عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

ملخص

وصفنا عزل الخلايا الأولية السريع للنوع الثاني الفئران السنخية الظهارية (وادي) عن طريق الانتقاء السلبي تدفق cytometric. هذه تظهر قابلية عالية وادي والنقاء ومناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات الفنية والجزيئية بشأن دورها في أمراض الجهاز التنفسي مثل أمراض المناعة الذاتية أو المعدية.

الملخص

على مر السنين الماضية، مساهمة الخلايا السنخية نوع II الظهارية (وادي) لمختلف جوانب تنظيم المناعة في الرئة باعتراف متزايد. وقد ثبت للمشاركة في وادي إنتاج السيتوكينات في القصبات الهوائية الملتهبة والعمل حتى مع مستضد تقديم الخلايا في كل من العدوى والمناعة الذاتية خلايا T بوساطة ^1-8. ولذلك، فهي مثيرة للاهتمام لا سيما أيضا في سياقات السريرية مثل التفاعل المفرط لمجرى الهواء والأجنبية المستضدات الذاتية وكذلك الإصابات التي تستهدف مباشرة أو غير مباشرة وادي. ومع ذلك، فإن فهمنا لوظائف المناعية مفصلة خدم وفقا لنوع الخلايا السنخية II الظهارية في رئة سليمة وكذلك في التهاب يبقى مجزأ. يتم تنفيذ العديد من الدراسات المتعلقة باستخدام الماوس وادي ظيفة أو السنخية الإنسان خطوط الخلايا الظهارية ^9-12. العمل مع خطوط الخلايا يوفر بالتأكيد مجموعة من المزايا، مثل توافر أعداد كبيرة سو خلايا لتحاليل واسعة النطاق. ومع ذلك، فإننا نعتقد أن استخدام الفئران وادي الابتدائية يسمح فهم أفضل لدور هذه نوع من الخلايا في العمليات المعقدة مثل العدوى أو التهاب المناعة الذاتية. يمكن عزل وادي الفئران الأولية مباشرة من الحيوانات تعاني من أمراض الجهاز التنفسي مثل هذه، وهذا يعني أنها كانت تخضع لعوامل خارجي إضافية عن لعب دور في الإعداد تحليلها. وعلى سبيل المثال، يمكن عزل وادي قابلة للحياة من الفئران المصابة بفيروس A الأنف الأنفلونزا، الذي يستهدف في المقام الأول هذه الخلايا للنسخ المتماثل ^13. الأهم من ذلك، من خلال عدوى فيفو السابقين من وادي معزولة عن الفئران السليمة، ويمكن للدراسات التي شنت على الاستجابات الخلوية العدوى مزيد الموسعة.

ويستند لدينا بروتوكول لعزل وادي الفئران في المقام الأول على الهضم الأنزيمي في الرئة الماوس تليها وصفها لتعليق الخلية الناتج مع الاجسام المضادة المحددة لCD11c، CD11b، F4/80،CD19، CD45 وCD16/CD32. ثم يتم تحديد وادي حبيبي ومبعثر وغير المسماة sideward عالية (SSC ^عالية) السكان الخلية والخلية تكون مفصولة المنشط مضان الفرز ^3.

بالمقارنة مع طرق بديلة لعزل الخلايا الظهارية الأولية من الرئتين الماوس، لدينا لعزل بروتوكول تدفق cytometric من وادي ينتج عن طريق الانتقاء السلبي لم يمسها، وادي قابلة للحياة عالية ونقية في وقت قصير نسبيا. بالإضافة إلى ذلك، وعلى النقيض من الاساليب التقليدية في العزلة من قبل بالغسل واستنزاف الخلايا الليمفاوية عن طريق ربط الأجسام المضادة من جانب الخرز المغناطيسي ^{14 و 15،} وتدفق الخلايا cytometric الفرز يسمح التمييز عن طريق حجم الخلية ومستوى. بالنظر إلى أن الأجهزة للفرز تدفق خلية cytometric متاح، يمكن تطبيق الإجراءات الموصوفة بتكاليف منخفضة نسبيا. بجوار الأجسام المضادة والأنزيمات القياسية للتفكك الرئة، لا الكواشف إضافية مثل المغناطيسيةويلزم الخرز. الخلايا المعزولة هي مناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات الفنية والجزيئية، والتي تشمل المختبر في الثقافة والمقايسات تحفيز خلايا T وكذلك transcriptome، بروتيوم أو تحليلات secretome ^{3 و 4.}

البروتوكول

وترد التفاصيل المتعلقة الكواشف والمواد المطلوبة في الجدول في نهاية البروتوكول أدناه. قبل البدء في العمل، وإعداد أنابيب مل 15 (واحد في الماوس) تحتوي على 4 مل من dispase وقبل الدافئ لهم إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. في كتلة التدفئة، تدفئة قريبا مأخوذة صغيرة من 1٪ منخفضة تذوب الاغاروز (في الماء) إلى 95 ° C حتى المسال وبارد في وقت لاحق إلى C ° 45 حتى الاستخدام.

