Chemoselective تعديل السطوح الفيروسية عن طريق الكيمياء نقرة Bioorthogonal

ملخص

صممت جزيئات الفيروس الغدي لاحتواء إما غير طبيعي التماثلية الأحماض الأمينية azidohomoalanine أو السكر azido O-GlcNAz. وligated chemoselectively المجموعة أزيد من كل ردود الفعل عن طريق "فوق" كيمياء كوسيلة لتعديل سطح الفيروسية.

الملخص

وقد تلقت لتعديل جزيئات الفيروس قدرا كبيرا من الاهتمام لإمكانياتها الهائلة في التأثير على العلاج الجيني، والتطبيقات oncolytic وتطوير لقاح. ^1،2،3 النهج الحالية لتعديل أسطح الفيروسية، والتي هي في معظمها على أساس علم الوراثة، وغالبا ما تعاني من التوهين تنبيغ. ^4،5 الإنتاج الفيروس، والعدوى والخلوية عن طريق chemoselective الكيمياء نقرة، قمنا بتطوير نهج بديل مباشر التي الالتفاف حول هذه القضايا على حد سواء في حين تبقى مرنة للغاية ويمكن الوصول إليها. ^1،2

الهدف من هذا البروتوكول هو للتدليل على فعالية استخدام bioorthogonal كيمياء فوق لتعديل سطح من نوع اتش 5 الجسيمات. ويمكن استخدام هذه عملية من خطوتين سواء على المستوى العلاجي ¹ أو تحليلي، ^2،6 لأنها تسمح لربط chemoselective من الجزيئات التي تستهدف والأصباغ أو الجزيئات الأخرى ذات الاهتمام على البروتيناتمسبقا مع وصفت به أزيد. المزايا الثلاث الرئيسية لهذه الطريقة هي أن (1) وضع العلامات الأيضية يوضح شيئا يذكر لولا تأثير على اللياقة البدنية الفيروسية، ^1،7 (2) يمكن أن تستخدم مجموعة واسعة من يغاندس المستجيب، و (3) فهي سريعة بشكل ملحوظ، وموثوق بها يسهل الوصول إليها. ^1،2،7

في أول خطوة من هذا الإجراء، ويتم إنتاج جزيئات اتش تحمل إما azidohomoalanine (آها، مركب ميثيونين) أو السكر غير طبيعي O-N-مرتبط azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz)، وكلاهما والتي تحتوي على أزيد _(N-3) وظيفية المجموعة. بعد تنقية للجزيئات الفيروس أزيد المعدلة، وligated تحقيقا آلكاين يحتوي على شاردة طمرة فلوري بطريقة chemoselective إلى البروتينات قبل المسمى أو بروتينات سكرية. أخيرا، يجري تحليل SDS-PAGE للتدليل على الربط الناجح للمسبار على البروتينات قفيصة الفيروسية. ويرد آها التأسيس لتسمية جميع قفيصة الفيروسيةالبروتينات (Hexon، بينتون والألياف)، في حين أن نتائج دمج O-GlcNAz في وضع العلامات من الألياف فقط.

في هذا المجال المتطور، وقد تم طرق متعددة لأزيد-آلكاين ربط نجحت في تطوير، ولكن فقط وهما أننا وجدنا أن يكون الأكثر ملاءمة وأثبت هنا - السلالة التي تروج لها أزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (SPAAC) والنحاس والمحفز الاضافه الحلقيه أزيد-آلكاين (CuAAC) تحت جو امؤكسج.

البروتوكول

الرجوع إلى الجدول رقم 1 لإعداد جميع المخازن، ووسائل الإعلام والحلول المشار إليها في هذا البروتوكول.

