مقالة منهجية

تحليل دورة الخلية الحية من

13.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50239

⸱

مايو 19, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Michigan

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

بروتوكول للتحليل دورة الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأنسجة باستخدام الصوتية أقلم التركيز عداد الكريات. هذا البروتوكول يوفر في الوقت نفسه المعلومات حول حجم الخلية النسبي، عدد الخلايا، والمحتوى الحمض النووي ونوع من الخلايا عن طريق تتبع نسب أو الأنسجة التعبير محددة من البروتينات الفلورية في الجسم الحي.

الملخص

وقد التدفق الخلوي تستخدم على نطاق واسع للحصول على معلومات حول محتوى الحمض النووي في عدد السكان من الخلايا، إلى استنتاج النسب المئوية النسبية في مختلف مراحل دورة الخلية. وقد تم تمديد هذه التقنية بنجاح إلى الأنسجة الإنقسامية من طراز كائن ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات الجينية من تنظيم دورة الخلية في الجسم الحي. عندما يقترن مع نوع من الخلايا المحددة التعبير بروتين فلوري والتلاعب الجيني، يمكن للمرء الحصول على معلومات مفصلة حول الآثار المترتبة على عدد الخلايا، حجم الخلية ودورة الخلية الإلغاء في الجسم الحي. ومع ذلك فقد اعتمدت هذه الطريقة الخلية الحية على استخدام الخلية نفاذية هويشت 33342 صبغ الحمض النووي الإقحام، مما يحد من المستخدمين إلى أجهزة قياس التدفق الخلوي مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. قمنا بتعديل هذا البروتوكول على استخدام الخلية الحية صبغ الحمض النووي أحدث وVybrant DyeCycle البنفسج، متوافقة مع البنفسج الليزر 405nm وأكثر شيوعا. بروتوكول المعروضة هنا يسمح لكفاءة تحليل دورة الخلية إلى جانب الخليةنوع، حجم الخلية النسبي والمعلومات عدد الخلايا، في مجموعة متنوعة من الأنسجة ذبابة الفاكهة. هذا البروتوكول تمتد دورة الخلية تقنية مفيدة لتحليل الأنسجة الحية ذبابة الفاكهة إلى محلل الفوق الصغيرة، والصوتية أقلم التركيز عداد الكريات، والتي يمكن تشغيلها وصيانتها على نطاق و-LAB واحد.

المقدمة

التدفق الخلوي يمكن أن تستخدم لقياس بقاء الخلية، حجم الخلية النسبي، والمحتوى الحمض النووي والتعبير بروتين فلوري في السكان الخلية الحية. ونظرا لتكرار الحمض النووي النووية خلال S-المرحلة، معلومات عن محتوى الحمض النووي في السكان من الخلايا يمكن استخدامها لاستنتاج النسب المئوية النسبية في مختلف مراحل دورة الخلية 1-3. وقد أصبح هذا الأسلوب حجر الزاوية في تحليل دورة الخلية في نظم نموذج من الخميرة إلى الثدييات.

أصبح ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن نظام نموذجا ممتازا لالوراثية في التحليلات المجراة من تنظيم دورة الخلية. الأدوات الجينية الواسعة المتاحة في الذباب تسمح للتلاعب الأنسجة أنيقة محددة زمنيا وينظم من المنظمين دورة الخلية في الجسم الحي جنبا إلى جنب مع الفلورسنت نسب البروتين على أساس تتبع 4-6. وقد استخدم التدفق الخلوي لدراسة محتوى الحمض النووي في عدد من أنواع الخلايا ذبابة الفاكهة، بما في ذلك endoreplicating الخلايا والخلايا الإنقسامية مثقف 7،8. وقدم تقدما هاما للدراسات في دورة الخلية الحية من قبل دي لا كروز وادغار، مع وضع بروتوكول لتحليل تدفق cytometric من العيش مضاعفا ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي 9،10، وهو البروتوكول الذي تم استخدامها وتكييفها من قبل العديد من مختبرات. هذه التقنية، عندما يقترن الوراثية في الجسم الحي تتبع النسب عن طريق محرض التعبير بروتين فلوري ووضع العلامات المحددة الأنسجة، ويسمح احد للحصول على معلومات حول آثار التلاعب الجيني في العام الخلية مضاعفة الوقت، وحجم الخلية وتحديد التوقيت الدقيق لمراحل دورة الخلية في الجسم الحي 9 ، 11. ومع ذلك فقد اعتمدت هذه الطريقة حتى الآن على استخدام الخلية نفاذية هويشت 33342 صبغ الحمض النووي الإقحام إلى وصمة عار وتحديد الحمض النووي في الخلايا الحية، والتي حدت مستخدمين تتدفق cytometers مع ليزر الأشعة فوق البنفسجية قادرة على إثارة صبغ هويشت. وتوجد عموما هذه فقط في مطابقة (أي دينار بحريني FACS VANTAGE، BD FACSAria) أو مكلفة متعدد الألوان أنظمة الفوق (أي BD LSR)، والتي تتطلب عادة دعم المرافق المؤسسية الأساسية التدفق.

