكسبلنتس تبدأ تظهر علامات بقاء أطول مع انخفاض حضانات. A ويمكن أيضا وصمة عار الحيوية مثل البرتقال أو الأزرق التريبان أكريدين أن تستخدم للتحقق من صلاحية يزدرع.
  15. يمكن في هذه المرحلة الحصول عليها الصور لتوثيق المسافة وعدد الخلايا التي تهاجر من يزدرع. بدلا من ذلك، إذا كانت مطلية إإكسبلنتس على coverslips،يمكن ان تكون ثابتة والتحليلات التي أجريت لتصور المناعى البروتينات المثيرة للاهتمام.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول

  1. قطع إإكسبلنتس من حجم تقريبا.
  2. مسح كافة الحطام قبالة لوحة تشريح تشريح كما كنت تشريح لتجنب الخلط بين الحطام الأنسجة explanted المطلوب.
  3. عندما إإكسبلنتس الطلاء في الآبار أو على coverslips تأكد من وضع قطرة من وسائل الاعلام مع يزدرع في مركز جيد.
  4. تسمح يزدرع الوقت الكافي لإرفاق قبل اغراق بشكل جيد مع وسائل الإعلام.
  5. يجب أن تكون موحدة ظروف العلاج لكل الركيزة الاختبار وكيل الدوائية المستخدمة.
  6. ويمكن إجراء اثنين من كل إإكسبلنتس الجنين (واحد من اليسار وواحد من حق الأنبوب العصبي).
  7. وضع عند اختبار هجرة الخلايا من خطوط الماوس متحولة تحت ظروف تجريبية مختلفة، واحدة يزدرع متحولة في السيطرة على المجموعة والآخر في المجموعة التي تلقت العلاج.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

  1. إذا إإكسبلنتس لا نعلق، وزيادة الوقت المخصص للمرفق. في تجربتنا، ما يقرب من نصف إإكسبلنتس لا نعلق وأكبر إإكسبلنتس تلتزم بشكل أكثر كفاءة.
  2. إذا إإكسبلنتس نعلق على هامش جيدا سوف يكون من الصعب الصورة. تأكد من وضع إإكسبلنتس في وسط البئر.
  3. من الناحية المثالية سوف يكون إإكسبلنتس نفس الحجم تقريبا. ومع ذلك، يمكن تصحيح التفاوت في حجم يزدرع لاستخدام القطر من إإكسبلنتس كعامل التصحيح عندما quanitating الهجرات من الخلايا من إإكسبلنتس.
  4. إذا تلوث يحدث تأكد تستخدم معقمة ظروف العمل. يجب تعقيم جميع الأدوات وأسطح العمل مع الايثانول 70٪. يجب Pipets وأطباق بتري تكون جديدة ومعقمة.
  5. إذا إإكسبلنتس يتم الحصول على فقدت خلال تشريح، وإزالة الحطام بشكل دوري لمنع فقدان يزدرع.
  6. اتقان تشريح تستغرق وقتا طويلا، ويأخذ الممارسة. OPTIالمال التكبير، وأدوات تشريح حادة ومساعدة الإبر.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر مظهر خلايا اللحمة المتوسطة المهاجرة من إإكسبلنتس الجمجمة في الشكل 2. نحن اختبار الهجرة على ركائز ECM المختلفة التي موجودة في الجمجمة خلال اللحمة المتوسطة تكون العصيبة بما في ذلك [فيبرونكتين] (100 ملغ / مل؛ سيغما # F1141)، Laminin (100 ملغ / مل؛ سيغما # L2020)، ECM MaxGel (1:500 التخفيف في DMEM ؛ سيغما # E0282) وحمض الهيالورونيك (1 ملغ / مل؛ سيغما، # 53747). الخلايا تفشل في ترحيل من يزدرع عندما لا ECM موجود (البيانات لا تظهر) وجميع ركائز اختبار معتمد من الهجرة الخلايا. كل من الشكل وكذلك أحجام الخلايا التي تهاجر من إإكسبلنتس يعتمد على الركيزة. هذا ومن المتوقع والدراسات السابقة تثبت أن القوات الميكانيكية التي تولدها الخلايا التفاعل مع ECM مختلفة تؤثر على كل شكل وخصائص الخلايا المهاجرة 21.