1. إنتاج آها المسمى اتش

1. تعد زراعة الأنسجة 11 100 ملم أطباق من خلايا الكلى البشرية الجنينية (كلوة الجنين البشري 293) المحافظة على كلوة الجنين البشري في 293 خلية متوسطة النمو (انظر الجدول رقم 1) في 37 درجة مئوية حتى أنها وصلت إلى 80 - 90٪ confluency. (ملاحظة: مع الثقافات confluency أكثر من 90٪ قد يكون من الصعب نقل العدوى، وربما لا تنتج فيروسات على النحو المرغوب فيه)
2. ترخي الخلايا في واحدة من الأطباق من خلال إزالة أول متوسط ​​النمو، والشطف مرة واحدة مع 5 مل من عازلة TD، ثم احتضان خلايا لمدة دقيقة في 1 مل من EDTA-التربسين (1 ×).
3. إضافة 9 مل من 293 كلوة الجنين البشري خلية متوسطة النمو، واستخدام عدادة الكريات لحساب عدد من الخلايا تحصد 293 كلوة الجنين البشري من هذا الطبق. استخدام هذا الرقم لحساب المبلغ من نوع اتش 5 (Ad5) اللازمة للعدوى باستخدام multiplicitذ من العدوى (وزارة الداخلية) بقيمة 10 PFU / الخلية. حساب لحقيقة أن لAd5 طبيعي، ومؤشر العدوى (نسبة الجزيئات المعدية إلى العدد الكلي للجسيمات) هو عادة 1:20.
4. تحضير 10 مل من عازلة عدوى.
5. إزالة ببطء نمو الخلية كلوة الجنين البشري 293 متوسطة من أطباق ثقافة 10 المتبقية، ثم غسل مع 5 مل من عازلة TD. إضافة 1 مل من عازلة العدوى إلى كل طبق واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. خلال هذه الفترة العدوى، ويهز بلطف كل جانب طبق ثقافة إلى جانب 15 دقيقة في فترات.
6. بعد الإصابة، إضافة 9 مل من جديد كلوة الجنين البشري 293 خلية متوسطة النمو واحتضان على 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
7. تحضير 100 مل من متوسط ​​العلامات آها (أو التقى المتوسطة مراقبة للسيطرة). مما لا شك فيه لتصفية مخزون حلول مركزة مع فلتر 0.2 ميكرون محقنة معقمة قبل إعداد وسائل الاعلام وصفها.
8. بعناية (حتى لا يغسل الخلايا المصابة) إزالة نمو الخلية كلوة الجنين البشري 293 المتوسطة بعد 18 ساعة 1الثانية وغسل كل طبق ثقافة مع 5 مل من عازلة TD.
9. إزالة غسل العازلة TD حل وإضافة 10 مل من متوسط ​​العلامات آها على كل طبق الثقافة. لعنصر تحكم، يجب استخدام ميثيونين المتوسطة سيطرة بدلا من متوسط ​​العلامات آها على هذه الخطوة.
10. احتضان الخلايا المصابة في وصفها في المتوسط ​​37 درجة مئوية لمدة 6 ساعة. يمكن أن يتم وضع العلامات من أي وقت بين 12 - 24 ساعة بعد الاصابة ولكن لا ينبغي أن تكون أطول من 6 ساعات في المدة. وقد تم تحديد هذا الفاصل الزمني لتحقيق أقصى قدر من التداخل مع الفيروس ترجمة البروتين الهيكلي في حين لم يتم التأكد العدوى تقلصت إلى حد كبير. ⁷
11. إزالة بعناية وسيلة وسم حتى لا تعطل الخلايا. إضافة 10 مل من جديد كلوة الجنين البشري 293 خلية متوسط ​​النمو إلى كل طبق واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية لمدة ساعة 18. لتقليل الخسائر في الخلايا المصابة خلال هذه الخطوة، فإنه ليس من الضروري لإزالة حل الوسم تماما. نمو الخلية كلوة الجنين البشري يحتوي على 293 متوسطة وجود فائض من Mوآخرون والتي سوف تكومبيتي أي آها المتبقية.
12. انتقل إلى الخطوة 3 لتنقية.

2. إنتاج اتش Azido-السكر المسمى

1. اتبع الإجراء بعنوان إنتاج اتش آها المسمى وبما يصل إلى 1،5 خطوة.
2. تحضير 100 مل من متوسط ​​العلامات Azido السكر.
3. تغطي الخلايا مع 10 مل من جديد متوسط ​​العلامات Azido السكر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 44 ساعة.

