يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

12.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4450

⸱

نوفمبر 20, 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Jackson Laboratory

في هذه المقالة

ملخص

من علامات المجالات خارج الخلية من مستقبلات الغشاء مع pHluorin superecliptic، والتصوير هذه المستقبلات في الخلايا العصبية الماوس الانصهار مثقف، يمكننا تصور الأحداث مباشرة الفردية الإدراج حويصلي في المستقبلات إلى غشاء البلازما. هذه التقنية سوف يكون مفيدا في توضيح الآليات الجزيئية التي تحكم الإدراج مستقبلات للغشاء البلازما.

الملخص

A فهم أفضل للآليات التي تحكم الاتجار مستقبلات بين غشاء البلازما (PM) ومقصورات داخل الخلايا يتطلب المنهج التجريبي مع ممتازة الدقة المكانية والزمانية. وعلاوة على ذلك، يجب أن هذا النهج أيضا لديها القدرة على التمييز المستقبلات المترجمة على PM عن تلك الموجودة في حجرات داخل الخلايا. الأهم من ذلك، كشف المستقبلات في حويصلة واحدة يتطلب المعلقة حساسية الكشف، لأن كل حويصلة يحمل سوى عدد قليل من المستقبلات. نهج قياسية لدراسة الاتجار مستقبلات تشمل biotinylation سطح تليها الكشف الكيمياء الحيوية، والتي تفتقر إلى كل القرارات اللازمة المكانية والزمانية، ومضان المجهري الفحص من المستقبلات السطحية immunolabeled، الأمر الذي يتطلب التثبيت الكيميائي للخلايا وبالتالي تفتقر إلى القرار الزمنية الكافية 1-6. للتغلب على هذه القيود، وضعنا وغيرهم وتوظيف سترا جديدةtegy أن تمكن من التصور الدينامي للمستقبلات الإدراج في قرارات PM مع ممتازة المكانية والزمانية 7-17. يشمل النهج علامات من GFP درجة الحموضة حساسة، وpHluorin superecliptic 18، إلى المجال N-محطة خارج الخلية من المستقبلات. Superecliptic pHluorin له خاصية فريدة من كونها الفلورسنت في الرقم الهيدروجيني محايدة وغير الفلورسنت، في الرقم الهيدروجيني الحمضية (الرقم الهيدروجيني <6.0). ولذلك، فإن مستقبلات المفتاحية هي غير الفلورسنت عندما الحمضية داخل التجويف من الحويصلات الاتجار داخل الخلايا أو الأجزاء endosomal، وتصبح بسهولة تصور فقط عندما تتعرض للبيئة محايد الرقم الهيدروجيني خارج الخلية، على السطح الخارجي للPM. استراتيجيتنا يسمح بالتالي لنا أن نميز بين مستقبلات سطح PM من داخل تلك الحويصلات الاتجار داخل الخلايا. لتحقيق ما يكفي من القرارات المكانية والزمانية، وكذلك الحساسية اللازمة لدراسة الاتجار ديناميكية من المستقبلات، قمنا بتوظيف الداخلية تعكس إجماليأيون المجهر الفلورسنت (TIRFM)، والتي مكنتنا من تحقيق القرار الأمثل المكاني للتصوير الضوئي (~ 170 نانومتر)، والقرار الزمني للفيديو معدل المجهري (30 إطارات / ثانية)، وحساسية للكشف عن مضان GFP من واحد جزيء. عن طريق التصوير pHluorin الموسومة تحت المستقبلات TIRFM، كنا قادرين على تصور الأحداث مباشرة الفردية الإدراج في مستقبلات الخلايا العصبية مثقف PM في. يمكن أن يحتمل هذا النهج التصوير تطبيقها على أي بروتين الغشاء مع مجال خارج الخلية التي يمكن أن يكون المسمى مع pHluorin superecliptic، وسوف تسمح تشريح آليات مفصلة الرئيسية التي تحكم الإدراج من البروتينات الغشاء مختلفة (المستقبلات، وقنوات أيون، نقل، الخ) ل وPM.

