رصد النسخ المتماثل البلازميد في خلايا الثدييات يعيش أكثر من أجيال متعددة من مضان المجهري

Summary

يوصف أسلوب للمراقبة الفردية جزيئات الحمض النووي في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع أمريكا اللاتينية والكاريبي لتصميم مواقع الربط DNA في المصالح. ويمكن تكييف هذه الطريقة لمتابعة السلطات الوطنية المعينة المؤتلف كثيرة في الخلايا الحية على مر الزمن.

Abstract

يتم الاحتفاظ بعض البلازميدات طبيعيا في خلايا الثدييات. ومن بين هذه العوامل الوراثية من الهربس غاما، بما في ذلك فيروس ابشتاين بار (EBV) وكابوزي الورم اللحمي المرتبطة هربس (KSHV)، والتي تتسبب الأورام الخبيثة الإنسان متعددة ^1-3. يتم نسخ هذه الجينوم الاثنين بطريقة المرخصة، كل باستخدام بروتين واحد الفيروسية والخلوية آلات النسخ المتماثل، وتم تمريرها إلى الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية على الرغم من القسيم التقليدية التي تفتقر إلى ^4-8.

وقد تم ذلك الكثير من العمل لتوصيف مكررات هذه الجينوم البلازميد باستخدام أساليب مثل النشاف الجنوبية ومضان التهجين في الموقع (FISH). وتقتصر هذه الأساليب، وإن كان. PCR الكمي والبقع جنوب تقديم معلومات عن متوسط ​​عدد البلازميدات في الخلية في عدد السكان من الخلايا. FISH هو فحص وحيدة الخلية التي تكشف كل من متوسط ​​عدد وتوزيع بلازميد ق في خلية في عدد السكان من الخلايا ولكنها ثابتة، مما يتيح أي معلومات عن الوالد أو سلالة الخلية فحصها.

هنا، نحن تصف طريقة لتصور البلازميدات في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع اللاكتوز إلى مواقع متعددة في البلازميد من الفائدة ^9. تم تصميم الحمض النووي التي تهم تشمل يكرر جنبا إلى جنب نحو 250 من المشغل اللاكتوز (LACO) التسلسل. لا بد من البروتين على وجه التحديد LACO وقامع اللاكتوز (اسي)، والتي يمكن أن تنصهر فيها بروتين فلوري. يمكن إما الانصهار البروتين يمكن التعبير عنها من البلازميد هندسيا أو عرضه ناقل فيروسات. وبهذه الطريقة، يتم تمييزها جزيئات DNA fluorescently وبالتالي تصبح مرئية عبر المجهر مضان. يتم حظر البروتين الانصهار من ربط DNA البلازميد من قبل خلايا زراعة في وجود البلازميدات IPTG حتى على استعداد ليتم عرضه. ontent "> ويتيح هذا النظام ليتم رصدها على البلازميدات في الخلايا الحية من خلال عدة أجيال، وكشف عن خصائص التركيب والتقسيم إلى الخلايا الوليدة. خلايا مثالية هي ملتصقة، تقاس بسهولة، ولها نواة كبيرة. وقد استخدم هذه التقنية لتحديد ما وقد تم تجميع 84٪ من EBV المستمدة من البلازميدات كل جيل و 88٪ من قسم البلازميدات تصنيعه حديثا بإخلاص إلى الخلايا الوليدة في خلايا هيلا. شوهدت أزواج من هذه البلازميدات EBV أن المربوطة أو المرتبطة الكروماتيدات الشقيقة بعد التوليف في S- المرحلة كان ينظر إليها حتى لفصل الكروماتيدات الشقيقة كما فصل في طور الصعود ⁽¹⁰⁾ وحاليا تستخدم هذه الطريقة لدراسة الجينوم تكرار KSHV في خلايا هيلا وخلايا SLK. خلايا هيلا وخلد الخلايا الظهارية البشرية، وخلد الخلايا البطانية SLK الإنسان الخلايا. لو كانت مستمدة في الأصل من الخلايا SLK آفة KSHV، لا هيلا ولا SLK خط خلية حرب بشكل طبيعيORS الجينوم KSHV ^11. بالإضافة إلى دراسة تكاثر الفيروس، ويمكن استخدام هذه التقنية التصور للتحقيق في الآثار المترتبة على إضافة وإزالة، أو تحور مختلف عناصر تسلسل الحمض النووي على التوليف، التعريب، وتقسيم للسلطات الوطنية المعينة الأخرى البلازميد المؤتلف.

