مقالة منهجية

باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الجهات المانحة Engraftment خلية في التنافسية نموذج الفئران زرع نخاع العظم

DOI:

10.3791/50193

⸱

مارس 7, 2013

 , 
1Division of Hematology-oncology, Department of Medicine, Medical University of South Carolina

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد الخلية المانحة engraftment تحديا في نماذج الماوس زرع نخاع العظم التي تفتقر علامات واضحة المعالم phenotypical. صفنا منهجية لتحديد الخلية المانحة engraftment ذكر أنثى الفئران المتلقية في الزرع. ويمكن استخدام هذه الطريقة في جميع سلالات الفئران لدراسة وظائف HSC.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفئران نماذج زرع نخاع العظام توفير أداة هامة في قياس الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) وظائف الجينات وتحديد / الجزيئات التي تنظم HSCs. في هذه النظم نموذج زرع، يتم تحديد وظيفة HSCs من قدرة هذه الخلايا على الفئران تدبر وإعادة المتلقي المشع قاتل. عادة، يتم قياس الخلية المانحة المساهمة / engraftment من الأجسام المضادة للبروتينات محددة من المانحين سطح الخلية باستخدام التدفق الخلوي. ومع ذلك، وهذه الطريقة تعتمد بشكل كبير على نوعية وقدرة الخلية علامة لتمييز سطح المانحة الخلايا المشتقة من الخلايا المتلقية ذات المصدر، والتي قد لا تكون متاحة لجميع سلالات الفئران. النظر في خلفيات مختلفة من سلالات الفئران المعدلة وراثيا في السوق، وهذا سطح الخلية / تدفق الخلوي على أساس الطريقة لها أهمية خاصة في القيود سلالات الفئران التي تفتقر إلى علامات واضحة المعالم السطحية لخلايا منفصلة عن المانحة مسانج مشترك المستفيدة مLLS. هنا، أبلغنا تقنية PCR المستندة لتحديد الخلية المانحة engraftment / مساهمة في الفئران المتلقية الزرع. نحن زرع نخاع الذكور HSCs المانحة العظام للفئران مسانج مشترك المشع قاتل النساء. تم جمع عينات الدم المحيطي في مختلف زرع وقت آخر نقطة. تم الحصول على عينات نخاع العظم في نهاية التجارب. تم عزل الحمض النووي الجيني وتضخيم الجين كروموسوم Y محددة، Zfy1، وذلك باستخدام كمية PCR الوقت الحقيقي. تم حساب engraftment من الخلايا المانحة المستمدة من الذكور في الإناث الفئران المتلقية ضد منحنى القياسية مع نسبة معروفة من السلطات الوطنية المعينة ذكر مقابل أنثى. وقد استخدم Bcl2 باسم الجينات إشارة إلى تطبيع كمية DNA الكلي. اقترح البيانات المتوفرة لدينا أن هذا النهج يحدد بشكل موثوق المانحة engraftment الخلية ويوفر طريقة مفيدة، وإن كان بسيطا في قياس المكونة للدم إعادة خلية في الفئران نماذج زرع نخاع العظام. يمكن إجراء روتيني أسلوبنا في معظم المختبرات لأنه لا يوجدمطلوب معدات مكلفة مثل التدفق الخلوي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان أول من طور نموذج الفئران العظام زرع نقي (BM) في 1960s 1. وقد تم استخدام هذا النموذج على نطاق واسع لدراسة الخلية الجذعية المكونة للدم المانحة (HSC) علم الأحياء في مجموعة الماوس المتلقي. وقد وفرت الفئران زرع نخاع العظم نموذج لنا معلومات قيمة عن وظائف HSC وتنظيمها وأمر لا غنى عنه في البحث HSC. وتستخدم خيفي زرع نخاع العظام مثل نموذج C57Bl/6J H2B-BALB / C H2d أو نموذج مسانج مشترك زرع مثل C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 في العديد من المختبرات لدراسة وظيفة الجين على النشاط HSC 2، تأثير العلاج من تعاطي المخدرات على الأمراض وظيفة 3 أو زرع HSC ذات الصلة مثل الطعم ضد المضيف المرض (GVHD) 4.