البروتوكول

1. إعداد الماوس الثقافة الدبقية لتكييف ثقافة العصبية

  1. والمغلفة T75 القوارير مع الحل الكولاجين (1:3 التخفيف من Purecol في DDH 2 O). يتم تعيين قوارير تستقيم وتترك لتجف ليلة وضحاها في نسيج الثقافة هود.
  2. تشريح العازلة (ACSF: 119 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 30 مم سكر العنب، HEPES 25 مم، ودرجة الحموضة 7.4، دون الكالسيوم) وسائل الإعلام الدبقية (DMEM تستكمل مع FBS 10٪، ووحدات 10 / البنسلين مل، 10 يتم إعداد ميكروغرام / مل الستربتوميسين، وGlutamax) وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
  3. في يوم الثقافة الدبقية، وتحسنت وسائل الإعلام الدبقية لمدة لا تقل 30 دقيقة في حمام مائي 37 ° C تشريح أدمغة قبل الماوس. يصرح باستخدامها في الفئران الجنينية أو بقطع الرأس حديثي الولادة السريعة. واللحاء الدماغي من تشريح تحت المجهر تشريح.
  4. يتم هضمها تشريح أنسجة المخ في حل غراء (100 مل و 20 ميكرولتر غراء 1٪ الدناز I في 2 مل العازلة تشريح) في 37 ° C FOص 20 دقيقة.
  5. بعد الهضم غراء، وتشطف أنسجة المخ مع 10 مل وسائل الاعلام قبل تحسنت الخلايا الدبقية. ثم يتم إضافة وسائل الإعلام الدبقية الطازجة (2 مل) إلى أنسجة المخ هضمها، وtriturated الأنسجة مع ماصة باستور النار مصقول الزجاج.
  6. يضاف سائل الإعلام الدبقية الطازجة (8 مل) إلى الأنسجة فصلها. ويستخدم 70 ميكرومتر مصفاة الخلية لتصفية التعليق الأنسجة فصلها. والمصنف ثم الخلايا في قوارير T75 (عادة 2-3 الأجنة يمكن البذور من قارورة T75)، ووضع في 37 ° C الخلية الحاضنة الثقافة.
  7. في اليوم التالي، ويستنشق وسائل الإعلام من قوارير T75. وشطف القوارير مع PBS مل 10. ثم يتم إضافة وسائل الإعلام الدبقية الطازجة (10-15 مل) إلى كل القارورة.
  8. في غضون 10-12 يوما، ينبغي الدبقية في قوارير T75 تكون متموجة. وتشطف الخلايا الدبقية مع PBS، ويضاف 5 مل من التربسين 0.05٪ لكل قارورة T75.
  9. بعد مرور فترة الحضانة التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والخلايا الدبقية هي تقسيم الخلايا الدبقية وفصلها عن بعضها قارورة T75 إلى قسمينالكولاجين مختلفة المغلفة T75 القوارير.
  10. وتعد إدراج الثقافة (ميليبور PICM03050) عن طريق وضعها في لوحات 6 حسنا، طلاء لهم الكولاجين، وتجفيف الهواء بين عشية وضحاها. يتم وضع وسائل الإعلام الدبقية (2 مل لكل منهما) تحت كل إدراج الثقافة.
  11. وtrypsinized الدبقية من قوارير T75 متكدسة والمصنف على وإدراج الثقافة (واحد T75 قارورة في لوحة 6 جيدا، 2 مل كل إدراج). وسوف تستخدم هذه الثقافة الدبقية لإدراج شرط الثقافات العصبية.