3. تنقية الجزيئات أزيد المسمى الفيروسة الغدانية

1. إزالة وسائل الإعلام جنبا إلى جنب مع الخلايا المصابة من كل صحن والثقافة، ونقل إلى أنابيب مخروطية الشكل. الطرد المركزي في 2000 جرام لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف وresuspend لبيليه في عازلة TD (باستخدام 8 مل من عازلة TD 10 في المائة أطباق).
2. ليز الخلايا المصابة بواسطة المتكررة دورات تجميد ذوبان الجليد (3 أو أكثر) باستخدام قارورة ديوار من النيتروجين السائل والمياه 37 درجة مئوية حمام. الطرد المركزي في 2000 جرام لمدة 10 دقيقةفي 4 درجات مئوية في فصل حطام خلية من طاف.
3. إعداد التدرج كثافة CSCL أنبوب الطرد المركزي التي pipetting 1 2.5 مل من محلول غ / مل 1،25 CSCL الى أنبوب الطرد المركزي واضح جدا. المقبل، واستخدام ماصة مع طرفها وضعه على الجزء السفلي من أنبوب لإضافة ببطء 2.0 مل من 1،4 جم / مل حل CSCL، مع الحرص على عدم تعكير صفو اجهة التدرج.
4. ماصة طاف من 3،2 خطوة على رأس أنبوب كثافة التدرج CSCL، وإذا لزم الأمر العازلة TD إضافة لملء أنبوب. منبذة العينات في الدوار دلو يتأرجح في 125000 ز لمدة 1 ساعة على 15 درجة مئوية في منبذة فائقة.
5. بعد الانتهاء من تنبيذ فائق، ينبغي أن جزيئات الفيروس تكون واضحة مثل فرقة بيضاء سميكة في واجهة من الحلين CSCL. جعل ثقب صغير في الجزء السفلي من أنبوب مع إبرة معقمة للسماح للحل لاستنزاف قطرة قطرة.
6. جمع الفرقة بيضاء سميكة، والتي ينبغي أن تحتوي على جزيئات تسمى Ad5، تاكينز الرعاية لاستبعاد حل CSCL الزائدة. تجنب جمع البروتينات الخلوية التي سوف ألب فوق طبقة الفيروس. وبالإضافة إلى ذلك استبعاد capsids الفيريون الفارغة التي تشكل أخف طبقة أعلى قليلا من الفرقة فيروس بيضاء سميكة.
7. اختياريا، تنفيذ عملية تنقية النهائي على جزيئات Ad5 المسمى. إضافة جزء الخطوة التي تم جمعها من 3.6 إلى أنبوب منبذة فائقة 4 مل وملء الأنبوب مع 1.35 جم / مل حل CSCL. الطرد المركزي في 125000 ز لمدة 18 ساعة عند 15 درجة مئوية، وجمع الفرقة سميك أبيض التي تشكل في منتصف أنبوب كما هو موضح في خطوات 3.5 و 3.6. (لاحظ أنه إذا كان عيار الفيروسية منخفضة، عصابة بيضاء قد لا تكون مرئية بعد الطرد المركزي الثانية، وأنه لن يكون من الممكن استعادة الفيروس المسمى).
8. لتخزين جزيئات الفيروس على مدى فترات طويلة من الوقت، ينبغي القيام غسيل الكلى للاستخراج الفيروس التي تم جمعها ضد العازلة تخزين الفيروس. تخزين عينات فيروس مدال في -80 درجة مئوية.

4. لىgation من الجزيئات الفيروسة الغدانية التعديل مع تحقيقات آلكاين طريق الانفعال التي تروج لها أزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (SPAAC)

1. في التوصل إلى حل من 50 ميكرولتر من أزيد المعدلة Ad5 في عازلة تخزين الفيروس، إضافة 0.25 ميكرولتر من حل وضع العلامات SPAAC. (راجع الجدول الكواشف للحصول على قائمة من بائعى الألكاينات المتوترة متوفرة تجاريا).
2. السماح للتفاعل الاضافه الحلقيه السلالة التي تروج لها والمضي قدما بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. إذا تم استخدام مسبار الحساسة للضوء (مثل تمرة)، وتغطية وعاء التفاعل مع رقائق الألومنيوم.
3. تنقية الفيروس المسمى وفقا لالخطوة 6.

