ووصف طريقة تصور وقياس هيكل 3 الأبعاد للالكبدي الوريد البابي أو الماوس القناة الصفراوية داخل الكبد. ويمكن أيضا هذه التقنية يلقي الراتنج يمكن تطبيقها على غيرها من أنظمة الأقنية أو الأوعية الدموية ويسمح لل في الموقع التصور أو الكمي للبنية سليمة لنظام التواصل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الأبعاد 3-صب الراتنج والتصوير من الوريد البابي داخل الكبد أو ماوس نظام القناة الصفراوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الهيئات، والهندسة المعمارية الصحيح للهياكل الأوعية الدموية والأقنية لا غنى عنه لمناسبة ظيفة فسيولوجية، وتشكيل وصيانة هذه الهياكل هي عملية عالية التنظيم. ويعتمد تحليل هذه الهياكل المعقدة 3-الأبعاد، إما بصورة كبيرة على الفحص 2-الأبعاد في الفرع أو على حقن صبغة الدراسات. هذه التقنيات، ومع ذلك، ليست قادرة على توفير التمثيل الكامل وقابلة للقياس الكمي للهياكل الأقنية أو الأوعية الدموية وهي تهدف إلى توضيح. بدلا من ذلك، طبيعة الأبعاد 3-يلقي راتنج البلاستيك يولد لقطة الدائمة للمنظومة ورواية وتقنية مفيدة على نطاق واسع لتصور وقياس الأبعاد 3-الهياكل والشبكات.
وهناك ميزة حاسمة للنظام الصب الراتنج هو القدرة على تحديد سليمة ومتصلة، أو التواصل وبناء وعاء دموي أو لاصق. هيكل الأوعية الدموية ودوكشبكات تل حاسمة من أجل وظيفة الجهاز، وهذه التقنية لديها القدرة على مساعدة دراسة شبكات الأوعية الدموية والأقنية في عدة طرق. ويمكن استخدام الصب الراتنج لتحليل مورفولوجيا العادي والعمارة الفنية للبنية اللمعية، وتحديد التغييرات تخلقية التنموية، وكشف الاختلافات المورفولوجية في العمارة الأنسجة الطبيعية بين الدول والمرض. وقد استخدمت الأعمال السابقة الصب الراتنج للدراسة، على سبيل المثال، العيوب المعمارية والوظيفية داخل نظام الصفراوية داخل الكبد الماوس القناة التي لم ترد في 2-تحليل الأبعاد 1،2 الهيكل، تغييرات في الأوعية الدموية في المخ لمرض الزهايمر نموذج الفأر 3 ، تشوهات في الوريد البابي بوابة ارتفاع ضغط الدم والتليف الكبدى الفئران 4، الخطوات التنموية في النضج اللمفاوي الفئران غير ناضجة والرئتين بين الكبار 5، تغييرات فورية الاوعية الدموية الدقيقة في كبد الفئران والبنكرياس والكلى واستجابة لإصابة في الكيميائية6.
هنا نقدم وسيلة لتوليد يلقي الراتنج الأبعاد 3-شبكة الأوعية الدموية أو الماوس الأقنية، مع التركيز بشكل خاص على الوريد البابي داخل الكبد والقناة الصفراوية. ويمكن تصور هذه يلقي بمسح أو تنقيع الأنسجة ويمكن بعد ذلك تحليل. ويمكن تطبيق هذه التقنية لنظام الأوعية الدموية أو أي تقريبا الأقنية وقابلا للتطبيق مباشرة إلى أي دراسة التساؤل في التنمية، وظيفة، والصيانة، أو إصابة بنية الأبعاد 3-الأقنية أو الأوعية الدموية.
البروتوكول
1. إعداد قنية
- تدفئة الباب 1 بوصة طويلة من الأنابيب مع PE10 متناول يدك وتمتد بحيث تصبح أنابيب رقيقة.
ملاحظة: حجم السفينة أو القناة التي سوف مقنى تحديد درجة تمتد المطلوبة. يجب أن يكون قنية جيدا امتدت ليلقي القناة الصفراوية ولكن لا يجوز أن يشترط أن يكون معتدل تمتد لتناسب داخل الوريد أكبر موقع البوابة. - قطع الأنابيب الممتدة في قطر لإنشاء تلميح مشطوف.
- قطع حافة أخرى من الأنابيب لإنشاء الجزء 5-6 بوصة.
- إدراج مقياس 32، ½ بوصة إبرة تحت الجلد في حافة غير مشطوف من الأنابيب.