2. العصبية الثقافة

  1. يتم تنظيف الزجاج coverslips للثقافة العصبية عن طريق نقع في 70٪ على الأقل HNO 3 ليلة وضحاها. ثم تغسل مع Coverslips 2 مرات على الأقل DDH 3 O، وتجفف في فرن Isotemp (> 200 ° C) بين عشية وضحاها.
  2. توضع في coverslips تنظيف لوحة 6 جيدا، واحدة ساترة لكل بئر. والمغلفة مع البولي Coverslips-L-يسين الحل (2 مل، 0.1٪ في حامض البوريك 100 ملم، ودرجة الحموضة = 8.5) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية الحاضنة.
  3. التتم إزالة بولي-L-يسين حل من coverslips وتغسل coverslips 3 مرات مع 2 تعقيمها O. DDH ثم يتم تحضين Coverslips في 37 ° C حاضنة ليلة وضحاها في وسائل الإعلام الطلاء (Neurobasal تستكمل مع 5٪ من مصل الحصان للحرارة المعطل، ووحدات 10 / البنسلين مل، 10 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، Glutamax، 2٪ B27 الملحق يضاف إلى الطلاء المتوسطة في اليوم يتم استخدامه).
  4. وأضاف في اليوم التالي، وسائل الإعلام والطلاء تتم إزالة 2 مل من وسائل الإعلام الطلاء الطازجة مع B-27 لكل بئر يحتوي على ساترة الزجاج.
  5. يصرح باستخدامها في الفئران الحوامل (E15-18) مع CO 2، ويصرح باستخدامها في الفئران الجنينية بقطع الرأس. يتم تشريح قرن آمون أو المخطط من أنسجة المخ، ووضع في أنبوب 15 مل المخروطية مع الثلج الباردة العازلة تشريح، للثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون أو الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة الجسم المخطط، على التوالي.
  6. تشريح أنسجة المخ هي فصل مع غراء كما هو موضح في الخطوات 1.4) و 1.5).
  7. Following التفكك، يتم حساب عدد الخلايا العصبية في كل التعليق مع عدادة الكريات. والمصنف ثم الخلايا العصبية على كل ساترة في مناطق ذات كثافة الخلايا قدره 0.4 × 6 10 في جانب من لوحة 6 جيد، ومثقف في 37 ° C حاضنة ليلة وضحاها (الخلايا العصبية هي DIV 0).
  8. لإعداد إدراج الثقافة الدبقية لتكييف الثقافات العصبية، تتم إزالة وسائل الإعلام من الخلايا الدبقية إدراج الثقافة الدبقية ويضاف الطازجة المتوسطة الطلاء (2 مل في إدراج و2 مل تحت إدراج).
  9. في اليوم التالي (DIV 1)، يتم وضعها coverslips مع الخلايا العصبية تحت إدراج الثقافة الدبقية، واحدة في كل ساترة أيضا.
  10. ويتم تغذية الخلايا العصبية مع حجم نصف الطازجة وسائل الاعلام قبل تحسنت التغذية (مع B-27) كل 3-4 أيام حتى تكون جاهزة للتجارب ترنسفكأيشن والتصوير.

3. ترنسفكأيشن

  1. يتم تنفيذ ترنسفكأيشن العصبية باستخدام Lipofectamine 2000. لكل ثقافة العصبية (ثقافة واحدة في ساترة)، 2 ميكرولتروتستخدم Lipofectamine 2000 و 1 ميكروغرام من الحمض النووي. ويستخدم المتوسط ​​Neurobasal الطازجة مع عدم وجود ملحق لتخفيف Lipofectamine وDNA.
  2. ويتم تحضين DNA Lipofectamine لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الخلط.
  3. حفظ 1 مل من وسائل الإعلام من تحت كل الدبقية إدراج الثقافة، و1 مل من داخل كل إدراج، ونقل وسائل الإعلام لأنبوب مخروطي الشكل. إضافة وحدة التخزين نفسها من وسائل الاعلام تغذية + B27 إلى حفظ المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية. يتم استخدام هذه الوسيلة للثقافة العصبية بعد ترنسفكأيشن.
  4. بعد الحضانة Lipofectamine / 20-DNA دقيقة، يتم إزالة إدراج الثقافة الدبقية حظات من 6 لوحات جيدا. يتم إضافة 200 ميكرولتر Lipofectamine / DNA الخليط إلى كل ساترة مع الخلايا العصبية. يتم إرجاع ثم إدراج الثقافة الدبقية إلى كل بئر، فوق الخلايا العصبية. وينبغي تجنب توليد فقاعات تحت غشاء من إدراج الثقافة. يتم تحضين الخلايا العصبية مع خليط Lipofectamine / C DNA في ° 37 لمدة 2-4 ساعة.
  5. بعد اله الحضانة 2-4 ساعة فترة، تتم إزالة الخلايا الدبقية إدراج مرة أخرى. تتم إزالة وسائل الإعلام والثقافة مع خليط Lipofectamine / DNA من كل بئر. وأضاف وسائل الإعلام بحفظه في الخطوة 3.3) إلى الخلايا العصبية (2 مل لكل بئر). يتم إرجاع إدراج الثقافة الدبقية إلى كل بئر، وتتم إزالة الخلايا الدبقية وسائل الإعلام من كل إدراج، ويضاف 2 مل من وسائل الإعلام من الخطوة 3.3) في كل إدراج.
  6. يتم استزراع الخلايا العصبية لساعة إضافية للسماح 24-72 يتم تنفيذ التعبير عن [كدنا] تقاس قبل التصوير TIRF على هذه الخلايا العصبية.

