الكروموسومات يمكن عزلها عن الخلايا الحية مثل الخلايا اللمفية أو الخلايا الليفية الجلد، ومن الكائنات الحية بما فيها البشر أو الفئران. هذه الاستعدادات كروموسوم يمكن استخدامها لمزيد من الروتين G-النطاقات والإجراءات الوراثية الخلوية الجزيئية مثل مضان التهجين في الموقع (FISH) في والتهجين الجينومي المقارن ([ك])، وتنميط نووي الطيفية (SKY).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويستخدم على نطاق واسع الصبغي (خلوي) تحليل للكشف عن عدم الاستقرار كروموسوم. عندما تليها G-النطاقات والتقنيات الجزيئية مثل مضان التهجين في الموقع (FISH) في، هذا الاختبار لديه القدرة قوية لتحليل الخلايا الفردية للالانحرافات التي تنطوي على مكاسب أو خسائر من أجزاء من الجينوم والتي تنطوي على إعادة ترتيب الكروموسومات واحد أو أكثر. في البشر، وتحدث تشوهات صبغية في حوالي 1 في 160 ولادة حية 1،2، 60-80٪ من جميع حالات الإجهاض 3،4، 10٪ من حالات الإملاص 2،5، 13٪ من الأفراد الذين يعانون من أمراض القلب الخلقية 6، 3-6٪ من حالات العقم 2، وفي كثير من المرضى الذين يعانون من تأخر في النمو والعيوب الخلقية 7. ويستخدم التحليل الوراثي الخلوي الخباثة بشكل روتيني من قبل الباحثين والأطباء، كما تبين من الملاحظات شذوذ الكروموسومات نسيلي أن يكون أهمية التشخيص والنذير كلا 8،9.60؛ كروموسوم العزلة لا تقدر بثمن للعلاج بالجينات وأبحاث الخلايا الجذعية من الرئيسيات غير البشرية بما في ذلك الكائنات الحية والقوارض 10-13.
الكروموسومات يمكن أن تكون معزولة من خلايا الأنسجة الحية، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية في الدم، والخلايا الليفية الجلدية، amniocytes، والمشيمة، ونخاع العظام، وعينات الورم. ويتم تحليل الكروموسومات في المرحلة الطورية من الانقسام، وعندما تشتد مكثف، وبالتالي فإنها مرئية أكثر وضوحا. الخطوة الأولى للتقنية الكروموسوم العزلة ينطوي على اضطراب في ألياف المغزل قبل الحضانة مع Colcemid، لمنع الخلايا من الانتقال إلى مرحلة لاحقة طور الصعود. ثم يتم التعامل مع الخلايا مع حل ناقص التوتر والحفاظ عليها في حالة تورم مع تثبيتي في كاروني. ثم يتم إسقاط الخلايا إلى الشرائح ويمكن بعد ذلك أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الإجراءات. G-النطاقات ينطوي العلاج التربسين تليها تلطيخ مع بالغيمزا لخلق ضوء مميزة وعصابات الظلام. نفس العلاقات العامةocedure لعزل الكروموسومات يمكن استخدامها لإعداد الخلايا لإجراءات مثل مضان التهجين في الموقع (FISH) في والتهجين الجينومي المقارن ([ك])، وتنميط نووي الطيفية (SKY) 14،15.