5. ربط الجزيئات الفيروسة الغدانية التعديل مع تحقيقات آلكاين عن طريق النحاس (I)، كحافز لأزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (CuAAC) في جو غير المؤكسج

1. مكان 7،2 ملغ من النحاس (I) بروميد (CuBr) مسحوق في أنبوب إيبندورف، مع تغطية احباط الالومنيوم.
2. ماصة 1 مل من DMSO في أنبوب إيبندورف الثانية.
3. إعداد50 ميكرولتر من حل وضع العلامات CuAAC في أنبوب إيبندورف الثالث. يغطى بورق الألومنيوم إذا كان التحقيق آلكاين غير حساسة للضوء (على سبيل المثال، طمرة آلكاين).
4. وضع ثلاثة أنابيب إيبندورف، لم يسبق لهم اللعب، في كيس القفازات امؤكسج لمدة 6 ساعة. ينبغي لجميع العينات تبقى داخل كيس القفازات حتى الانتهاء من رد فعل CuAAC.
5. إعداد 50 حل الأوراق المالية × من CuBr بإضافة 1 مل من DMSO إلى 7.2 ملغ من مسحوق CuBr، وكلاهما قد تم وفقا غير المؤكسج إلى الخطوة 5.4.
6. الشروع في رد فعل من قبل CuAAC pipetting 1 ميكرولتر من هذا الحل الأوراق المالية CuBr إلى 50 ميكرولتر من حل وضع العلامات CuAAC، والتي تم وفقا غير المؤكسج إلى الخطوة 5.4. السماح للتفاعل والمضي قدما لمدة 12 ساعة داخل كيس القفازات.
7. تنقية الفيروس المسمى وفقا لالخطوة 6.

6. تنقية وتخزين جزيئات الفيروس إعتبر

1. تنقية عينات الفيروس المسمى باستخدام Centri سبتمبر ترشيح هلامي تدور جمعايرتها مع الواق التخزين فيروس olumns، في أعقاب المبادئ التوجيهية للشركة المصنعة.
2. بدلا من ذلك، يمكن القيام بها لغسيل الكلى لتنقية ضد التخزين الاحتياطي فيروس.
3. يجب أن يتم تخزينها في جزيئات الفيروس المسمى عند -80 درجة مئوية.

7. SDS-PAGE من اتش إعتبر ونيون مسح جل

1. إضافة 20 عينة Laemmli ميكرولتر العازلة (2 ×) إلى 20 ميكرولتر من تنقية الفيروس المسمى وتغلى لمدة 10 دقيقة. منبذة العينات لمدة 30 ثانية لإزالة أي رواسب غير قابلة للذوبان. إذا النحاس المتبقية موجودة بعد تنقيتها، ويمكن غلي عينة يؤدي إلى خطوط سميكة من البروتين على هلام SDS-PAGE، مما يسبب صعوبة خلال التصور. في هذه الحالة، التخلي عن غليان من العينة في هذه الخطوة.
2. نعلق كاسيت هلام إلى الخلية الكهربائي وإضافة العازلة على التوالي. تحميل العدد المطلوب من الآبار مع عينات البروتين الفيروسي. استخدام واحد جيد ليتم تحميلها مسبقا staiعلامات نيد الوزن الجزيئي. تشغيل هلام لمدة 1 ساعة بمعدل 200 خامسا الحفاظ على الخلية الكهربائي المغطى برقائق الألومنيوم خلال كامل الفترة للحد من photobleaching التسمية fluorophore.
3. للحصول على أفضل قرار، وإزالة جميع fluorophore الحرة، والسماح للصبغ تتبع لنفد من هلام خلال الكهربائي. وقف الكهربائي ونقل بسرعة الجل إلى ماسح ضوئي هلام الفلورسنت ومسح هلام لانبعاث مضان في الطول الموجي المناسب (574 نانومتر لطمرة).
4. يمكن قياس عدد جزيئات الصبغة مترافق إلى كل الجسيمات الفيروسية عن طريق قياس مضان من عدة تركيزات طمرة معيار ومقارنتها مع عينة من الخطوة 7.3.

8. ممثل النتائج

وأظهرت النتائج الملحوظة من SDS-PAGE ونيون مسح جل من طمرة، مترافق Ad5 في الشكل 3. وعلى الرغم من تنفيذ هذه بالاشعة هلام فلوري على عينات موديfied عبر CuAAC، وينبغي أن تكون النتائج مماثلة عندما و تربط تحقيقات عبر SPAAC. هذه بالاشعة هلام وضع العلامات تشير إلى أن النتائج آها في التعديل من البروتينات الثلاثة Ad5 قفيصة (Hexon، بينتون، والألياف)، في حين وضع العلامات السكر يعدل فقط قفيصة الألياف والبروتين. وعلاوة على ذلك، زيادة في تركيز آها (4 ملم مقابل 32 ملم) عن نتائج في درجة أكبر من دمج آها، لكنه أيضا لم تظهر لخفض العدوى. النتائج السابقة تشير إلى أن ⁷ لAd5 المنتجة في 4mM آها، ما يقرب من 5٪ من المواقع ميثيونين تتعرض هي تمرة، تعديل، مع هذا العدد المتزايد إلى 10٪ عند استخدام 32 ملم آها. وهذا يتوافق مع ما يقرب من 280 و 510، على التوالي، وصبغ وصفت مواقع في Ad5 جسيم. وقد أشار تحليل لوضع العلامات السكر ⁽¹⁾ التي تشغل ما يقرب من 22 من مواقع ارتباط بالغليكوزيل 36 في Ad5 من قبل سكر azido وصفت في وقت لاحق مع تمرة.