figure-results-1
الشكل 1. إعداد إإكسبلنتس. (A) إعداد إإكسبلنتس، وتشريح E8.5 من الأجنة والأنسجة deciduas خارج الجنين. (B) يتم تشريح الجنين من رؤساء الأمامي الجسم إلى rhombomeres. يتم إعداد إإكسبلنتس عن طريق إزالة الأنسجة من خط الوسط والحواف الخارجية للرئيس لإزالة لوحة أمام القردود في خط الوسط وقمة العصبية وpremigratory الأديم الظاهر السطحي على الحدود، على التوالي. (C) تعد إإكسبلنتس عن طريق خفض بعيدا نسيج من خط الوسط والحواف الخارجية للرئيس لإزالة لوحة أمام القردود في خط الوسط وقمة العصبية وpremigratory الأديم الظاهر السطحي على الحدود. (D) يتم وضعها في مجلد وإإكسبلنتس صغيرة من وسائل الاعلام على أطباق ECM المغلفة / coverslips وسمح لإرفاق قبل إضافة المزيد من وسائل الإعلام.

figure-results-2
الشكل 2. كانت مطلية هجرة الخلايا من اللحمة المتوسطة الجمجمة إإكسبلنتس مطلي على ركائز مختلفة. إإكسبلنتس على [فيبرونكتين]، Laminin، ECM MaxGel أو حمض الهيالورونيك وتصويرها بعد 48 ساعة في الثقافة. شريط حجم = 200 مم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة تطبيقها هنا يوفر الفحص قوية لدراسة سلوك خلايا اللحمة المتوسطة الجمجمة. ويمكن استخدام بالإضافة إلى تحليلات ثابت المعروضة هنا، ويعيش التجارب في مجال التصوير مشرق أو بالاشتراك مع التعبير عن البروتينات التي تحمل علامات GFP لدراسة السلوكيات من الخلايا في الوقت الحقيقي كما تهاجر من يزدرع. للتجارب التصوير الحي، يمكن أن توصف إإكسبلنتس مع مبادرة ديزرتك الصناعية أو للتمييز هجرة قمة العصبية الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور من، ROSA-YFP؛ يمكن أن تستخدم لجنة المساواة العرقية Wnt1 أو خطوط المعدلة وراثيا الأخرى؛ Mesp1-ROSA لجنة المساواة العرقية أو YFP. ويمكن أيضا الجمجمة اللحمة المتوسطة، ECM التفاعلات أن تدرس الاستفادة من هذا الاختبار يزدرع. نحن هنا لوحة إإكسبلنتس على ركائز ECM المختلفة التي موجودة في الجمجمة اللحمة المتوسطة لإظهار أن الخلايا تهاجر على هذه بدرجات مختلفة وأن يؤثر على ECM مورفولوجيا الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ إإكسبلنتس في مصفوفة ثلاثية الأبعاد للوصول إلى سلوكيات سلفي هذا السياق ليرة سورية. هذا الاختبار هو يزدرع قابلة للتعديل لتحليل أثر التلاعب الجيني والدوائي على السلوكيات اللحمة المتوسطة الجمجمة لتحليل الاشارات الجوهرية وخارجي يمكن أن تنظم الهجرة وتعديل. على سبيل المثال، تستخدم في هذا الاختبار نحن دراساتنا أن نستشف دور Hsp90 إفراز فائض في السلوكيات الشاذة الخلوية في اللحمة المتوسطة Hectd1 الجمجمة متحولة 15. في هذه التجارب، وتعامل مع أننا إإكسبلنتس مكافحة Hsp90 الأجسام المضادة، Hsp90 البروتين، وgeldanamycin DMA (amelioride ثنائي ميثيل) لمنع إفراز Hsp90 لإثبات أن سلوك غير طبيعي للخلايا متحولة Hectd1 ومن المقرر أن تتجاوز 15 Hsp90 خارج الخلية. ويمكن استخدام نهج مماثل لتشريح عقاقيري مسارات إضافية الكامنة التشكل طبيعية أو غير طبيعية من اللحمة المتوسطة الجمجمة. بعد الانتهاء من الفحص، يمكن تحليل والخلايا المهاجرة إإكسبلنتس من قبل مجموعة من الأساليب. على سبيل المثال، C التحليلات المناعىأن تستخدم لدراسة وتوطين البروتينات بالغة بالنسبة للتحركات الخلية. ويمكن أيضا أن تستخدم تحليلات Transcriptome لتحديد كيفية العلاج تؤثر التعبير الجيني.