ويشيع استخدام علامات سطح الخلية مثل النمط الفرداني MHC أو CD45.1 للخلايا المانحة المستمدة من خلايا المتلقي المميزة ذات المصدر. C57Bl/6J H2B، CD45.2 ، BALB / C H2d وCD45.1 B6.SJL هي سلالات الفئران الأكثر شيوعا في زرع نخاع العظم لأنه يمكن المساهمة الخلية المانحة المقررة بسهولة عن طريق قياس التدفق الخلوي CD45.1 مقابل CD45.2 أو H2B مقابل H2d. ومع ذلك، يتم أيضا سلالات أخرى كثيرة مثل FVB / 5 و NJ C3H غالبا ما تستخدم لتوليد المعدلة وراثيا وراثيا أو الفئران خروج المغلوب. قد تكون هذه الفئران backcrossed إلى خط الفطرية والمحافظة عليها في خلفية الوراثية / MHC مختلطة. في هذه الحالات، يمكن تحديد الخلية المانحة engraftment وظيفة HSC يكون من الصعب كعلامات المانحة سطح خلايا محددة قد لا تكون متاحة.

باستخدام كروموسوم Y-DNA محددة التحقيق للكشف عن الخلايا المانحة الذكور من لطخة في جنوب الجنس غير متطابقة زرع نخاع العظام كان أول من طور من قبل مجموعة الدكتور ميوا 6. ثم، تم العثور على PCR الوقت الحقيقي للY المنطقة المحدد للجنس ليكون وسيلة دقيقة ومحددة للغاية لquantitate أماهخلايا الجنين جنيه في النظام دم الأم 7. وقد تم تكييف هذا المفهوم من قبل مجموعة الدكتور Schwarzenberger لتطوير تقنية PCR في الوقت الحقيقي في نموذج الفئران زرع نخاع العظام لتحديد الخلية المانحة engraftment 8. ونحن كذلك تعديل هذه الطريقة لقياس engraftment الخلية المانحة في FVB / NJ نموذج الفأر العظام زرع نقي. حاليا تستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع في مجموعتنا لدراسة دور Pim1 كيناز في علم الأحياء HSC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عزل الخلايا نخاع العظم

  1. الموت ببطء ذكر المانحة FVB / NJ الفئران والإناث FVB / NJ الفئران باستخدام طريقة CO 2 تليها خلع عنق الرحم. وسوف تستخدم الأنثى نخاع العظم FVB / NJ الخلايا كخلايا تنافسية.
  2. استخدام مقص وملقط صغير، تشريح من عظام الفخذ وtibiaes من الفئران ووضعها في صحن زراعة الأنسجة 60 مم تحتوى على 6 مل RPMI1640 الجليد الباردة مع FBS المعطل الحرارة 5٪. استخدام الأنسجة kimwipe لإزالة العضلات والأنسجة الأخرى. قطع طرفي كل رمح العظام في الطبق.
  3. توصيل نهاية العظام مع إبرة حقنة سم مكعب على 23G 3، اخراج نخاع العظام مع RPMI1640 مع FBS المعطل الحرارة 5٪ في الطبق. تفصيل أنسجة النخاع العظمي من تطلعات المتكررة باستخدام إبرة واحدة. نقل التعليق الخلية إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي.
  4. تدور باستمرار لمدة 5 دقائق الخلايا في 400 XG، وإزالة طاف، إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من درجة حرارة الغرفة العازلة تحلل الخلايا الحمراء في الدم (155 ملي عبيكربونات otassium، 10 ملي كلوريد الأمونيوم، 0.1 ملم EDTA، PH = 7.4) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ثم يضاف مل 5-10 من RPMI 1640 مع FBS المعطل الحرارة 5٪.
  5. تمر الخلايا من خلال مصفاة الخلية. جمع من خلال تدفق إلى أنبوب جديد. تدور باستمرار لمدة 5 دقائق في ز × 400. إزالة طاف، وبيليه الخلية يجب أن لا تحتوي على أي لون أحمر. غياب اللون الأحمر يشير إلى الإزالة الكاملة للخلايا الدم الحمراء. إعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل من RPMI1640 مع FBS المعطل الحرارة 5٪. دوامة بلطف للتأكد من التعليق الخلية موحدة تماما. قسامة واتخاذ عد الخلايا في عدادة الكريات. حساب مقدار حجم الخلايا اللازمة لزرع نخاع العظم والخلايا قسامة ما يكفي من الخلايا المانحة وتخلط مع خلايا الذكور الإناث منافس في نسبة 05:02. تدور باستمرار لمدة 5 دقائق في 400 XG، وغسل مع PBS، resuspend في برنامج تلفزيوني مع تركيز النهائي من الخلايا المانحة في 5 × 10 خلايا 6 / مل ومنافس في 2 × 10 6 / مل.

