مقالة منهجية

Cryosectioning المجتمعات الخميرة لفحص أنماط الإسفار

DOI:

10.3791/50101

⸱

ديسمبر 26, 2012

 , 
1Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكول للتجميد وcryosectioning المجتمعات الخميرة لمراقبة أنماط من الخلايا الداخلية الفلورسنت. وتعتمد الطريقة على التلاعب في نتائج الميثانول وOCT-تضمين الحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا دون تعطيل البروتينات الفلورية داخل مجتمع ما.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميكروبات تعيش عادة في المجتمعات المحلية. ويعتقد أن التنظيم المكاني للخلايا داخل المجتمع للتأثير على بقاء وظيفة من وظائف المجتمع 1. وقد أثبتت التقنيات البصرية تقطيع، بما في ذلك الفحص المجهري متحد البؤر واثنين من الفوتون، مفيدة لمراقبة التنظيم المكاني للمجتمعات البكتيرية وarchaeal 2،3. وقد كشفت مجموعة من مبائر التصوير وباجتزاء المادية للمستعمرات الخميرة التنظيم الداخلي للخلايا 4. ومع ذلك، فقد كان باجتزاء البصرية باستخدام المجهر متحد البؤر مباشرة أو اثنين الفوتون-فقط قادرة على الوصول إلى طبقات الخلايا قليلة في عمق المستعمرات الخميرة. هذا القيد هو المرجح بسبب تشتت الضوء القوي من خلايا الخميرة 4.

هنا، نقدم طريقة يعتمد على تحديد وcryosectioning للحصول على التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت داخل المجتمعات خميرة الخباز. نستخدم الميثانول وكيلا مثبتللحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا. تنقل خلالها المجتمعات الثابتة مع مجمع OCT، المجمدة، وcryosectioned في ناظم البرد. التصوير مضان من الأقسام يكشف عن التنظيم الداخلي للخلايا الفلورسنت داخل المجتمع.

أمثلة من المجتمعات تتكون من سلالات الخميرة التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء تظهر إمكانات الأسلوب cryosectioning للكشف عن التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت وكذلك في التعبير الجيني داخل مستعمرات الخميرة 2،3. على الرغم من تركيزنا كان على المجتمعات خميرة الخباز، ويمكن يحتمل نفس الأسلوب يمكن تطبيقها على دراسة المجتمعات الميكروبية الأخرى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصحيح المجتمعات الخميرة

  1. تنمية المجتمعات المحلية على الخميرة من غشاء (مثل ميليبور MF غشاء التصفية؛ 2A الشكل). هذا البروتوكول يتوافق مع المجتمع نموذجية من أقل من 8 خلايا 2X10 على فلتر غشاء 6 ملم القطر.
  2. استخدام قطعة من الورق 541 WHATMAN مرشح لتغطية الجزء السفلي من وقطره 1 سم جيدا (الشكل 2B). وسوف تستخدم هذه الورقة WHATMAN باعتبارها الناقل لنقل المجتمع في مراحل لاحقة. إضافة 1 مل الميثانول بنسبة 100٪ إلى البئر، وترك البئر في -20 درجة مئوية لدرجة الحرارة للتوازن.
  3. وضع السائل N 2 في ديوار. تجميد المجتمع في النيتروجين السائل عن طريق غمس المجتمع لما لا يقل عن 15 ثانية في السائل N 2 باستخدام منتاش (الشكل 2C).
  4. نقل المجتمع المجمدة إلى البئر من الميثانول ° -20 درجة (الشكل 2D). ضمان أن يتم الاحتفاظ المجتمع الأفقي عندما غمر في الميثانول.انتظر 20 دقيقة. غشاء MF تصفية يبدأ في التفكك في الميثانول.
  5. نقل المجتمع باستخدام الناقل WHATMAN 541 ورق الترشيح من الميثانول إلى جانب طبق بيتري الباردة أبقى في -20 درجة مئوية لمدة تبخر الميثانول (2E الشكل). عند نقل، والحفاظ على المجتمع على رأس الناقل WHATMAN تصفية واستخلاص قطرات بعيدا إضافية من الميثانول باستخدام قطعة أخرى من الورق السميك WHATMAN قبل وضع في طبق بتري الباردة. وسوف يضمن هذا الوقت من التبخر يتسق عينة لعينة.
  6. الانتظار 4-6 ساعة حتى لتبخر الناقل WHATMAN مرشح تبدو جافة. تبخر الميثانول المتبقية غير كافية يترك التي تتعارض مع تقطيع. الإفراط في تجفيف أسباب الشقوق وتشوه في المجتمعات المحلية.
  7. تأخذ عينة من الفريزر -20 درجة مئوية. قطع بعيدا WHATMAN 541 رقة الترشيح التي لا تغطيها المجتمع.
  8. جعل مستطيل مكعب الألومنيوم احباط الحاويات التي هي كبيرة بما يكفي بحيث العينة على الأقل ~ هامش مم 2 منكل جانب (الشكل 2F). وضع المجتمع على السطح السفلي من الألومنيوم احباط الحاويات؛ تغطية مباشرة مع عينة أكتوبر إلى 3 ~ 4 مم فوق ارتفاع المجتمع. إذا هامة، ويمكن تعديل اتجاه العينة في هذه الخطوة فيما يتعلق الجانبين من الحاوية. انتظر 10 دقيقة.
  9. ضع عينة OCT-جزءا لا يتجزأ من على لوحة معدنية على الثلج الجاف لتجميد. تخزين المجتمعات المجمدة في -20 -80 ° C أو C ° الثلاجة.