4. TIRF التصوير

  1. وسوف تستخدم لتصوير تجارب حية: السائل النخاعي الاصطناعي (119 ملي كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 30 ملم الجلوكوز، 2 مم CaCl 2، 1 ملم MgCl 2 و 25 ملي HEPES، ودرجة الحموضة = 7.4 ACSF). نظامنا التصوير TIRF هو العرف انشاء مع ليزر ازرق سماوي 100-ميغاواط لالإثارة، وضرب شحنة الإلكترون إلى جانب جهاز (EMCCD) وكاميرا للكاشف.
  2. قبل التجارب والتصوير، وحذر ACSF في 37 و دعلى سبيل المثال؛ C حمام الماء لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. يتم وضع إدراج التدفئة للتصوير حية على المسرح المجهر، ويتم إدراج حرارة التسخين، ليزر، والكاميرا ما لا يقل عن 30 دقيقة قبل بدء التجارب التصوير.
  3. يتم تجميع الخلايا العصبية مع ساترة بالنقل الى غرفة التصوير الحية. يتم وضع ACSF قبل تحسنت في غرفة بعد غرفة يتم تجميعها، وينبغي أن تكتمل هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن.
  4. مرة واحدة يتم وضع دائرة على إدراج التدفئة على المسرح المجهر، ويتم تحديد الخلايا العصبية بالنقل بصريا تحت وضع التصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت.
  5. بعد تحديد الخلايا العصبية بالنقل صحية (يرجى الرجوع إلى الأرقام 1 و 2)، ونحن عادة ما تؤدي 1 دقيقة من التبييض، صور للقضاء على القائمة من قبل pHluorin مضان على الغشاء البلازمي، وpHluorin المستقبلات على غشاء البلازما لديهم مستويات عالية جدا عندما مضان وبدأت لأول مرة TIRF التصوير، والتي تتعارض مع التصور من الوظائف الفرديةertion الأحداث.
  6. بعد photobleach، تم تعيين إعداد مكسب مضاعف من الإلكترون على الكاميرا EMCCD إلى الحد الأقصى، ويتم تنفيذ التسجيل لمدة 1 دقيقة في 10 هرتز.
  7. سوف تحتوي على 600 تسجيل كل الصور. يتم تحديد الأحداث الفردية من خلال اللعب الإدراج الجزء الخلفي التسجيل باستخدام يماغيج. يتم تحليل الأحداث الإدراج الفردية يدويا باستخدام يماغيج.

5. ممثل النتائج

ثقافة العصبية يتفق هو المفتاح لتجارب حية للتصوير ناجحة. ويظهر الشكل 1 الخلايا العصبية قرن آمون الماوس مثقف باستخدام بروتوكول لدينا من 11 إلى DIV DIV 18. يبدو واضحا من الصور التي وضعت الخلايا العصبية عمليات واسعة النطاق والتي يتم تناولها في عمليات كثيفة مع شجيري العمود الفقري شجيري، مؤشرات على أن هذه الخلايا العصبية في صحة جيدة في الثقافة. ويمكن أيضا بروتوكول ثقافتنا أن تستخدم لأنواع أخرى من الخلايا العصبية في الدماغ. على سبيل المثال، كنا في الآونة الأخيرة هذا البروتوكول للثقافةالجسم المخطط الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة في دراسة مستقبلات D2 لدراسة الدوبامين (DRD2) الإدراج في الجسم المخطط الماوس مثقف الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة 9. ويبين الشكل 2 الماوس الجسم المخطط المتوسطة الخلايا العصبية الشوكية مثقف باستخدام بروتوكول لدينا في DIV 8. لدينا أيضا أجريت بنجاح TIRF تصوير superecliptic DRD2s pHluorin الموسومة في هذا النوع من الخلايا العصبية. ويبين الشكل 3 التعبير عن pHluorin الموسومة DRD2 (درجة الحموضة، DRD2) في الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة والتصور من درجة الحموضة DRD2-الإدراج في هذه الخلايا العصبية.

figure-protocol-1
ثقافة الرقم الماوس 1. الحصين باستخدام طريقة اجهة الثقافة. DIV: أيام في المختبر، ويعتبر اليوم من ثقافة وDIV 0. من الصور، من الواضح أن الخلايا العصبية قرن آمون ناضجة في هذا النوع من الثقافة بين 11 و DIV DIV 15. في DIV 11 و 13، وتغطي التشعبات العصبية والعمود الفقري مع filipodia غير ناضجة. و 15 في DIV18، وتغطي التشعبات العصبية مع العمود الفقري كبيرة، مؤشرا على الخلايا العصبية أكثر نضجا. لوحات من الزمن: منخفضة التكبير الصور من الخلايا العصبية قرن آمون الماوس في أعمار مختلفة. لوحات اليمين: عالية التكبير الصور (التكبير في التشعبات العصبية من اللوحة اليسرى) من عمليات شجيري الخلايا العصبية مع العمود الفقري شجيري في أعمار مختلفة.

figure-protocol-2
الشكل 2. ماوس الجسم المخطط مستنبت الخلايا العصبية الشوكية باستخدام طريقة اجهة الثقافة. الخلايا العصبية في الصور هي في DIV 8.

figure-protocol-3
الشكل 3. فأر الجسم المخطط الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة transfected مع مسير الشمس السوبر مستقبلات D2 pHluorin الموسومة الدوبامين (درجة الحموضة، DRD2). الصورة على اليسار هو الحد الأقصى الإسقاط كثافة تسجيل الوقت الفاصل بين (600 الصور، 100 ميللي ثانية لكل صورة). رؤوس سهام بيضاء تشير الإدراج حويصلي الفردية من درجة الحموضة-DRD2. هذه الصورة يحتفظ المعلومات الإدراج في البعد XY لكن يفقد معلومات الوقت. الصورة على اليمين يظهر YT الإسقاط كثافة الحد الأقصى، الذي هو مكدس xyt استدارة 90 درجة حول محور y، ويتوقع أن الحد الأقصى بكسل في كل سطر على محور س ص بكسل محور واحد. هذه الصورة يحتفظ المعلومات الإدراج على طول محور YT لكن يفقد المعلومات محور س.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لأسباب غير معروفة، الخلايا العصبية الماوس دائما أكثر صعوبة من الخلايا العصبية في الثقافة الفئران. في تجربتنا، وثقافة مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية يعمل بشكل جيد لالخلايا العصبية الأولية الماوس مثقف. ومع ذلك، هذه الثقافة المختلطة ليست مناسبة للتجارب التصوير TIRF، كما هو الحال في هذا النوع من الخلايا العصبية الثقافة وعملياتها تميل إلى النمو على أعلى من الخلايا الدبقية، وتوضيع somata العصبية والعمليات شجيري بعيدا عن متناول المجهر TIRF. ولذلك، وثقافة أقل كثافة الخلايا الع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ويدعم هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من مختبر جاكسون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم الكاشف شركة كتالوج رقم التعليقات
تنقية الكولاجين البقري الحل (Purecol) خيارات متقدمة Biomatrix 5005-B
هانك محلول الملح المتوازن (HBSS) GIBCO 14185-045
البنسلين الستربتوميسين (القلم بكتيريا) GIBCO 15140-122
الصوديوم البيروفات GIBCO 11360-070
DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز GIBCO 10313-021
مصل بقري جنيني (FBS)
GlutaMAX GIBCO 35050-061
غراء شركة بيوكيميائية ورثينجتون LS003126
I ديوكسي ريبونيوكلياز من البنكرياس البقري (الدناز I) SIGMA DN25-10MG
Dulbecco في المؤسسة العامة لتحلية (DPBS) GIBCO 14190-144
التربسين 0.05٪ GIBCO 25300-054
بولي-L-يسين هيدروبروميد SIGMA P2636-1G
حمض البوريك فيشر العلمية BP 168-500
متوسطة Neurobasal GIBCO 21103-049
B-27 المصل خالية من الملحق GIBCO 17504-044
مصل الحصان الحرارة غير نشط GIBCO 26050-070
Lipofectamine 2000 إينفيتروجن 11668 019
HEPES فيشر العلمية BP310-500
الثقافة إدراج ميليبور PICM03050

المراجع

  1. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  2. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
  3. Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
  4. Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
  5. Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
  6. Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
  7. Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
  8. Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
  9. Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
  10. Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
  11. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
  12. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
  13. Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
  14. Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
  15. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
  16. Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
  17. Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
  18. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

D2
التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.