المقدمة
تحليل الكروموسومات هي تقنية تستخدم في جميع أنحاء العالم التقليدية لتشخيص عدم الاستقرار وإعادة ترتيب الكروموسومات مما يؤدي إلى الاضطرابات الوراثية والأورام الخبيثة 1،2،8،9. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق دقة أعلى لتشخيص والبحوث من خلل وراثي دستوري والمكتسبة السرطان مع مجموعة من الإجراءات والمنهجيات الكلاسيكية خلوي خلوي الجزيئية مثل مضان التهجين في الموضع (FISH)، التهجين الجينومي المقارن ([ك]) ، وتنميط نووي الطيفية (SKY) 14،15. في الآونة الأخيرة، وقد تم استخدام هذه التقنيات لتقييم عدم الاستقرار الصبغي المرتبطة أبحاث الخلايا الجذعية. وقد تم الإبلاغ عن تشوهات مثل عدم توازن الصبغيات النمط النووي للخلايا طويلة الأجل مثقف الجنينية (ES) والخلايا الجذعية البالغة من الكائنات الحية المختلفة من قبل مختبرات متعددة. يدعم الأدلة الحديثة أن بعض خطوط الخلايا هي بطبيعتها أكثر ميلا للكروموسوم instability بغض النظر عن الظروف الثقافة. لهذا السبب، عند إنشاء و / أو الحفاظ على خطوط الخلايا الجذعية القرد الإنسان، والماوس، أو، فمن المستحسن تحليل كروموسوم كجزء من عملية مراقبة الجودة. وصف العديد من التقارير على الاهتمام المتزايد في استخدام علم الوراثة الخلوية والجزيئية روتينية لمراقبة الاستقرار الكروموسومات من الخلايا الجذعية والخلايا الخبيثة أو الكائنات المختلفة في الثقافة 10-13. ويتزايد استخدام هذه البروتوكولات من قبل مختبرات غير الوراثية لتقييم الكروموسومات السريع لزنازينهم مثقف 13. نقدم الإجراءات الأساسية لدينا لإعداد كروموسوم من أنواع الخلايا المختلفة، والتي يمكن تطبيقها لكلا الغرضين والخلايا السريرية والبحوث المستمدة من الكائنات الحية المختلفة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. كروموسوم حصاد خلايا منتسب
- بروتوكول القياسية
- تنمو الخلايا وفقا لظروف زراعة خلية معينة. عندما وصلت إلى مرحلة الخلايا لوغاريتمي (80٪ confluency)، إضافة 10 ميكرولتر / مل من Colcemid إلى قارورة ثقافة الخلية. ويوصى ما لا يقل عن 2 × 10 6 خلايا.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 45 دقيقة. باستخدام ماصة معقمة، ونقل وسائل الاعلام من الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية. توضع جانبا.
- بلطف غسل الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من HBSS العازلة في قارورة. دوامة العازلة ومن ثم إزالة باستخدام ماصة. تجاهل.
- إضافة 1 مل من التربسين، وضمان أنه يغطي كامل سطح القارورة. ترك فقط الخلايا في التربسين لحوالي 2 دقيقة. بمجرد فصل الغالبية العظمى من الخلايا، ماصة وسائل الإعلام في أنبوب مخروطي مرة أخرى إلى الخلايا.
- نقل تعليق خلية في 10 مل مأخوذة في 15 مل أنابيب المخروطية.أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف و resuspend بيليه.
- إضافة 10 مل من 0.075 M بوكل التي تم prewarmed إلى 37 درجة مئوية لبيليه المتبقية في أنبوب مخروطي. أنبوب دوامة على سرعة متوسطة لخلط بوكل والخلايا.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. إزالة طاف (حتى حوالي 0.5 مل بقايا) و resuspend بيليه.
- إضافة بعناية 5 مل من مثبت الطازجة كاروني في (3:1 نسبة الميثانول: حمض الخليك الجليدي) إلى الخلايا بينما vortexing ل. ثم يضاف 5 مل أكثر من تثبيتي دون vortexing لليصبح المجموع 10 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة الخلايا طاف و resuspend. إضافة 5 مل من تثبيتي لكل أنبوب.
- أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة الخلايا طاف و resuspend. إضافة 5 مل من تثبيتي لكل أنبوب. ويمكن الآن خلايا خزنها في 4 درجة مئوية لمدة سنة واحدة.
- التعديل في البروتوكول: harvesti كروموسومنانوغرام من خطوط الخلايا lymphoblastoid
- تنمو الخلايا وفقا لظروف زراعة خلية معينة. (استخدام قارورة مناسبة لكمية الخلايا المستزرعة). عندما وصلت إلى مرحلة الخلايا لوغاريتمي (بعد حوالي 2 أيام انقسام الخلايا)، إضافة 10 ميكرولتر / مل من Colcemid إلى قارورة ثقافة الخلية.
- التعديل في البروتوكول: حصاد كروموسوم من الدم الكامل
راصة دموية نباتية (PHA)، وكتين المستمدة من اللوبيا الحمراء، هو mitogen قوية لT-16 الخلايا البشرية. 72 ساعة بعد إضافة PHA للثقافة، حوالي 45٪ من الخلايا في مرحلة S. هذا يمثل ذروة النشاط التفتلي، و هو النقطة المثلى التي لحصاد للدراسات كروموسوم. mitogens أخرى مثل الفتلاق (1-10 ميكروغرام / مل) يمكن استخدامها عند تحليل الخلايا البائية 17،18.- جمع ما لا يقل عن 1 مل من الدم الكامل في الأخضر أعلى الصوديوم أنبوب الهيبارين. استخدام في غضون 3 أيام بعد جمع. متجر الدم في RT الامم المتحدةسمسم جاهزة للاستخدام.
- قسامة 0.25 مل من الدم الكامل في 10 مل من وسائل الإعلام RPMI كاملة تحتوي على L-الجلوتامين (20٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 1٪ fungizone، و 1٪ PHA). الثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- التعديل في البروتوكول: حصاد كروموسوم من نخاع العظام
تحليل وراثي خلوي على نخاع العظم هو مفيد في كثير من الاضطرابات الدموية الخبيثة مثل مراقبة استنساخ غير طبيعي صبغويا قد يكون التشخيص لنوع معين من سرطان الدم. وتستخدم الدراسات كروموسوم أيضا لتقييم تطور المرض مثل بداية الأزمة الانفجار والاستجابة للعلاج. منذ خلايا نخاع العظم يتم تقسيم بنشاط، لا التحفيز mitogen ضروري 9،19. لسرطانات الدم الحادة يتم تعيين 24 و 48 ساعة الثقافات أيضا.- جمع ما لا يقل عن 1 مل من نخاع العظام في كبار الخضراء الصوديوم أنبوب الهيبارين. قسامة 0.25 مل من نخاع العظام في 10 مل من وسائل الإعلام RPMI كاملة تحتوي على L-الجلوتامين (20٪ مصل الجنين البقري، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 1٪ fungizone). الثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
2. إعداد شريحة وتلطيخ الصلبة
وهناك تقييم السريع للشريحة ممثل واحد تقديم معلومات عن نوعية المحصول قبل الاستمرار في إجراءات أخرى مثل G-النطاقات، FISH، [ك]، أو SKY. بعض المختبرات تفضل وصمة عار الصلبة الخلايا لحصاد سريع وتقييم كروموسوم. بدلا من ذلك، يمكن استخدام المجهر النقيض من المرحلة لهذا التحليل. من الأفضل إعداد الشرائح عندما تكون الرطوبة حوالي 50٪ ودرجة الحرارة المحيطة (20-25 درجة مئوية).
- الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. إزالة طاف حتى 0.3-0.5 مل فقط بقايا.
- بعد إعادة التعليق بلطف بيليه، ماصة ثلاث قطرات من تعليق خلية من مسافة حوالي 2 في على شريحة الذي يميل بزاوية مقدارها حوالي 45 درجة، والسماح للتعليقللفة عبر الشريحة. إضافة قطرة واحدة كبيرة من مثبت الطازجة كاروني على الشريحة.
- تجف الجزء الخلفي من الشريحة على منشفة ورقية ثم الجلوس الشريحة لتجف لمدة 10 دقيقة على الأقل. يجب أن تكون الشريحة تجف تماما.
- إعداد جديدة تلطيخ الحل بالغيمزا (3:1 نسبة الاحتياطي جور وبالغيمزا صمة عار). وضع الشرائح على رف تلطيخ. تغطية الشريحة بأكملها في حل تلطيخ بالغيمزا. دعونا تبقى الشرائح في حل تلطيخ لمدة 5 دقائق. شطف الشرائح مع الماء المقطر، واستنزاف، والسماح للهواء الجاف.
- إضافة 4 قطرات من Permount وانزلاق الغطاء إلى الشريحة. تأكد من عدم وجود فقاعات تحت ساترة. الفائض Permount يمكن إزالتها مع منشفة ورقية.
- تحليل الخلايا تحت المجهر تحت ضوء 10X والتكبير 100X. إذا كانت الخلايا الطورية وفيرة وانتشار جيدا، والشرائح المتبقية يمكن استخدامها لإجراءات تجريبية أخرى.