2. إعداد المحاقن مع PBS
- ملء حقنة 3 مل مع برنامج تلفزيوني.
- سحبت المسمار الحقنة تحت الجلد على الإبرة مع المرفقة PE10 أنابيب معدة مسبقا.
- نفض الغبار قد ملأت حقنة حقنة ودفع المكبس لضمان PBS الإبرة والأنابيب ولا توجد فقاعات الهواء في الحقنة.
- وضع الحقنة المعدة مع PBS في شكل حقنة صاحب من الطين النمذجة. وهذا يبقي حامل حقنة ثابت بينما يتم إدراج أنابيب في القناة.
3. الأخرى المنصوص المتابعة
- تزن 0.1 غرام من المواد الحفازة في وعاء صغير، على سبيل المثال، واحدة من جانب لوحة 24 أيضا.
- 1 مل سحب الراتنج إلى حقنة مل 3.
ويمكن تعديل المبالغ النسبية للمحفز والراتنج لتغيير وقت المعالجة: مذكرة. خفض كمية مايو محفز، ولكن زيادة يلقي الانكماش وتؤدي إلى مجموعة من الممثلين اقل من المرغوب.
ملاحظة: عند التعامل مع الراتنج، واتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب الاتصال مع الراتنج أو استنشاق الأبخرة من الراتنج. ارتداء القفازات دائما وتنفيذ الخطوات التي تنطوي على الراتنج في منطقة جيدة التهوية، مثل غطاء الدخان الكيميائي - قطع قطعة من الحرير خياطة 5.0 من 5 بوصات تقريبا لاستخدامه بمثابة رباط.
4. إعداد الماوس
- التضحية الماوس الكبار. وضع الماوس على ظهرها وفتح تجويف البطن.
- وضع الماوس على تشريح منصة النطاق. وضع أنبوب 15 مل المخروطية عموديا تحت الماوس لزيادة وضوح الرؤية والوصول إلى الكبد.
- مسحة القطن الرطب مع PBS واستخدامها على الوجه الكبد صعودا وبعيدا عنك لفضح عرض الظهرية من الكبد مع الوريد البابي أو خارج الكبد القناة الصفراوية المشتركة.
- ليلقي الوريد البابي، يمكنك منع تخثر الدم عن طريق الوريد مع بيغ درجة حرارة الغرفة PBS. إرفاق الإبرة إلى حقنة 3 مل مليئة PBS وإدراج إبرة في الوريد البابي خارج الكبد بقدر من الكبد ما تستطيع. دفع برفق من خلال PBS في الوريد البابي. جعل نيك في الوريد الكاردينال المشتركة لتصريف الدم. استخدام مسحة القطن مبللة لتدليك الكبد، وتعزيز الصرف الدم. لا ينصح لهذه الخطوة القناة الصفراوية، وربما لا يكون من الضروري لجميع أنظمة الأوعية الدموية.
ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن تكون أيضا performed مع بارافورمالدهيد 4٪ بدلا من PBS. قد تستخدم من بارافورمالدهيد 4٪ زيادة سلامة الأوعية الدموية ويؤدي إلى المدلى بها أكثر دقة وتحديدا من هياكل أصغر الأوعية الدموية.
5. يقني؛ يدخل القنية خارج الكبد الوريد البابي أو القناة الصفراوية المشتركة
- استخدام ملقط المنحني لتمرير ضمد خياطة جراحية تحت الوريد البابي أو القناة الصفراوية، ما يقرب من ربع بوصة من الكبد.
- ربط عقدة في خياطة مشترك فضفاض. لا تشديد عقدة.
- إذا كنت تعمل مع نظام مفتوح العضوية، قد يكون من المفيد لادراك التعادل وتشديد ربطة على الطرف الآخر من النظام. إذا كان لديك فتح الوريد المشتركة الكاردينال لاستنزاف الدم من الوريد البابي، والتعادل رباط حولها لزيادة الضغط داخل الوريد البابي ومنع تسرب راتنج في الوريد الكبدي المركزية.
- استخدام مقص الربيع لإجراء قطع صغير في الوريد البابي أو القناة الصفراوية، ما يقرب من ربع بوصة تحت عقدة الخيط. هذا مكعبيجب ر اختراق أي أكثر من منتصف الطريق من خلال قطر الوريد البابي أو القناة الصفراوية.
- باستخدام ملقط # 5، أمسك الوريد البابي أو القناة الصفراوية في موقع القطع وإدراج نهاية مشطوف من أنابيب في القناة الصفراوية.
- دفع غيض من أنابيب الماضي ضمد قبل نحو ربط والكبد.
- اختبار للتأكد من دقتها عن طريق حقن PBS كيفية تركيب الكانيولا من خلال قنية ومشاهدة لمعرفة ما اذا كان يدخل الوريد البابي أو القناة الصفراوية.
- تشديد ربطة على عقد قنية في المكان.
6. الراتنج المصبوب الوريد البابي داخل الكبد أو القناة الصفراوية
- إضافة الراتنج قبل قياسها 1 مل إلى ما قبل قياسها حافزا ز 0.1 و تخلط جيدا. تجنب توليد فقاعات الهواء.
- رسم محفز راتنج خليط مرة أخرى إلى حقنة مل 3. إزالة أي فقاعات الهواء عن طريق الحقنة بلطف عبها وطرد فقاعات.
ملاحظة: لصب الهياكل الصغيرة، قد يكون من المفيد استخدام فراغ الغرفة لإزالة فقاعات الهواء صغيرة جدا من الالراتنج الإلكتروني وتحسين نوعية الزهر. للسماح لوقت لتنفيذ هذه الخطوة، سوف يكون من الضروري تقليل نسبة حافز / الراتنج من أن المقترح أعلاه من أجل إبطاء علاج الراتنج. - استبدال بعناية PBS التي تحتوي على المحاقن مع الراتنج التي تحتوي على المحاقن، وترك إبرة قياس 32 تعلق على قنية.
- ببطء وبرفق دفع الراتنج في الوريد البابي أو القناة الصفراوية حتى يتم تعبئة الزيادات المقاومة والكبد.
- استخدام مسحة القطن مبللة لتدليك بلطف الكبد وتشجيع التعبئة حتى.
- إزالة قنية من هيكل وبسرعة إعادة إحكام ربطة لمنع تسرب الراتنج.
- السماح الماوس لوضع مسطح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في حين أن يشفي الراتنج، ثم إزالة الكبد.
- المضي قدما في تطهير أو تنقيع الكبد.
7. واضحة لرؤية الكبد في الموقع
- إصلاح الكبد في بارافورمالدهيد 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، هزاز.
- يغسل الكبدفي برنامج تلفزيوني لمدة ساعة على الأقل أربعة، هزاز. عند هذه النقطة، قد فصل فصوص الكبد إذا لزم الأمر.
- يذوى في الميثانول بنسبة 50٪ ثم في الميثانول بنسبة 100٪ لساعة لا يقل عن أربعة لكل منهما، هزاز في درجة حرارة الغرفة.
- مسح الكبد في محلول البنزيل الكحول 01:02 والبنزيل بنزوات (BABB) لمدة لا تقل عن 24 ساعة، هزاز. قد تكون هناك حاجة مرات غسيل لفترة أطول. إذا كان الكبد لا واضحة تماما بعد 2-3 أيام، نقل مرة أخرى إلى 100٪ الميثانول لمدة 24 ساعة وكرر BABB المقاصة.
- الكبد يغرق في BABB في طبق بتري الزجاج للتصوير في الموقع.
8. يعطن أنسجة الكبد
- إزالة الكبد من الماوس ووضعها في أنبوب مخروطي 50 مل مع الماء. 1 ساعة الانتظار لعلاج الراتنج كاملة. فصوص الكبد منفصلة إذا لزم الأمر.
- صب قبالة المياه ونقل الكبد لزجاجة. يغرق في KOH 15٪. ترك بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. لا موسيقى الروك.
- صب بعناية قبالة KOH وغسل الزهر في الماء المقطر. ملاحظة: الزهر هو النسخةيجب التعامل مع ذ هشة وبعناية فائقة. تجنب تعطيل المدلى بها عند إضافة أو إزالة السائل من أنبوب.
- عندما يلقي الراتنج نظيفة، وضع بلطف على Kimwipe لتجف، ثم نقل إلى وعاء ليتم تخزينها.
9. ممثل النتائج
وسوف يلقي A الناجح للالوريد البابي أو القناة الصفراوية تظهر شبكة من الفروع المستمر أصغر تدريجيا تمتد من المحيط إلى نقير الكبد.
ويظهر الشكل 1 الوريد البابي المدبر تصور في الموقع بعد BABB المقاصة. الشكل 1A يظهر المدلى بها من الفص الأيسر الكبد كامل وشكل وحجم الزهر. 1B الشكل يبين وجهة نظر عن قرب من المدلى بها نفسه، مما يدل على الاختراق من الراتنج في فروع الوريد أصغر في محيط بوابة الكبد.
ويبين الشكل 2 يلقي الوريد البابي التي مرت KOH أماهceration. الشكل 2A يبين كامل الفص الأيسر والكبد 2B الشكل هو قرب فروع الطرفية الصغيرة.
كما تم تطبيق هذه التقنية بنجاح إلى داخل الكبد والقناة الصفراوية باستخدام كل من نشر المقاصة BABB وتقنيات التعطين KOH 1،2،7.
وتشمل المشاكل المشتركة ناقصة يملأ، فقاعات في الراتنج، وتجاوز في الأنظمة المحيطة أو الأنسجة. الشكل 3 يوضح كيفية تعبئة تعترف ناقصة (الشكل 3A)، فقاعات (الشكل 3A)، وتجاوز من راتنج من الوريد البابي إلى الوريد المركزي (الشكل 3B).
اتخاذ جميع الصور باستخدام MZ ايكا المجسام FA 16 و QImaging RETIGA 4000R الكاميرا.
الشكل 1 غادر. يلقي الراتنج BABB-الفص الكبدي تطهيرها من الوريد البابي. A. يلقي الراتنج يظهر الهيكل الهرمي المتفرعة التي تمتد من المحيط إلى نقير الكبد. يلقي الراتنج يظهر في اللون الأصفر داخل الفص الأزرق الكبد ملون. B. A إغلاق يظهر الراتنج التي تملأ يمتد إلى فروع صغيرة في محيط الكبد. الراتنج هو اللون الأبيض من خلال مسح الكبد. شريط مقياس = 1 مم.
غادر الشكل 2. الأنسجة، المتهتك يلقي الراتنج من الفص الكبدي الوريد البابي. A. الراتنج يلقي من الفص الكبد كله يظهر العديد من الفروع ذات أحجام مختلفة. B. عن قرب تبين فروع صغيرة في محيط الكبد. ريش ظهور الفروع الصغيرة يمثل الراتنج ملء الفراغات الجيبية وتكون أو لا تكون مرئية على الراتنج يلقي وسوف تزيد من كثافة واضحة فرع إذا كان موجودا. الراتنج هو أبيض اللون. شريط مقياس = 1 مم.
FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 3. المشاكل المشتركة مع يلقي الراتنج. A. هناك تعبئة كاملة من الوريد الفص الأيسر هو المدخل واضح من قبل فروع يلقي بعض أو كل فشله في توسيع نطاق إلى المحيط الكبد. هذا يلقي يعرض أيضا فقاعات وظاهرة للعيان وفواصل الصب المستمر في (السهم). B. نظرا لقربها من الوريد البابي والوريد المركزي فروع في بعض الأماكن، وسوف الراتنج الوريد البابي تدخل في كثير من الأحيان وملء الوريد المركزي. ويمكن التعرف على هذا عندما يكون هناك فرعين نقيري متميزة (الأسهم) واثنين من الهياكل المتفرعة التي لديها أنماط مختلفة والتداخل. ويمكن أن يتم التفريق بين الأخطاء التقنية والتغيرات المورفولوجية الحقيقية بطريقتين. أولا، يجب مقارنة هيكل الزهر للهيكل المتوقع يعتمد على 2 الأبعاد تحليل أو أساليب أخرى. الثانية، من المهم لأداء عدة نسخ متماثلة، وعندما يكون ذلك ممكنا، تحديد البنيةولدى عودتهم لتحليل احصائى لتحديد تكرار وإذا كان هناك تغيير ذات دلالة إحصائية بين وداخل المورفولوجية التجريبية المختلفة وتحديد الأسلحة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد وصفت لنا أمثلة محددة عن الكيفية التي يمكن أن يلقي الوريد البابي داخل الكبد والقناة الصفراوية نظم في الكبد، ولكن يمكن تطبيق هذه التقنية لنظام الأقنية الأخرى تقريبا أي تعديلات أو الأوعية الدموية مع طفيفة. وقد أظهرت الأعمال السابقة جدوى هذه التقنية في أنواع متعددة، بما في ذلك الماوس 1،2،7-9، البطيطة 10،11، 12،13 الأرنب، الكلب 14 سنة، والخنازير 15، والعديد من الأجهزة في، بما في ذلك الأنف غدة 14، القلب 16، 12،13 المث...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) إلى SSH (R01-DK078640)، من معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) من خلال برنامج HHMI / فاندربيلت شهادة جامعية في الطب الجزيئي لTJW (GRDOT56006779)، في فاندربيلت السكري مركز البحوث والتدريب (P30-DK020593) ومرض الجهاز الهضمي فاندربيلت مركز أبحاث (P30-DK058404) توفير الخدمات الأساسية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | كتالوج رقم | تعليقات |
| PE10 البولي ايثيلين أنابيب | فيشر العلمية | 1417012P | |
| 5-0 الجراحية الحرير الأسود مضفر | Roboz الجراحية | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 غرام X 13 ملم إبرة | الهواء تيتي | TSK3213 | |
| ربيع مقص | أدوات العلوم الجميلة | 15000-08 | |
| عدد 5 ملقط | أدوات العلوم الجميلة | 91150-20 | |
| Mercox II طقم | البحث لاد | 21247 | |
| البنزيل الكحول | فيشر العلمية | 1816-1804 | Oنلي اللازمة لإزالة BABB |
| بنزيل بنزوات | MP Biomedicals، LLC | 154839 | المطلوب فقط لإزالة BABB |
| الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) | |||
| النمذجة الطين | |||
| جدول | |||
| مختبر مقص | |||
| 15 مل أنابيب البولي بروبلين كاب | |||
| 4٪ paraformaldahyde | |||