2. باجتزاء المجتمعات مجمدة لتصوير الإسفار

  1. تعيين درجة حرارة الغرفة لC ° cryosection -25 و ترك العينات في غرفة درجة الحرارة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. تحميل عينة الصعود إلى جبل البرد بعد تطبيق قطرة من أكتوبر على الجبل. انتشرت بشكل موحد أكتوبر على جانب عينة مع تعرض رقة الترشيح WHATMAN (قاع الإناء) بحيث أكتوبر سمك 2-3 مم. اسمحوا أكتوبر تجميد داخل غرفة ناظم البرد قبل SEctioning. ضمان هامش أكتوبر من 2-3 مم من كل جانب من العينة يساعد على الحفاظ على سلامة أقسام.
  3. ويمكن استخدام الجانبين من كتلة عينة أكتوبر لمحاذاة العينة. إذا لم يتم محاذاة العينة فيما يتعلق شفرة، سوف تبدأ تقطيع من ركلة ركنية أو الجانب من العينة. ضبط جبل لضمان أن نصل يقطع رأسي تماما (أو الأفقي) مواجهة كتلة العينة.
  4. أقسام نموذجية للمجتمعات الخميرة هي ~ 14 ميكرون سميكة. بعد قطع مقطع، استخدام شريحة المجهر الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لجمع هذا الباب، من خلال تناوله ببطء الشريحة إلى قسم قطع. سوف تذوب القسم ونقل إلى الشريحة المجهر. يمكن نقل ما يصل إلى 18 أقسام على شريحة واحدة.
  5. تخزين الشرائح في درجات الحرارة الباردة، ويفضل -20 ° C، قبل التصوير. فقدان الإشارة هو الحد الأدنى عند الاحتفاظ بها لمدة أسبوع واحد في C. ° 4 للإشارة مضان أقصى، ويتم ذلك يفضل التصوير على الفور بعد تقطيع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتظهر الصور مضان من المقاطع العرضية الرأسية للمجتمعات التي تحتوي على الخميرة الحمراء السكان تنافسية والأخضر الموسومة-6 في الشكل 3. هذه المجتمعات تتكون من سلالات بدئية اثنين من الخميرة والمنافسة على الموارد المشتركة، بما في ذلك الفضاء، إلى أنماط عمودية 7، كما تم عرضه في عمودي على المقاطع العرضية. يمكن حل القرارات وصولا الى خلية واحدة في المقاطع العرضية. الشكل 3 مقارنة المقاطع العرضية للمجتمعات تكرار الحصول عليها مع (القاع) وبد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراء المقدمة هنا يوفر وسيلة لتفقد البنية الداخلية للمجتمعات الخميرة. الخطوة تحديد الميثانول يجعل مستعمرة الخميرة جامدة 8 و يحافظ على سلامة المستعمرة، ومع ذلك، فإنه يتسبب أيضا 8 الانكماش التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تفسير النتائج. نرى عادة حوالي 30٪ انكماش في ارتفاع المستعمرات الخميرة، مقارنة المستعمرات جزءا لا يتجزأ مباشرة في أكتوبر دون تحديد 9.

لتجنب انكماش، وهو نهج بديل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر جوناثان كوبر مختبر في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان للحصول على إذن لاستخدام ناظم البرد بهم. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة كيك WM. BM هو زميل غوردون مور وبيتي من علوم الحياة مؤسسة البحوث. ونحن ممتنون لGottschling دانيال لبروتوكول قسمة له تثبيت معنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
100٪ الميثانول JT بيكر 9070-01
الأنسجة تيك أكتوبر مجمع Andwin العلمية 4583
WHATMAN الصف رقم 541 ورقة تصفية الكمية WHATMAN 1541-047
ميليبور-MF غشاء تصفية ميليبور HAWP04700
ناظم البرد لايكا CM 1510 S

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
  2. Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
  3. Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
  4. Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
  5. Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
  6. Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
  7. Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
  8. Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).
  9. Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Fluorescence ImagingSpatial DistributionMethanol FixingOCT EmbeddingFluorescent ProteinsYeast ColoniesFluorescence MicroscopyCommunity SectioningFluorescent Signal

مقالات ذات صلة