3. G-التطويق باستخدام التربسين وبالغيمزا (GTG)
<ع> التربسين هو انزيم بروتين الذي يبدل طبيعة الهستونات الكروماتين الحقيقي في مناطق الحمض النووي مع ارتفاع النشاط النسخي الناتجة عن ذلك. تلطيخ بالغيمزا التالية، سوف تظهر هذه المناطق كما العصابات الخفيفة. سوف ونين مكثف للغاية مع النشاط النسخي ضئيلة أو معدومة (المغاير) لديها جزء كبير من الهستونات لحمايتها من التربسين وبالتالي سيكون وصمة عار على نحو مظلم التالية بالغيمزا تلطيخ. من الضروري في البداية G-الفرقة شريحة واحدة لمراقبة الأوضاع وضبط توقيت التربسين إذا لزم الأمر لالشرائح اللاحقة.- إضافة الحلول التالية إلى 4 الجرار Coplin.
جرة # 1 = 30 مل من 1X HBSS و 4 مل من التربسين 10X (0.5٪)
جرة # 2 = 50 مل من 1X HBSS
جرة # 3 = 45 مل من 1X HBSS و 5 مل من مصل بقري جنيني
جرة # 4 = 50 مل من 1X HBSS - تزج كل شريحة في جرة # 1 لمدة 5 ثوانى، شطف سريع في جرة رقم 2، وترك كل شريحة في جرة # 3 لا يقل عن 30 ثانية، شطف سريع في جرة # 4 ثم تسمح الشرائح لتجف.
- إعداد FRESح بالغيمزا تلطيخ الحل (3:1 نسبة الاحتياطي جور وبالغيمزا صمة عار). وضع الشرائح على رف تلطيخ. تغطية الشريحة بأكملها في حل تلطيخ بالغيمزا. دعونا تبقى الشرائح في حل تلطيخ لمدة 5 دقائق.
- شطف الشرائح في الماء المقطر في نفس الترتيب الذي كانت ملطخة. تسمح الشرائح لتجف لمدة 10 دقيقة. يجب أن تكون الشريحة تجف تماما.
- إضافة 4 قطرات من Permount وانزلاق الغطاء إلى الشريحة. تأكد من عدم وجود فقاعات تحت ساترة. الفائض Permount يمكن إزالتها مع منشفة ورقية.
- تحليل الخلايا تحت المجهر تحت ضوء 10X والتكبير 100X. ضبط توقيت التربسين من بقية الشرائح استنادا إلى نتائج من الشريحة الأولى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ينتشر الطورية جودة عالية ضرورية لتحليل كروموسوم. وفحص الكروموسومات ينتج الناجحة التي تنتشر بشكل جيد ومورفولوجيا كروموسوم مناسبة. الكروموسومات بشكل صحيح G النطاقات تحتوي على ضوء سمات وأنماط النطاقات الظلام.
الشكل 1. A انتشا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لقد استخدمت الإجراء الحالي لكروموسوم بمعزل عن خلايا الكائنات الحية المختلفة، بما في ذلك أنواع مختلفة خلية تم الحصول عليها من الإنسان، المكاك وهو قرد اسيوي والجرذان، والفئران 11،20-22. يتم توفير بروتوكول قياسي، ولكن قد يحتاج بعض الخطوات الرئيسية والمتغيرات التي يتعين تعديلها لهذه الأنواع المختلفة من الخلايا. عدة خطوات محددة هي الحاسمة في كل من الكروموسومات وإعداد G-النطاقات لضمان جودة أفضل ما يمكن من النتائج. واحدة من المتغيرات التي يمكن أن تؤثر على الفحص هو فترة حضانة C...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وقدم العمل المبين في هذا المخطوط بفضل تمويل من مؤسسة باتريك تايلور F..
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5٪ Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| أقراص العازلة Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| جهاز طرد مركزي 5810 | إيبندورف | ||
| ميثانول | كاليدون مختبر كيماويات | 6700130 | |
| حمض الخليك الجليدي | كراكيلر العلمي | 11-9508-05 |
المراجع
- Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
- Nussbuam, R., et al. Genetics in Medicine: 7th Edition. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).
- Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
- Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
- Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
- Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
- Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21. PubMed Health. , (2010).
- Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
- Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
- Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
- Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
- Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
- Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
- Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
- Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
- Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
- Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , ACT. Houston, TX. (1997).
- Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).
- Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
- Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
- Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
- McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