2. تنافسية زرع نقي العظم

  1. الفئران المتلقية أشرق الإناث (8-12 أسبوعا من العمر) مع 137Cs أشعة غاما المبرد في جرعة واحدة من 4-6 ساعة قبل الزرع 11Gy نخاع العظام.
  2. وضع الفئران الإناث المشععة في restrainer الماوس. حقن الخلايا المانحة المختلطة ومنافس عبر الوريد الذيل في 0.1 مل من الحجم الكلي بحيث يتلقى كل الماوس 5 × 10 خلايا المانحة 5 و 2 × 10 نخاع العظام والخلايا منافس 5.

3. عينة كوكتيل

أزواج أسابيع بعد زرع نخاع العظام، وجمع عينات الدم المحيطي (~ 50 ميكرولتر) من الإناث من قبل المتلقي الماوس الرجعية المدارية نزيف تحت ظروف التخدير. يتم جمع العينات في أنابيب EDTA المغلفة. ويمكن أيضا أن تجمع عينات BM في نهاية التجربة، وعادة ما لا يقل عن 4 أشهر زرع آخر، مع إجراءات كالسابق وصف (الخطوة 1)؛ 20-40٪ عادة من1 BM الساق الخلايا ما يكفي لجعل كمية كافية من الحمض النووي. يتم جمع عينات الدم أو أيضا BM من العمر المتطابقة العادية الفئران الذكور والإناث لإعداد منحنى القياسية.

4. الجينومية DNA عزل

  1. إضافة 4 × حجم من درجة حرارة الغرفة العازلة تحلل RBC (~ 200 ميكرولتر) إلى كل عينة الدم. تخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني، وتدور ثم تراجع لإزالة معظم RBC هي lysed.
  2. عزل DNA باستخدام استخراج DNA طقم الدم (الدم عدة QIAmp استخراج DNA). قبل شطف الحارة المخزن المؤقت (AE) في 37 ° C لتعزيز العائد من الحمض النووي مزال. يتم عزل الذكور والإناث السلطات الوطنية المعينة لمنحنى القياسية بالمثل.
  3. يمكن (اختياري) يتم تنقية الحمض النووي الجيني أخرى أو باستخدام تتركز EtOH طريقة هطول الأمطار في وجود خلات الصوديوم من 3 M (الرقم الهيدروجيني = 5.5). ومعلق ثم الكريات DNA في الماء المقطر 40-50 ميكرولتر لتحليل فورا أو تخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  4. قياس DNA concentrأوجه مع Nanodrop ND-1000 مضواء الأطياف. وتستخدم العينات مع OD 260/280 بين 1،8-2،0 لمزيد من التحليل.
  5. تمييع DNA مع خدمة DNAase O 2 H ل4ng/μl في حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر.

5. معيار إعداد منحنى

تمييع DNA الحمض النووي وذكر الإناث إلى تركيز من 4 نانوغرام / ميكرولتر، وجعل الخليط DNA وفقا لTable1

٪ من الذكور في الخلفية DNA أنثى حجم (ميكرولتر) من الحمض النووي ذكر 4ng/μl حجم (ميكرولتر) من الإناث DNA 4ng/μl اجمالى حجم التداول (ميكرولتر)
0.2 1 499 500
0.5 1 199 200
2.5 5 195 200
12،5 25 175 200
50 100 100 200
87،5 175 25 200
100 200 0 200

إعداد جدول نموذج 1. لمنحنى القياسية. تمت التضحية الطبيعي الذكور والإناث FVB / NJ الفئران في سن 12wks-8. تم جمع الدم والخلايا BM. تم عزل الخلايا السلطات الوطنية المعينة من الذكور وخلايا الإناث وإعادة علقت-بتركيز 4ng/μl. كانت مختلطة السلطات الوطنية المعينة من الذكور والإناث في نسب مختلفة لتوليد مخاليط DNA العينة القياسية.