واحد الحد كبير من هذه التقنية هو أنه لا السلوكيات نموذج في أبعاد ثلاثة لأنها يمكن أن تحدث في الجسم الحي. ويمكن استخدام التعديل من حيث هي جزء لا يتجزأ بروتوكول إإكسبلنتس في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (مثل matrigel) جنبا إلى جنب مع التعبير حجرات البروتين بعلامات الفلورسنت الخلوية اللازمة لمعالجة هذه المسألة. حتى لو أجريت هذه التعديلات، وتجارب أخرى لربط السلوكيات ينظر في هذا الاختبار فيفو السابقين مع تلك الموجودة في الجسم الحي يكون ضروريا. وتشمل القيود الأخرى على عدد كبير من الأجنة اللازمة لتوليد عدد كاف لتوليد بيانات هامة بشكل ثابت. الأهم من ذلك، تشريح بسيط نسبيا، فإنه لا تتطلب الممارسة لاتقان.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم هذا العمل من قبل HD058629-R01 لIEZ

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Copp, A. J. Neurulation in the cranial region--normal and abnormal. Journal of anatomy. 207, 623-635 (2005).
  2. Fleming, A., Gerrelli, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Mechanisms of normal and abnormal neurulation: evidence from embryo culture studies. The International Journal of Developmental Biology. 41, 199-212 (1997).
  3. Copp, A. J., Greene, N. D., Murdoch, J. N. The genetic basis of mammalian neurulation. Nat. Rev. Genet. 4, 784-793 (2003).
  4. Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. The distribution of fibronectin, laminin and entactin in the neurulating rat embryo studied by indirect immunofluorescence. J. Embryol. Exp. Morphol. 94, 95-112 (1986).
  5. Tuckett, F., Morriss-Kay, G. Alcian blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. The Histochemical Journal. 20, 174-182 (1988).
  6. Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. II. Patterns of hyaluronate synthesis and distribution in embryos developing in vitro. The American Journal of Anatomy. 188, 133-147 (1990).
  7. Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. I. Patterns of mesenchymal cell distribution and proliferation in embryos developing in vitro. The American Journal of Anatomy. 188, 121-132 (1990).
  8. Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. Changes in mesenchymal cell and hyaluronate distribution correlate with in vivo elevation of the mouse mesencephalic neural folds. Anat. Rec. 226, 383-395 (1990).
  9. Yoshida, T., Vivatbutsiri, P., Morriss-Kay, G., Saga, Y., Iseki, S. Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme. Mech. Dev. 125, 797-808 (2008).
  10. Noden, D. M., Trainor, P. A. Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations. Journal of anatomy. 207, 575-601 (2005).
  11. Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Dev. Biol. 241, 106-116 (2002).
  12. Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F., Solursh, M. The effects of Streptomyces hyaluronidase on tissue organization and cell cycle time in rat embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 98, 59-70 (1986).
  13. Morriss-Kay, G., Tuckett, F. Immunohistochemical localisation of chondroitin sulphate proteoglycans and the effects of chondroitinase ABC in 9- to 11-day rat embryos. Development. , 106-787 (1989).
  14. Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. Heparitinase treatment of rat embryos during cranial neurulation. Anat. Embryol. (Berl). 180, 393-400 (1989).
  15. Sarkar, A. A., Zohn, I. E. Hectd1 regulates intracellular localization and secretion of Hsp90 to control cellular behavior of the cranial mesenchyme. The Journal of Cell Biology. 196, 789-800 (2012).
  16. Zohn, I. E., Anderson, K. V., Niswander, L. The Hectd1 ubiquitin ligase is required for development of the head mesenchyme and neural tube closure. Dev. Biol. 306, 208-221 (2007).
  17. Chen, Z. F., Behringer, R. R. Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis. Genes Dev. 9, 686-699 (1995).
  18. Tzahor, E., et al. Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle. Genes Dev. 17, 3087-3099 (2003).
  19. Lumsden, A. G. Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ. Development. 103, 155-169 (1988).
  20. Newgreen, D. Spreading of explants of embryonic chick mesenchymes and epithelia on fibronectin and laminin. Cell and tissue Research. 236, 265-277 (1984).
  21. Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochemistry and Biophysics. 47, 300-320 (2007).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة