تُعد الحويصلات أحادية الطبقة الكبيرة (LUVs) المحددة كيميائياً حيوياً نظاماً نموذجياً ملائماً لتحليل تفاعلات عائلة BCL-2، مع ما يترتب على ذلك من آثار مباشرة في فهم المسار الميتوكوندري للموت الخلوي المبرمج (apoptosis) بشكل أفضل. يتم تقديم طريقة لإنتاج LUVs، جنباً إلى جنب مع تركيبات بروتينية قياسية من عائلة BCL-2 وعناصر تحكم لفحص نفاذية LUV.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
دراسة BCL-2 وظيفة الأسرة مع حويصلات كبيرة Unilamellar
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتكون عائلة BCL-2 (خلايا B في سرطان الدم اللمفاوي المزمن/الليمفوما) من حوالي عشرين بروتيناً تتعاون إما للحفاظ على بقاء الخلية أو لتحفيز الموت الخلوي المبرمج.1في أعقاب الإجهاد الخلوي (على سبيل المثال، (تلف الحمض النووي DNA)، يتم تنشيط المؤثرات المحفزة للموت الخلوي المبرمج من عائلة BCL-2، وهي BAK (القاتل المضاد لـ BCL-2 1) و/أو BAX (البروتين X المرتبط بـ BCL-2)، مما يؤدي إلى زعزعة سلامة الغشاء الميتوكوندري الخارجي (OMM)، وهي العملية التي يُشار إليها باسم نفاذية الغشاء الميتوكوندري الخارجي (MOMP).1بعد حدوث نفاذية الغشاء الخارجي للميتوكوندريا (MOMP)، تقوم البروتينات المحفزة للاستماتة (على سبيل المثال، الوصول إلى السيتوبلازم (سيتوكروم ج)، وتحفيز تنشيط الكاسباز، ويتبع ذلك حدوث الموت الخلوي المبرمج سريعاً2.
لكي يتمكن BAK/BAX من تحفيز MOMP، فإنهما يتطلبان تفاعلات عابرة مع أعضاء من مجموعة فرعية أخرى محفزة للموت الخلوي المبرمج من عائلة BCL-2، وهي البروتينات التي تحتوي على نطاق تماثل BCL-2 رقم 3 (BH3-only)، مثل BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. وتعمل البروتينات المضادة للموت الخلوي المبرمج من عائلة BCL-2 (على سبيل المثال، BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL؛ و myeloid cell leukemia 1, MCL-1) على تنظيم بقاء الخلية من خلال التحكم الدقيق في التفاعلات بين BAK/BAX والبروتينات من نوع BH3-only القادرة على تحفيز تنشيط BAK/BAX بشكل مباشر7,8. بالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد مدى توفر بروتينات BCL-2 المضادة للموت الخلوي المبرمج بواسطة بروتينات BH3-only المحسسة/المزيلة للكبح، مثل BAD (BCL-2 antagonist of cell death) أو PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis)، والتي ترتبط بالأعضاء المضادة للموت الخلوي المبرمج وتثبط عملها7,9. وبما أن معظم مجموعة بروتينات BCL-2 المضادة للموت الخلوي المبرمج تتركز في OMM، فإن القرار الخلوي بالحفاظ على البقاء أو تحفيز MOMP يتم تحديده من خلال تفاعلات متعددة لعائلة BCL-2 عند هذا الغشاء.
تُعد الحويصلات أحادية الطبقة الكبيرة (LUVs) نموذجاً كيميائياً حيوياً لاستكشاف العلاقات بين تفاعلات عائلة BCL-2 ونفاذية الغشاء10. وتتكون هذه الحويصلات من ليبيدات محددة يتم تجميعها بنسب تم تحديدها في دراسات تكوين الليبيدات المستخلصة بالمذيبات من ميتوكوندريا Xenopus (46.5% phosphatidylcholine، و28.5% phosphatidylethanoloamine، و9% phosphatidylinositol، و9% phosphatidylserine، و7% cardiolipin)10. ويُعد هذا النظام نموذجاً ملائماً لاستكشاف وظيفة عائلة BCL-2 بشكل مباشر لأن المكونات البروتينية والليبيدية محددة تماماً وسهلة التعامل، وهو الأمر الذي لا يتوفر دائماً في الميتوكوندريا الأولية. ورغم أن نسبة cardiolipin لا تكون عادةً بهذا الارتفاع في جميع أنحاء الغشاء الميتوكوندري الخارجي (OMM)، إلا أن هذا النموذج يحاكي الغشاء الميتوكوندري الخارجي بدقة لتعزيز وظيفة عائلة BCL-2. علاوة على ذلك، يسمح تعديل أحدث للبروتوكول المذكور أعلاه بإجراء تحليلات حركية لتفاعلات البروتين وقياسات في الوقت الفعلي لنفاذية الغشاء، وذلك استناداً إلى استخدام LUVs تحتوي على صبغة متعددة الأنيونات (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) ومخمد كاتيوني (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. ومع زيادة نفاذية LUVs، ينتشر ANTS وDPX بعيداً عن بعضهما البعض، ويتم الكشف عن زيادة في الفلورة. ونصف هنا تركيبات بروتينات عائلة BCL-2 المأشوبة الشائعة الاستخدام وعناصر التحكم باستخدام LUVs التي تحتوي على ANTS/DPX.
البروتوكول
1. دمج الدهون وتكوين غشاء دهني
- بالعمل داخل خزانة استخلاص من الغازات (fume hood) مع إضاءة خافتة، يتم دمج الدهون المذابة في الكلوروفورم في قارورة زجاجية كهرمانية سعة 1.5 ml باستخدام حقنة زجاجية محكمة الغلق من نوع Hamilton مغسولة بالكلوروفورم. سينتج عن هذا الدمج ما يقرب من 4 mg من الدهون (الشكل 1A).
- Cardiolipin 10 mg/ml (CL) - 63 μl
- Phosphatidylcholine 10 mg/ml (PC) - 84 μl
- Phosphatidylethanoloamine 10 mg/ml (PE) - 125 μl
- Phosphatidylinositol 10 mg/ml (PI) - 59.5 μl
- Phosphatidylserine 10 mg/ml (PS) - 65 μl
- لإزالة الكلوروفورم، يتم توجيه تيار لطيف من غاز خامل (على سبيل المثال، النيتروجين أو الأرجون) داخل القارورة. سيصبح غشاء دهني مرئياً في قاع وجوانب القارورة عند الجفاف، وهو ما يستغرق عادةً من 2 إلى 3 ساعات (الشكل 1A).
2. تحضير محلول الليبوزوم
- في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.7 ml، قم بتحضير 500 μl من ANTS بتركيز 12.5 mM في محلول LUV المنظم (0.2 mM EDTA، و10 mM HEPES [pH 7]، و200 mM KCl، و5 mM MgCl2 ) و500 μl من DPX بتركيز 45 mM في محلول LUV المنظم (الشكل 1B).
- اخلط محاليل ANTS وDPX، ثم استخدم جهاز الرج الدوامي (vortex) لمدة 1 min، وعالج الخليط بالموجات فوق الصوتية لمدة 1 min في درجة حرارة الغرفة. يتم إجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية في حمام مائي فوق صوتي (على سبيل المثال، Branson 3510MTH، بدون إعدادات محددة، فقط وضع التشغيل 'on'). يضمن ذلك ذوبان المحاليل بالكامل وتجانسها.
- أضف محلول ANTS/DPX إلى الغشاء الدهني، وأغلق القارورة باستخدام ورق البارافيلم (الشكل 1B).
- عالج الغشاء الدهني بالموجات فوق الصوتية في الحمام المائي المذكور أعلاه لمدة 5 min. سيظهر المحلول بمظهر حليبي بعد المعالجة. تأكد من ذوبان الغشاء الدهني تماماً لأن التجمعات الدهنية الصغيرة ستؤثر سلباً على الخطوات التالية. كما يجب فحص جوانب القارورة وقاعها للتأكد من عدم وجود أي بقايا من الغشاء الدهني (الشكل 1B).
3. بثق وتنقية الليبوزومات
- قم بتجميع جهاز البثق وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة باستخدام محلول LUV buffer لترطيب دعامات المرشح وغشاء البولي كربونات. أحكم إغلاق غطاء الوحدة بحيث لا يحدث فقدان في الحجم أثناء عملية البثق، ولكن دون إفراط لتجنب تمزق الغشاء. ومن المستحسن أيضاً اختبار جهاز البثق باستخدام محلول LUV buffer للتأكد من عدم وجود تسريبات أو مشكلات.
- ابدأ بوضع محلول الدهون في السرنجة اليمنى، وقم ببثق محلول الدهون 31 مرة، وسوف يستقر محلول LUVs في السرنجة اليسرى؛ يضمن ذلك مرور جميع الدهون عبر الغشاء مرة واحدة على الأقل. قد تتطلب المرات القليلة الأولى ضغطاً أكبر قليلاً للمرور عبر الغشاء. إذا مر المحلول فجأة وبسرعة عبر الغشاء، فافحص الغشاء للتأكد من عدم تمزقه واستبدله إذا لزم الأمر (الشكل 1C).
- قم بتجهيز عمود تدفق بالجاذبية من نوع Sepharose S-500 بسعة 10 ml (1.0 cm x 20 cm، وحجم حبيبات 10 ml). اغسل العمود بـ 3 أحجام من محلول LUV buffer، واترك تدفق العمود حتى يتوقف، ثم أغلقه بالغطاء. وبما أن هذه الخطوة تستغرق بعض الوقت، يفضل البدء في الغسيل عندما يتم دمج الدهون لتجفيفها. فقط أبقِ العمود مغطى حتى تصبح مستعداً لاستخدامه.
- أضف HUVs المبثوقة إلى العمود في خطوة واحدة، وتجنب تعكير واجهة الحبيبات. اترك المحلول المنظم يتسرب من العمود حتى يتوقف التدفق، ثم قم بسد الفتحة. املأ العمود برفق باستخدام محلول LUV buffer. ومرة أخرى، توخ الحذر عند إضافة المحلول المنظم حتى لا تضطرب الحبيبات (الشكل 1C).
- أزل السدادة واجمع 6 أجزاء بحجم 1 ml لكل جزء. عادة ما تخرج LUVs في الجزأين 3 و4، ويمكن التعرف عليها من خلال المظهر العكر. بمجرد جمع الأجزاء، اغسل العمود بـ 5 أحجام من الماء، وحجمين من الإيثانول بتركيز 20%. خزن العمود عند درجة حرارة 4 °C (الشكل 1C).
- خزن الأجزاء عند درجة حرارة 4 °C في الظلام حتى يتم اختبارها.
4. اختبار كسور العمود
- يتم الآن اختبار كسور العمود للكشف عن الفلورية من خلال مقارنة محلول LUV المنظم ومحلول LUV المنظم المضاف إليه 0.5% CHAPS. الكسور التي تزداد فيها الفلورية نتيجة وجود CHAPS تحتوي على LUVs. انقل 100 μl من محلول LUV المنظم أو محلول LUV المنظم + 0.5% CHAPS إلى ستة آبار لكل منهما، وأضف 5 μl من الكسر المناسب، ثم اخلط المكونات. استخدم أطباقاً ذات 96 بئراً، تكون معتمة وسوداء وغير معالجة لجميع دراسات LUV (الشكل 1D).
- اقرأ الطبق عند درجة حرارة 37 °C وفقاً للمعايير التالية: طول موجة الإثارة: 355 nm؛ طول موجة الانبعاث: 520 nm؛ الكسب (الجهد): 125؛ موضع البصريات: Top؛ ارتفاع القراءة: 5.5 mm. هذا الإعداد مخصص لجهاز BioTek H1 Synergy باستخدام برنامج Gen 5 2.0 (الشكل 1D).
- تظهر الكسور 3 و 4 عموماً زيادة في الفلورية تتراوح من 5 إلى 10 أضعاف. وبمجرد تحليلها، ادمج الكسور التي تحتوي على LUV واحفظها عند درجة حرارة 4 °C في الظلام؛ حيث سيتم تنقية ما يقرب من 2 ml من ليبيدات بتركيز ~ 2 mM (الشكل 1D).
5. دراسات عائلة BCL-2 باستخدام الحويصلات أحادية الطبقة الكبيرة (LUVs)
- يتم اختبار بروتينات BCL-2 لقدرتها على تحفيز نفاذية الحويصلات أحادية الطبقة الكبيرة (LUV) بشكل مباشر، ولتنظيم نشاط هذه النفاذية. تُجرى مقايسات LUV عادةً في أحجام قدرها 100 μl، وعند درجة حرارة 37 °C، ويمكن تحليلها إما في نقطة زمنية واحدة بعد 30 - 60 دقيقة (الأشكال 2A-C، 3A-B)، أو عبر دراسات حركية كل 1 - 2 دقيقة لمدة تصل إلى ساعة واحدة (الشكل 2D). يتوفر تصميم تمثيلي للمقايسة يوضح المكونات، والتركيزات الأولية/النهائية، وترتيب الإضافة (الجدول 1). ويُنصح أيضاً بضبط قارئ الأطباق الدقيقة ليهز الطبق برفق قبل كل قراءة. غالباً ما تعطي الدقائق القليلة الأولى قراءات متفرقة (يرجح أن يكون ذلك بسبب تغيرات درجة الحرارة، أو الخلط، إلخ...)، لذا فإننا نعتمد عموماً نقاط البيانات بعد 2 - 3 قراءات في الدراسة الحركية. ومن غير الشائع أيضاً ظهور أشرطة خطأ كبيرة لبعض الظروف بسبب التباين في دفعات LUV، وكفاءة التفاعلات البروتينية عند تركيزات التنشيط أو التثبيط الحدية.
- يجب تخفيف مخزونات بروتينات عائلة BCL-2 في محلول LUV المنظم بتركيز 100x، ويتم إجراء عمليات المعايرة اللازمة لبروتينات BAX وBID وجميع البروتينات الأخرى لإيجاد أدنى التركيزات الضرورية للكشف عن الحد الأدنى من نفاذية LUV المعتمدة على BAX في غياب BID، والتآزر الملحوظ بين BAX وBID. علاوة على ذلك، تتطلب جميع البروتينات الأخرى عمليات معايرة لتقليل هدر البروتين، وتقليل تركيزات إضافات البروتينات اللاحقة.
6. النتائج التمثيلية
توجد خيارات عديدة لمراقبة وفحص التنظيم المعتمد على عائلة BCL-2 لنفاذية الحويصلات أحادية الطبقة الكبيرة (LUV). ولإنشاء ضابط موجب لنفاذية LUV، نستخدم BAX المنشط بالمنظفات12. حيث يقوم المنظف، n-octyl-β-D-glucoside (OG)، بتحفيز تنشيط BAX اصطناعياً (لتحضير 100 μl من OG-BAX بتركيز 2.3 μM: نخلط 5 μg من BAX + 0.7% من OG في منظم LUV، ثم يتم التحضين لمدة 60 min عند 4 °C، ثم تقسيم المحلول إلى حصص وتخزينه عند -80 °C)، وبالتالي يمكن استخدام OG-BAX (بتركيز 10 - 100 nM) كضابط موجب موثوق. ومن الجدير بالذكر أن تركيزات OG التي تقل عن 0.025% لا تؤثر بشكل مباشر على نفاذية LUV. وتُستخدم المعالجة بـ 0.5% CHAPS لتحديد الحد الأقصى لفلورية LUV لكل مقايسة، وتعتبر هذه القيمة هي قيمة الـ 100%. يجب إعداد جميع المعالجات في ثلاث مكررات. ويظهر مثال على إعداد مقايسة ضابط LUV في Table 1، بينما تُعرض البيانات المقابلة في Figure 2A.
تعد عملية تحديد تركيزات BAX وBID لتعزيز التحرر الأمثل نقطة بداية ضرورية لدراسة نفاذية الحويصلات أحادية الغشاء كبيرة الحجم (LUV) باستخدام بروتينات عائلة BCL-2. ونظراً لأن تحضيرات البروتينات الفردية ستظهر أنشطة نفاذية خلفية مختلفة، فمن المستحسن إجراء معايرة قبل إعداد تحليلات أكثر تعقيداً. ويجب معايرة BAX (بتركيز 50 - 200 نانومولار) وBID (بتركيز 0 - 10 نانومولار) لضمان الحد الأدنى من التحرر الخلفي وتحقيق التآزر الأمثل، كما هو موضح في الشكلان 2B-C، على التوالي. يمكن شراء أشكال مختلفة من بروتين BID من شركة R&من شركة D Systems؛ وبدلاً من ذلك، يتوفر ببتيد نطاق BH3 الخاص ببروتين BID من شركة Anaspec. لا يوجد شكل تجاري من بروتين BAX يكون مناسباً لمقاييس الحويصلات أحادية الطبقة الكبيرة (LUV)، لذا يجب التعبير عنه وتنقيته باستخدام الطرق المنشورة.3,13.
بمجرد تحديد تركيزات BAX و BID والتآزر بينهما، يكون من المقايسات الشائعة تحديد تأثير البروتينات المضادة لموت الخلايا المبرمج على نفاذية LUV المعتمدة على BAX و BID. يُعد BCL-xL عضواً من عائلة BCL-2 المضادة لموت الخلايا المبرمج والمتوفر تجارياً، وهو يثبط نشاط BAX و BID بطريقة تعتمد على الجرعة، وعادة ما يكون ذلك في نطاق زيادة مولارية تتراوح بين 5 إلى 10 أضعاف كمية BAX أو BID (الشكل 3A). يمكن عكس هذا التأثير المثبط عن طريق إضافة بروتينات BH3-only لاحقة (زيادة مولارية بمقدار 2 إلى 5 أضعاف بالنسبة لـ BCL-xL) أو ببتيدات نطاق BH3 (زيادة مولارية بمقدار 5 إلى 10 أضعاف بالنسبة لـ BCL-xL)، والتي ترتبط بـ BCL-xL، مما يسمح لـ BAX و BID بالتآزر وزيادة نفاذية LUVs (الشكل 3B). في الشكل 3B، نعرض تأثير PUMAβ البشري المؤتلف كامل الطول، كما أن ببتيد نطاق PUMA BH3 مشابه وظيفياً (البيانات غير معروضة)8. يُشار إلى هذه التجربة عادةً باسم "مقايسة إزالة الكبح"، حيث يقوم بروتين PUMA بإزالة التأثير المثبط لـ BCL-xL على BAX و BID. من الناحية المثالية، يجب أن يكون لإضافة بروتين/ببتيد BH3-only المزيل للكبح الحد الأدنى من التأثيرات على تنشيط BAX14.
الشكل 1. (A) تُدمج الدهون المذابة في الكلوروفورم، ثم تُجفف لتكوين غشاء دهني، ويُغلق الوعاء. (B) يتم تحضير محاليل ANTS و DPX، ودمجها، ثم تعريضها للموجات فوق الصوتية لضمان الذوبان والتماجن الكاملين. يُضاف المحلول إلى الغشاء الدهني، ويُغلق الوعاء بـ parafilm، ثم يُعرض للموجات فوق الصوتية لمدة 5 min في حمام مائي. سيظهر المحلول الآن بمظهر حليبي. (C) يتم تحميل محلول الدهون المعالج بالموجات فوق الصوتية في جهاز البثق الصغير (mini-extruder)، ويُعالج 31 مرة، ثم يُضاف إلى عمود Sepharose S-500 مُحضّر للتنقية اللاحقة. (D)تُحلل القطفات التي تم الحصول عليها بعد كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي عن طريق مقارنة وحدات الفلورة النسبية (RFUs) في محلول LUV buffer و LUV buffer + 0.5% CHAPS. تشير قراءة "LUV buffer" إلى الفلورة الخلفية مع وجود LUVs سليمة؛ بينما ستظهر حالة "LUV buffer + 0.5% CHAPS" زيادة في الفلورة ناتجة عن التحلل، مما يشير إلى وجود LUVs. تحتوي القطفتان 3 و 4 عادةً على LUVs، ويتم دمجهما بعد التحليل. بينما تحتوي القطفتان 5 و 6 على ANTS غير المدمج (أي ليس داخل LUVs بعد عملية البثق)، والتي تظهر فلورة عالية بشكل مستقل عن CHAPS. انقر هنا لعرض شكل أكبر.
الشكل 2. تجارب ضابطة لعائلة BCL-2 ومعايرات BAX/BID باستخدام LUVs. (A) تجارب ضابطة. عولجت LUVs بمحلول LUV المنظم وحده، أو 0.025% octylglucoside "OG"، أو 50 nM BAX، أو 50 nM OG-BAX. حُضنت LUVs لمدة 60 min عند 37 °C. يتم تحديد نسبة (%) النفاذية عن طريق طرح الفلورة في معاملة المحلول المنظم من جميع العينات، وتحدد النفاذية بنسبة 100% بواسطة عينة مُذابة بـ 0.5% CHAPS؛ تُقسم القيم التجريبية على قيمة CHAPS للحصول على % نفاذية LUV. يُعد OG-BAX هو BAX المنشط بالمنظف، والذي يمثل ضابطاً موجباً موثوقاً لنفاذية LUV. (B) تحديد تركيز BAX الأمثل. عولجت LUVs بتركيزات متزايدة من BAX (50 - 200 nM) بوجود 10 nM C8-BID "BID"، أو المحلول المنظم وحده. (C) تحديد تركيز BID الأمثل. عولجت LUVs بتركيزات متزايدة من BID (0 - 10 nM) بوجود 100 nM BAX. (D) مثال لمجموعة بيانات حركية نفاذية LUV. عولجت LUVs بـ BAX (100 nM) ± BID (10 nM). أُجريت القراءات كل دقيقتين لمدة 30 min، مع رج خفيف للطبق لمدة ثانيتين قبل كل قراءة. لم تُدرج القراءات الثلاث الأولى (0، 2، و 4 min) في الرسم البياني. حُددت الحد الأدنى والأقصى لوحدات الفلورة النسبية (RFU) كما هو موضح في القسم 4.3. تمثل أشرطة الخطأ في الأشكال 2A-C الانحراف المعياري من بيانات ثلاثية المكررات. تمثل البيانات في 2D مقايسة ثنائية المكررات.
الشكل 3. أمثلة على تفاعلات عائلة BCL-2 الشائعة التي تم استكشافها باستخدام LUVs. (A) يتم تثبيط نفاذية LUV التي يتوسطها BAX و BID بواسطة BCL-xL. تم تحضين LUVs مع 100 nM من BAX، و 10 nM من BID، وتركيزات متزايدة من BCL-xL (0 - 500 nM). تم تحضين LUVs لمدة 60 min عند 37 °C. (B) يقوم PUMA بإزالة كبت BCL-xL لتعزيز وظيفة BAX و BID. تم تحضين LUVs مع مجموعات من 100 nM من BAX، و 10 nM من BID، و 500 nM من BCL-xL، و (0 - 2.5 μM) من PUMA لمدة 60 min عند 37 °C. تم استخدام PUMA بتركيز 2.5 μM مع BAX وحده. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري من بيانات مكررة ثلاث مرات.