إذا تم استخدام 10 لوحات زراعة الأنسجة لإنتاج أزيد المعدلة Ad5 كما هو موضح في هذا البروتوكول، 200 - وينبغي الحصول على 300 ميكرولتر من أزيد المعدلة الفيروس من الشريط الأبيض التي تم جمعها في الخطوة 3.6، مع ما يقرب من عيار 1.5 × 10 ¹² جزيئات / مل. وثمة صعوبة مشترك من هذا الإجراء هو عدم وجود فرقة الفيروسية في تنقية هذه الخطوة، التي يمكن أن تعزى إلى عيار فيروسي منخفض. هذا هو عموما نتيجة للاصابة الخلايا التي هي إما الإفراط أو تحت متموجة، أو عن طريق غسل بعيدا الخلايا - والتي أصبحت خففت من لوحة بعد الإصابة - في حين الشطف خلال الخطوة 1.

نظرة عامة على البروتوكول رقم 1. أدرج 1 أزيد المحتوية على آها أو GalNAz الى جزيئات اتش. ثم يتم إجراء ربط مع التحقيق الذي تجريه آلكاين فلوري عن طريق الكيمياء "فوق". أخيرا، يتم استخدام SDS-PAGE لإظهار الربط من لجنة التحقيق فلوري.

igure 2 "/>
الشكل 2. ربط من تحقيق آلكاين على أزيد معدلة والفيروس عن طريق (أ) SPAAC CuAAC (ب)، تحت دي المؤكسج و (ج) جو الاوكسيجين.

الشكل 3. بالاشعة نيون من SDS-PAGE-أزيد من تسمية نوع اتش 5 (Ad5) بعد اقتران CuAAC مع تمرة، آلكاين. (أ) آها المسمى Ad5، باستخدام اثنين من تركيزات آها. وضع العلامات ويبدو أن تحدث على Hexon اتش، والبروتينات والالياف بينتون قفيصة، مع قدر من العلامات المتزايدة مع تركيز آها المتزايدة. (ب) AC ₄ اتش GalNAz المسمى يبدو أن المسمى فقط على الألياف البروتين قفيصة.