6. في الوقت الحقيقي PCR

  1. إعداد لوحة PCR عن طريق خلط رد فعل SYBR كاشف supermix الأخضر مع الاشعال والحمض النووي الجيني. حجم رد الفعل (20 ميكرولتر) يحتوي على 400 نيوتن متر من كل التمهيدي و 5 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني خلايا الدم (4ng/μl X5 = 20 نانوغرام ميكرولتر) في كل رد فعل. DNA عصيدةتم تعيين ما يصل ليه والمعايير في ثلاث نسخ. يتم عرض تسلسل الاشعال في الجدول 2.
اسم الجين إلى الأمام عكس
Bcl2 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG
Zfy1 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC

الجدول 2. تسلسل التمهيدي RT-PCR لBcl2 الفئران وZfy1.

  1. أداء PCR تفاعل PCR باستخدام آلة Biorad iQ5 مع الشروط التالية: 95 ° C 3 دقائق، ودورات التضخيم 42 من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 58 درجة مئوية لمدة 25 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، يليه منحنى ذوبان الخطوة.
  2. الحصول على دورة عتبة (CT) من القيم بيو راد iQ5 2.1 النظام الإصدار القياسي البصرية. حساب δCt (CT Zfy1 </ سوب> Bcl2-CT) قيمة، ويحسب Zfy1 مستوى التعبير كقيمة 2-δ ط م.
  3. إنشاء منحنيات القياسية لكل سلسلة رد فعل باستخدام 2-δCt القراءة من الخلائط ذكر / أنثى المعروفة القياسية. يتم إنشاء منحنيات القياسية من قبل المتهم بالتآمر في متوسط ​​2-δCt قيمة ثلاث مكرارت إلى DNA٪ المعروف ذكر في الخليط المناسب مع الانحدار الخطي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأظهرت الشكل 1 و 2 أمثلة من المنحنيات القياسية تآمر مع القيم متوسط ​​δCt-2 ضد نسب الذكور DNA. الشكل 1A أظهرت درجة حرارة انصهار محددة لBcl2 وZfy1 amplicons المترجمة في 78،5 ° C و 88.5 ° C، على التوالي. يستخدم Bcl2 باسم الجينات إشارة إلى تطبيع المبلغ الإجمالي للDNA تحميلها في كل رد فعل PCR. منحنيات التضخيم Bcl2 (عرض السجل) لكل عينة القياسية دمج مع بعضها البعض من تركيز الحمض النووي مستقلة الذكور، مشيرا إلى كمية متساوية من الحمض النووي تحمي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من دراستنا الحالية هو توفير تقنية PCR الجماهير القائم على تحديد الجهات المانحة engraftment خلية في نموذج تنافسية العظام زرع نخاع الفئران. تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات باستخدام RT-PCR للكشف عن الخلايا المانحة في نماذج زرع 9-10. مجموعة الدكتور Schwarzenberger في تطوير أول نخاع عظام الفئران نموذج زرع في الوقت الحقيقي باستخدام PCR لتضخيم ص كروموسوم معين 8. وقد استخدم هذا الأسلوب لدراسة الحكلي-1 وظيفة في النشاط HSC 11. نحن ثم عدلت مرة أخرى بر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد تنافس المصالح المالية لا تكشف ل.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور تشارلز غرينبرغ لاستخدام PCR الوقت الحقيقي له الجهاز. ويدعم هذا العمل من قبل صندوق سرطان MUSC هولينغ بدء التشغيل مركز هولينغ مركز السرطان ACS IRG، ASCO قهر السرطان التطوير الوظيفي مؤسسة جائزة، NIH-01A1 1K08HL 103780، والمعاهد الوطنية للصحة 3P30CA138313-01S3. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة أو وكلاء التمويل الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
RPMI 1640 Hyclone SH30255.01
FBS إينفيتروجن 16140-017 الحرارة المعطل
كلوريد الأمونيوم MP Biomedicaals 194806
بيكربونات البوتاسيوم الصياد P184-500
QIAamp DNA الدم minikit QIAGEN 51106
الخلية مصفاة العلوم البيولوجية دينار بحريني
معدل الذكاء SYBR الأخضر supermix Biorad 170-8882
iQ5 الحقيقي آلة الزمن PCR Biorad
أطياف مضواء Nanodrop ND-1000 ND-1000

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
  2. Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
  3. Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316(2010).
  4. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
  5. Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
  6. Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
  7. Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
  8. Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
  9. Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894(2008).
  10. Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
  11. Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
  12. Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
  13. Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Y

مقالات ذات صلة