Protocol

1. هندسة الخلايا مع البلازميدات المرئية

1. استخدام معيار الهضم تقييد أو إعادة التركيب مثلي التقنيات لتقديم جزء DNA التي تحتوي على ما يقرب من 250 نسخة من تسلسل المشغل اللاكتوز (LACO) في البلازميد أن تصور. كان لدينا البلازميد BACmid من حوالي 170 KBP والواردة الجينوم بأكمله من الفيروسات الهربس كابوزي الورم اللحمي المرتبطة (KSHV) والمقاومة مرمزة لهيغروميسين ^12.
2. إدخال LACO DNA التي تحتوي على البلازميد إلى خلايا الثدييات من ترنسفكأيشن مع Lipofectamine 2000. تقاس نحن هيلا وSLK الخلايا في ....

Results

وتظهر التوقعات الحد الأقصى لكثافة Z-مداخن المكتسبة في تجربة تمثيلية في الشكل 3. إشارات البلازميد نموذجية موجودة في 3-8 شرائح من Z-المكدس، اعتمادا على ما إذا كانت تمثل واحدة أو مجموعة من البلازميدات. في حالة EBV والبلازميدات KSHV المشتقة، وإشارات تتحرك ببطء داخل الخلية حتى تصل إلى الخلية الانقسام. ترحيل الخلايا نفسها على مدار التجربة. تصبح أيضا كروية وفصل من طبق خلال الانقسام. دورة الخلية لخلايا هيلا وSLK صحية تأخذ ما يقرب من 24 ساعة، وينبغي أن تعتبر هذه الأنواع من.......

Discussion

ويمكن استخدام الطريقة الموضحة هنا لمتابعة البلازميدات في خلايا الثدييات الحية على مر الزمن والتي تمتد أجيال متعددة. عن طريق الحد من التعرض للضوء الإثارة، وقد استخدمنا هذه التقنيات لمتابعة الخلايا من أزواج حديثا من خلال تقسيم المستعمرات من 16-32 الخلايا، التي تمثل ما لا يقل عن 72 ساعة وانقسامات الخلية 3. هذه التجارب تقديم معلومات لا يمكن الحصول عليها من المقايسات ثابت مثل PCR الكمي، جنوب النشاف، والأسماك.

لا بد من.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
DMEM	GIBCO	11965
OptiMEM	GIBCO	31985
المصل البقري الجنين	Hyclone	SH30910.03
بنسلين	سيجما	P3032
الستربتوميسين كبريتات	سيجما	S9137
هيغروميسين	Calbiochem	400050	400 ميكروغرام / مل لSLK؛ 300 ميكروغرام / مل لهيلا
الآيزوبروبيل-BD-thiogalactoside (IPTG)	روش	10 724 815 001	تركيز النهائي 200 ميكروغرام / مل
Lipofectamine 2000	إينفيتروجن	11668-027
HEPES	GIBCO	15630
الزجاج القاع الأطباق	ماتيك	P35G-1.5-10-C
CultFoil	Pecon	000000-1116-08
Axiovert 200M	زايس
COLIBRI	زايس	423052-9500-000
محايد أبيض LED	زايس	423052-9120-000
تصفية 75 م مكعب	زايس	489075-0000-000
خطة لامزيغ-63x/1.4 الهدف	زايس	440762-9904-000
CascadeII: 1024 EMCCD الكاميرا	Photometrics	B10C892007
Tempcontrol صغيرة	زايس / Pecon	000000-1116-070
Tempcontrol 37-2 الرقمية	زايس / Pecon	000000-1052-320
المراقب CTI 3700 الرقمية	زايس / Pecon	411856-9903
الهدف سخان	زايس / Pecon	440760-0000-000
مرحلة التسخين إدراج P	زايس / Pecon	411861-9901-000
مرحلة أعلى حاضنة S	زايس / Pecon	411860-9902-000
المرطب النظام	زايس / Pecon	000000-1116-065