حل	إعداد	ملاحظات
Ad5 تخزين العازلة	5 مم تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة (درجة الحموضة 8.0) تحتوي على 0.5 مم MgCl 2، 50 مم كلوريد الصوديوم، و 25٪ (V / V) الجلسرين، و 0.05٪ (W / V) ألبومين المصل البقري (BSA)	متجر في -20 درجة مئوية
Ad5 عدوى العازلة	2٪ (V / V) الأبقار عجل المصل، 1 × TC حل، Ad5 في العازلة التخزين (حجم تحدد باستخدام وزارة الداخلية من 10 خلية / PFU وفهرس العدوى من 1:20). تقديم حل نهائي لحجم استخدام TD العازلة	ويمكن تحديد Ad5 تركيز امتصاصا للأشعة فوق البنفسجية.
TC حل (200 ×)	136 CaCl 2 مم، 100 مم MgCl 2	تخزين في 4 درجات مئوية
TD العازلة	137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 0.07 مم نا 2 هبو 4، و 25 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5	تخزين في 4 درجات مئوية
كلوة الجنين البشري نمو الخلايا المتوسطة 293	متوسطة Dulbecco ومعدلة النسر (DMEM) تستكمل مع 10٪ (V / V) الأبقار عجل المصل (BCS) و 1٪ (V / V) القلم بكتيريا	تخزين في 4 درجات مئوية
السيستئين حل الأوراق المالية (100 ×)	DMEM (-الأرصاد الجوية /-السيستئين) تستكمل 200 مم L-سيستين	إعداد الطازجة وفلتر مع فلتر 0.2 ميكرون محقنة معقمة قبل الاستخدام.
آها الأسهم الحل (25 ×)	DMEM (-الأرصاد الجوية /-السيستئين) تستكمل مع 100 ملي مول L-Azidohomoalanine	إعداد الطازجة وفلتر مع فلتر 0.2 ميكرون محقنة معقمة قبل الاستخدام.
آها وضع العلامات المتوسطة	DMEM (-الأرصاد الجوية /-السيستئين) تستكمل مع BCS 10٪، آها الأسهم حل (1 ×)، 2 مم L-سيستين	إعداد الطازجة قبل استخدامها. هذا يتوافق مع ج 4 ملمoncentration من آها، على الرغم من أن يمكن استخدام تركيزات مختلفة (انظر نتائج الممثل).
التقى الأسهم حل (25 ×)	DMEM (-الأرصاد الجوية /-السيستئين) تستكمل مع 100 ملي مول L-الميثيونين	إعداد الطازجة وفلتر مع فلتر 0.2 ميكرون محقنة معقمة قبل الاستخدام.
التقى سيطرة المتوسطة	DMEM (-الأرصاد الجوية /-السيستئين) تستكمل مع BCS 10٪، التقى حل الأوراق المالية (1 ×)، 2 مم L-سيستين	إعداد الطازجة قبل استخدامها.
AC الأسهم GalNAz 4 حل (1،000 ×)	50 ملي peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (ميلان 4 GalNAz) في الميثانول	تخزن في درجة مئوية 4 ميلان 4 GalNAz خطوة تمهيدية لGlcNAz الأيض.
Azido السكر في وضع العلامات المتوسطة	100 ميكروليتر المتردد الأسهم GalNAz 4 حل، 100 مل كلوة الجنين البشري نمو الخلايا المتوسطة 293	تسمح الميثانول لتتبخر قبل مضيفا كلوة الجنين البشري نمو الخلايا المتوسطة 293.
حلول كلوريد السيزيوم	CSCL الذائبة في عازلة TD: 1.25 جم / مل (18.08 جم / 50 مل H 2 O) 1.35 جم / مل (25.60 جم / 50 مل H 2 O) 1.40 جم / مل (31.00 جم / 50 مل H 2 O)	التدرجات كثافة للتنبيذ فائق
فيروس تخزين العازلة	الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.2، التي تحتوي على 0.5 مم CaCl 2، 0.9 مم MgCl 2، و 10٪ (V / V) الجلسرين	متجر في -20 درجة مئوية
طمرة-BCN حل وضع العلامات (SPAAC)	طمرة-BCN في DMSO: استخدام الأشعة فوق البنفسجية أ بsorbance (OD 260 الفحص) لتحديد عيار من الحل فيروس في الخطوة 4.1 تحديد العدد الإجمالي من الجسيمات الفيروسية في قسامة 50 ميكروليتر (N Ad5) يتم تحديد molarity طمرة-BCN (في M) باستخدام: ج BCN = 4 × 10 × 8 (N Ad5 / N آفو) N = 6.022 × آفو 10 23 (بحيث خليط التفاعل أعدت في الخطوة 4 يحتوي على 100 تحقيقات آلكاين في الفيريون)	السلالة التي تروج لها مسبار آلكاين ليقترح SDS-PAGE، وعيار الفيروسية من حوالي 10 12 جزيئات / مل
طمرة، آلكاين حل وضع العلامات (CuAAC)	50 ميكرولتر من أزيد المعدلة Ad5 في عازلة تخزين فيروس (N Ad5 كما هو محدد أعلاه)، و 1.5 ملي batho phenanthroline disulfonate (أي 1.5 × نهائي تركيز CuBr)، طمرة، آلكاين. يتم تحديد طمرة-آلكاين molarity (في M) باستخدام: ج ALK = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N آفو) (بحيث خليط التفاعل أعدت في الخطوة 5 يحتوي على 100 تحقيقات آلكاين في الفيريون)	ومن المعروف تريس العازلة لتكون قادرة على المنافسة ويجند المثبطة للنحاس. 8
Laemmli العازلة عينة (2 ×)	125 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 6.8)، 4٪ (W / V) SDS، 20٪ (V / V) الجلسرين، و 10٪ (V / V) 2-المركابتويثانول، و 0.004٪ (W / V) زرقة البروموفينول
تشغيل العازلة	187 ملي جليكاين، 19 مم تريس، حمض الهيدروكلوريك، 3.5 ملم SDS في H 2 O	تخزين في 4 درجات مئوية

تي "> الجدول رقم 1. التحضير للمخازن والحلول التي يقتضيها هذا البروتوكول.