| 15٪ هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) | المطلوب فقط لالتعطين | ||
| موس | |||
| 100٪ الميثانول | |||
| 3 مل بالتركيبة قفل حقنة |
المراجع
- Sparks, E. E., Perrien, D. S., Huppert, K. A., Peterson, T. E., Huppert, S. S. Defects in hepatic Notch signaling result in disruption of the communicating intrahepatic bile duct network in mice. Dis. Model Mech. 4, 359-367 (2011).
- Vanderpool, C. Genetic interactions between hepatocyte nuclear factor-6 and notch signaling regulate mouse intrahepatic bile duct development in vivo. Hepatology. 55, 233-243 (2012).
- Meyer, E. P., Ulmann-Schuler, A., Staufenbiel, M., Krucker, T. Altered morphology and 3D architecture of brain vasculature in a mouse model for Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 3587-3592 (2008).
- Van Steenkiste, C. Vascular corrosion casting: analyzing wall shear stress in the portal vein and vascular abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic rodents. Lab Invest. 90, 1558-1572 (2010).
- Dickie, R., Cormack, M., Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Tsuda, A. Deep pulmonary lymphatics in immature lungs. Journal of Applied Physiology. 107, 859-863 (2009).
- Kelly, D. M., McEntee, G. P., McGeenery, K. F., Fitzpatrick, J. M. Microvasculature of the pancreas, liver, and kidney in cerulein-induced pancreatitis. Archives of Surgery. 128, 293-295 (1993).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Carlson, T. R. Endothelial expression of constitutively active Notch4 elicits reversible arteriovenous malformations in adult mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9884-9889 (2005).
- Hemmeryckx, B., Emmerechts, J., Bovill, E. G., Hoylaerts, M. F., Lijnen, H. R. Effect of ageing on the murine venous circulation. Histochem. Cell Biol. , (2012).
- Hossler, F. E., Olson, K. R. Microvasculature of the nasal salt gland of the duckling, Anas platyrhynchos: quantitative responses to osmotic adaptation and deadaptation studied with vascular corrosion casting. J. Exp. Zool. 254, 237-247 (1990).
- Hossler, F. E., West, R. F. Venous valve anatomy and morphometry: studies on the duckling using vascular corrosion casting. Am. J. Anat. 181, 425-432 (1988).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Structure and blood supply of intrinsic lymph nodes in the wall of the rabbit urinary bladder--studies with light microscopy, electron microscopy, and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 477-484 (1998).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Evidence for a unique elastic sheath surrounding the vesicular arteries of the rabbit urinary bladder--studies of the microvasculature with microscopy and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 472-476 (1998).
- Hossler, F. E., Kao, R. L. Microvasculature of the urinary bladder of the dog: a study using vascular corrosion casting. Microsc. Microanal. 13, 220-227 (2007).
- Wischgoll, T., Choy, J. S., Kassab, G. S. Extraction of morphometry and branching angles of porcine coronary arterial tree from CT images. Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1949-H1955 (2009).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E., Douglas, L. E. Anatomy and morphometry of myocardial capillaries studied with vascular corrosion casting and scanning electron microscopy: a method for rat heart. Scan Electron Microsc. , 1469-1475 (1986).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E. Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods. Microsc. Microanal. 7, 253-264 (2001).
- Mondy, W. L. Micro-CT of corrosion casts for use in the computer-aided design of microvasculature. Tissue Eng. Part C Methods. 15, 729-738 (2009).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction. The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation. The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