| ترتيب الإضافة: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| الشروط | حويصلات أحادية الطبقة كبيرة الحجم المحلول المنظم | مجموعة الجينات (Orthologous Group) (0.7%) | BAX (2.3 μM) | OG-BAX (2.3 μM) | CHAPS (10%) | الحويصلات أحادية الطبقة الكبيرة (LUVs) (2 ملي مولار) | الإجمالي |
| محلول منظم | 95 μl | 5 μl | 100 μl | ||||
| OG (0.015%) | 92.83 μl | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| BAX (50 نانومولار) | 92.83 μl | - | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | ||
| OG-BAX (50 نانومولار) | 92.83 μl | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| CHAPS (0.5%) | 90 μl | 5 μl | 5 μl | 100 μl |
الجدول 1. مثال لمقايسة ضابطة لتحديد تأثير OG-BAX على نفاذية LUV.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تتيح الطريقة الموصوفة لإنتاج الحويصلات أحادية الطبقة الكبيرة (LUVs) وسيلة سريعة وفعالة لاختبار وظائف البروتينات والببتيدات المختلفة من عائلة BCL-2 والكواشف ذات الصلة في بيئة غشائية محددة كيميائياً حيوياً وتشبه الغشاء الخارجي للميتوكوندريا (OMM). وفي حال استخدام قيم نقطة النهاية لتحديد نفاذية LUV، يمكن تجهيز عدة أطباق لتحليل مئات الظروف خلال يوم واحد. وقد وجدنا أن الكواشف المحددة في هذه المقايسات غالباً ما تكون جودة وكمية البروتينات المعاد تركيبها، لذا فإن تخصيص الوقت والموارد الكافية لتنقية البروتين سيسهم في الحصول على ن...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نود أن نشكر جميع أعضاء مختبر Chipuk على زمالتهم ودعمهم. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نعرب عن تقديرنا لـ Tomomi Kuwana و Donald Newmeyer لتطويرهما الأساس التجريبي لهذا العمل. تم دعم هذا العمل من خلال: NIH CA157740 (إلى J.E.C.)، ومشروع تجريبي من NIH P20AA017067 (إلى J.E.C.). كما تم دعم هذا العمل جزئياً بواسطة منحة بحثية رقم 5-FY11-74 من مؤسسة March of Dimes (إلى J.E.C.).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE" | Avanti | 850725C | |
| L-α-Phosphatidylcholine (Egg, Chicken) "PC" | Avanti | 840051C | |
| L-α-Phosphatidylinositol (Liver, Bovine) "PI" | Avanti | 840042C | |
| L-α-Phosphatidylserine (Brain, Porcine) "PS" | Avanti | 8400320 | |
| Cardiolipin (Heart, Bovine - Sodium Salt) "CL" | Avanti | 840012C | |
| طقم جهاز البثق المصغر (Mini-extruder set) | Avanti | 610023 | |
| غشاء PC بمسامية 0.2 µm | Avanti | 610006 | |
| طبق Costar أسود ذو 96 بئراً | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| بروتين BID البشري المشفور بواسطة Caspase-8 | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| بروتين BCL-xL البشري (بدون الطرف الكربوكسيلي) | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| ببتيدات نطاق BH3 لبروتينات BID/PUMA | Anaspec | 61711/62404 | |
| قارئ الأطباق الدقيقة الهجين متعدد الأنماط Synergy H1 | BioTek | None |
المراجع
- Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell. 121, 671-674 (2005).
- Gavathiotis, E. BAX activation is initiated at a novel interaction site. Nature. 455, 1076-1081 (2008).
- Dewson, G. To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions. Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).
- Dewson, G. Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices. Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).
- Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX. Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).
- Kuwana, T. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).
- Chipuk, J. E. Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).
- Letai, A. Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics. Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).
- Kuwana, T. lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. Cell. 111, 331-342 (2002).
- Lovell, J. F. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
- Hsu, Y. T., Youle, R. J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family. J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).
- Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization. Cell. 103, 645-654 (2000).
- Du, H. BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak. J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