المناقشة

تطور ردود الفعل فوق chemoselective وbioorthogonal، بما فيها تلك التي من أزيدات، هو منطقة التطور السريع للبحوث، وبعد ذلك هناك عدد متزايد من ردود الفعل هذه للاختيار من بينها لتقديم الطلبات bioconjugation. قيدت نحن في نطاق هذا البروتوكول لتشمل اثنين فقط من الأساليب التي تم اختيارها بسبب فائدتها في مختبرنا الخاص والتجاري لجميع الكواشف.

في الطريق الأول من نوعه - السلالة التي تروج لها أزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (SPAAC...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
نوع اتش 5 (Ad5) تحتوي على التحوير GFP	BCBC	391
الكلى الجنينية البشرية (كلوة الجنين البشري 293) الخلايا	ATCC	CRL-1573
Dulbecco ومعدلة النسر متوسطة (DMEM)، ارتفاع نسبة الجلوكوز	إينفيتروجن	11965-092
Dulbecco ومعدلة النسر متوسطة، لا الميثيونين، لا سيستين (DMEM و الأرصاد الجوية /-السيستئين)، ارتفاع نسبة الجلوكوز	إينفيتروجن	21013-024
الأبقار العجل المصل	إينفيتروجن	16170-078
بنسلين - الستربتوميسين 100 × الحل (القلم بكتيريا)	إينفيتروجن	15140-122
0.5٪ التربسين-EDTA (10 ×)	إينفيتروجن	15400-054
100 خلية ثقافة صحن مم، الأنسجة ثقافة البوليسترين المعالجة	دينار بحريني الصقر	353003
خلية ثقافة CO 2 حاضنة
عدادة الكريات
مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية
معقم مرشح محقنة (0.2 ميكرون، خلات السليلوز)	VWR	28145-477 (NA)، 514-0061 (أوروبا)
أفانتي JE الطرد المركزي	بيكمان كولتر	369001
مخروطي أنابيب (50 مل، معقمة)	دينار بحريني الصقر	352098
أنبوب، Thinwall، فائقة الوضوح، 13.2 مل، 14 × 89 ملم	بيكمان	344059
منبذة فائقة مجهزة 41 SW SW و 60 Rotor	بيكمان
إيبندورف بيوبور الآمن للقفل أنابيب، 1.5 مل	إيبندورف	0030 121.589
منبذة 5418	إيبندورف	5418
Centri سبتمبر تدور الترشيح أعمدة هلام	فصل برينستون	CS-901
إبرة معقمة، قياس 18
النيتروجين قفاز كيس (إذا CuAAC امؤكسج التي يتعين القيام بها)
قارورة ديوار
النيتروجين السائل
الكهربائي للخلية
فلوري هلام الماسح الضوئي
استعداد جل تريس، حمض الهيدروكلوريك جل	الحيوي راد	161-1105
L-Azidohomoalanine	AnaSpec	63669
جينا العلوم البيولوجية	CLK-AA005
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (ميلان 4 GalNAz)	إينفيتروجن	C33365
الحرارية العلمية	88905
سيغما الدريخ	A7480
Bathophenanthroline disulfonic حامض (BDA) ملح الصوديوم	النائب Biomedicals	0215011201
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)
الميثانول
تريس قاعدة (تريس (hydroxymethyl) aminomethane)
فوسفات الصوديوم (نا2 هبو 4)
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
1M حمض الهيدروكلوريك
الغليسيرول
ألبومين المصل البقري
L-السيستين
L-ميثيونين
SDS (سلفات الصوديوم دوديسيل)
2-المركابتويثانول
جليكاين
زرقة البروموفينول
السيزيوم كلوريد (CSCL)		& Nباهوجان ساماج؛
النحاس (I) بروميد (CuBr)
كلوريد الكالسيوم (CaCl 2)
كلوريد البوتاسيوم (بوكل)
كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2)
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)
آلكاين مسبار ل* CuAAC
طمرة آلكاين	إينفيتروجن	T10183
توتر آلكاين مسبار ل* SPAAC
طمرة ديبو آلكاين	إينفيتروجن	C10410