1. إعداد الرئة ماوس

1. التضحية الماوس خنقا ₂ CO. ملاحظة: لا تنفيذ خلع عنق الرحم حيث سيؤدي ذلك إلى إصابة ا....

النتائج

عندما يكون الترتيب تعليق خلية الرئة معزولة عن الفئران السليمة، وبوابة وادي تمثل عادة لحوالي 42 ± 10٪ من كافة الأحداث. وهذا يمكن أن يكون أقل بشكل ملحوظ نسبة عند استخدام الفئران مع أمراض الجهاز التنفسي مثل التهاب فيروسي، ووقف الخلية الأولي سوف تحتوي على نسبة أعلى بكثير من الخلايا الليمفاوية والخلايا المناعية الأخرى لتجنيد الشعب الهوائية. لوادي معزولة عن الرئتين IAV المصابة في اليوم 3 بعد الإصابة لاحظنا انخفاض وتيرة الخلايا في وادي بوابة بنحو 50٪.

المناقشة

بروتوكول لدينا لعزل وادي الفئران بواسطة التدفق الخلوي يوفر وسيلة سريعة للوصول الخلايا الأولية من الرئة الماوس لمجموعة كاملة من الدراسات الفنية والجزيئية. وصف الإجراء ينتج السكان للغاية وقابلة للحياة نقية من وادي التي هي كافية في عدد لاحق لتحاليل مباشرة، مثل العزلة RNA (انظر الشكل 2B) والدراسات transcriptome. للتطبيقات وظيفية، فمن الممكن أيضا أن الخلايا المعزولة الثقافة، مما يسمح على سبيل المثال توليد المتوسطة وادي مكيفة أو شارك في التجارب الثقافة. بوصفه ا.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
قنية الساكن Introcan 22G	براون	REF 4252098B
Dispase، 100 مل (5000 caseinolytic وحدات)	BD العلوم البيولوجية	354235	قسامة إلى 4 مل في أنابيب مل 15، مخزن في -20 ° C
Biozym البلاك الاغاروز	Biozym	840101	1 واط٪ / V 2 O H في
I ديوكسي ريبونيوكلياز من البنكرياس البقري، 2000 وحدة Kunitz / فيال	سيغما الدريخ	D4263	حل طازجة المحتوى من 1 فيال في 300 ميكرولتر DMEM
DMEM	Gibco	22320-022	تستخدم على النحو المنصوص عليه من قبل الشركة المصنعة (G منخفضةlucose، بيروفات، HEPES)
مصافى الخلية (100 ميكرومتر و 75 ميكرومتر)	BD الصقر	352360، 352350
شبكة النايلون (48 ميكرون، 30 ميكرون)	Bückmann شركة محدودة	03-48/26-1020، 03-30/18-108
CellTrics مرشح ميكرون 50	بارتك Partec	04-0042-2317
مكافحة الماوس CD16/CD32	BioLegend	101302	استنساخ 93؛ المطهرون
مكافحة الماوس F4/80	BioLegend	123116	استنساخ BM8؛ APC يقترن
مكافحة الماوس CD11b	BioLegend	101208	استنساخ M1/70؛ PE يقترن
مكافحة الماوس CD11c	BioLegend	117310	استنساخ N418؛ APC يقترن
مكافحة الماوسCD45	BioLegend	103102	استنساخ 30-F11؛ المطهرون
مكافحة CD19 الماوس	eBioscience	12-0193-83	eBio 1D3؛ PE يقترن
بولكلونل الماعز المضادة للمفتش الفئران	BD Pharmingen	550767	بولكلونل، PE يقترن
			ويمكن استخدام الأجسام المضادة بالإضافة إلى fluorochromes بديلة، اعتمادا على قياس التدفق الخلوي والليزر المتاحة.