Method Article

Cryosectioning المجتمعات الخميرة لفحص أنماط الإسفار

DOI:

10.3791/50101

⸱

December 26th, 2012

 , 
1Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكول للتجميد وcryosectioning المجتمعات الخميرة لمراقبة أنماط من الخلايا الداخلية الفلورسنت. وتعتمد الطريقة على التلاعب في نتائج الميثانول وOCT-تضمين الحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا دون تعطيل البروتينات الفلورية داخل مجتمع ما.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميكروبات تعيش عادة في المجتمعات المحلية. ويعتقد أن التنظيم المكاني للخلايا داخل المجتمع للتأثير على بقاء وظيفة من وظائف المجتمع 1. وقد أثبتت التقنيات البصرية تقطيع، بما في ذلك الفحص المجهري متحد البؤر واثنين من الفوتون، مفيدة لمراقبة التنظيم المكاني للمجتمعات البكتيرية وarchaeal 2،3. وقد كشفت مجموعة من مبائر التصوير وباجتزاء المادية للمستعمرات الخميرة التنظيم الداخلي للخلايا 4. ومع ذلك، فقد كان باجتزاء البصرية باستخدام المجهر متحد البؤر مباشرة أو اثنين الفوتون-فقط قادرة على الوصول إلى طبقات الخلايا قليلة في عمق المستعمرات الخميرة. هذا القيد هو المرجح بسبب تشتت الضوء القوي من خلايا الخميرة 4.

هنا، نقدم طريقة يعتمد على تحديد وcryosectioning للحصول على التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت داخل المجتمعات خميرة الخباز. نستخدم الميثانول وكيلا مثبتللحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا. تنقل خلالها المجتمعات الثابتة مع مجمع OCT، المجمدة، وcryosectioned في ناظم البرد. التصوير مضان من الأقسام يكشف عن التنظيم الداخلي للخلايا الفلورسنت داخل المجتمع.

أمثلة من المجتمعات تتكون من سلالات الخميرة التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء تظهر إمكانات الأسلوب cryosectioning للكشف عن التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت وكذلك في التعبير الجيني داخل مستعمرات الخميرة 2،3. على الرغم من تركيزنا كان على المجتمعات خميرة الخباز، ويمكن يحتمل نفس الأسلوب يمكن تطبيقها على دراسة المجتمعات الميكروبية الأخرى.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصحيح المجتمعات الخميرة

  1. تنمية المجتمعات المحلية على الخميرة من غشاء (مثل ميليبور MF غشاء التصفية؛ 2A الشكل). هذا البروتوكول يتوافق مع المجتمع نموذجية من أقل من 8 خلايا 2X10 على فلتر غشاء 6 ملم القطر.
  2. استخدام قطعة من الورق 541 WHATMAN مرشح لتغطية الجزء السفلي من وقطره 1 سم جيدا (الشكل 2B). وسوف تستخدم هذه الورقة WHATMAN باعتبارها الناقل لنقل المجتمع في مراحل لاحقة. إضافة 1 مل الميثانول بنسبة 100٪ إلى البئر، وترك البئر في -20 درجة مئوي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتظهر الصور مضان من المقاطع العرضية الرأسية للمجتمعات التي تحتوي على الخميرة الحمراء السكان تنافسية والأخضر الموسومة-6 في الشكل 3. هذه المجتمعات تتكون من سلالات بدئية اثنين من الخميرة والمنافسة على الموارد المشتركة، بما في ذلك الفضاء، إلى أنماط عمودية 7، كما تم عرضه في عمودي على المقاطع العرضية. يمكن حل القرارات وصولا الى خلية واحدة في المقاطع العرضية. الشكل 3 مقارنة المقاطع العرضية للمجتمعات تكرار الحصول عليها مع (القاع) وبد.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراء المقدمة هنا يوفر وسيلة لتفقد البنية الداخلية للمجتمعات الخميرة. الخطوة تحديد الميثانول يجعل مستعمرة الخميرة جامدة 8 و يحافظ على سلامة المستعمرة، ومع ذلك، فإنه يتسبب أيضا 8 الانكماش التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تفسير النتائج. نرى عادة حوالي 30٪ انكماش في ارتفاع المستعمرات الخميرة، مقارنة المستعمرات جزءا لا يتجزأ مباشرة في أكتوبر دون تحديد 9.

لتجنب انكماش، وهو نهج بديل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر جوناثان كوبر مختبر في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان للحصول على إذن لاستخدام ناظم البرد بهم. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة كيك WM. BM هو زميل غوردون مور وبيتي من علوم الحياة مؤسسة البحوث. ونحن ممتنون لGottschling دانيال لبروتوكول قسمة له تثبيت معنا.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
100٪ الميثانول JT بيكر 9070-01
الأنسجة تيك أكتوبر مجمع Andwin العلمية 4583
WHATMAN الصف رقم 541 ورقة تصفية الكمية WHATMAN 1541-047
ميليبور-MF غشاء تصفية ميليبور HAWP04700
ناظم البرد لايكا CM 1510 S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
  2. Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Inter....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryosectioning Yeast CommunitiesFluorescence ImagingSpatial DistributionMethanol FixingOCT EmbeddingFluorescent ProteinsYeast ColoniesFluorescence MicroscopyCommunity SectioningFluorescent Signal

Related Articles