قمنا بتعديل بروتوكول المستندة إلى هويشت لاستخدام صبغة DNA الخلية الحية الجديدة من إينفيتروجن، Vybrant DyeCycle البنفسجي. هذه الصبغة هي متوافقة مع البنفسجي 405 نانومتر ليزر، أكثر شيوعا في تحليل الفوق أصغر والمتاحة في الصغيرة محلل الفوق مكتفية ذاتيا، والصوتية أقلم التركيز عداد الكريات. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لتحليل دورة الخلية التي يمكن أن يقترن مع نوع من الخلايا، حجم الخلية، عدد الخلايا وتحليل النسب في مجموعة متنوعة من الأنسجة ذبابة الفاكهة خلال مراحل مختلفة من التطوير باستخدام DyeCycle البنفسج وأقلم. هذا البروتوكول يوسع عدد من cytometers مناسبة لمثل هذا التحليل مع الأنسجة ذبابة الفاكهة ويقدم أمثلة عن كيفية هذا النوع من تحليل دورة الخلية الحية يمكن تعديلها لأنواع الأنسجة الإضافية ومراحل النمو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. يطير تربية

  1. الصليب تطير من المورثات المرغوب في قنينات بلاستيكية ضيقة مع 10 مل الخميرة الغلوكوز متوسطة 3 أو غيرها من وسائل الاعلام الغنية بالبروتين من اختيارك. ووصف واسعة ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا أدوات متاحة للأنسجة التعبير محددة ونسبها البحث عن المفقودين في الجسم الحي مع فلوري بروتين تعبير بالتفصيل 4،5 في مكان آخر. نقل الآباء إلى قارورة الطازجة يوميا للحصول على سلسلة من 24 مجموعات ذرية الموارد البشرية، أو لمزيد من التدريج الدقيق، وجمع الأجنة على لوحات أجار ونقل اليرقة حديثة الفقس إلى قارورة كما هو موضح 10. لضمان شروط موحدة عبر التجارب وتجنب الاكتظاظ، ينبغي أن العدد الإجمالي للذرية F1 في قنينة واحدة يكون هناك أكثر من 100. اعتمادا على تصميم الوراثية من التجربة، والحفاظ على قارورة في حاضنة مناسبة حتى المرحلة التنموية المنشودة.
  2. جمع حيوانات التجارب: سوف تحتاج يرقات ناضجة في 3 ش اليرقاتالطور (L3) في حوالي 110-120 ساعة من التطوير لتشريح اليرقات أو أبيض prepupa (WPP) للانطلاق العذراء دقيقة. تغييرات دراماتيكية دورة الخلية، بما في ذلك التحول إلى دولة غير التكاثري تحدث في timepoints متميزة خلال مسخ 12،13. لذلك التدريج الصحيح للخادرة (في حدود 1 ساعة التنمية) هو الأساسي للبيانات دورة الخلية استنساخه أثناء التحول. WPP يناظر 0 ساعة بعد تشكيل خادرة (0 ساعة APF) كما هو مبين في الشكل 1، لوحة I. اجمع WPP في طبق بيتري 35 ملم على Kimwipe مطوية الرطب مع 2.5 مل من الماء للحفاظ على بعض الرطوبة. العمر خادرة حتى المرحلة المرغوبة (ساعات APF) في درجة حرارة مناسبة. لاحظ أن التنمية العائدات 1.2 مرات أسرع في 29 ° C و 2.2 مرات أكثر ببطء عند 18 درجة مئوية مما كانت عليه في معيار 25 ° C 14.
  3. الحيوانات حرارة صدمة لتنشيط للصدمة الحرارة flipase (HS-FLP) الناجم عن إعادة التركيب لنسب لتعقب الحيوانات المستنسخة إذا لزم الأمر 9،11. لللصدمة الحرارية لليرقة، اغمسوغرقت تماما قارورة في حمام مائي (وضعت في 37 درجة مئوية) وضمان اليرقات. لللصدمة الحرارية للخادرة، وختم طبق بيتري مع parafilm ويغرق بالكامل في حمام مائي. تأكد من إزالة Parafilm بعد للصدمة الحرارية، التي تتيح تبادل الأكسجين الكافي للبقاء الحيوان. مدة للصدمة الحرارية يعتمد على النشاط من التحوير flipase المستخدمة وعدد من الحيوانات المستنسخة المطلوب. نحن نستخدم بشكل روتيني 7-8 دقيقة لإحداث "FLIPOUT" النسب تتبع استنساخ 15 في اليرقات مع HS-FLP التحوير على الكروموسوم الأول و2-4 دقيقة للصدمة الحرارة من الشرانق في 35 أطباق ملم، في حين أن HS-FLP التحوير على الكروموسوم الثاني يتطلب 20 دقيقة. الصدمة الحرارية للحصول على أرقام مماثلة من الحيوانات المستنسخة.

معدل انقسام الخلايا وتوقيت تشريح يحدد حجم استنساخ في كل الأنسجة. في ظل الظروف العادية، نجد أن الحيوانات المستنسخة التي يسببها في الجناح اليرقات مع الحد الأدنى الصدمة الحرارية 20 (باستخدام HS-FLP التحوير على الكروموسوم الثاني) وdissecفي وقت لاحق تيد 48 ساعة، تحتوي على ما يقرب من 20-30 استنساخ فصل بشكل جيد مع أحجام تتراوح ما بين 10 خلايا لكل استنساخ لخليتين في استنساخ، بمتوسط ​​حوالي أربع خلايا في استنساخ. في المقابل، 7 دقائق للصدمة الحرارة مع نفس HS-FLP التحوير من الشرانق في طبق بتري في 0 ساعة APF تشريح بعد مرور 36 ساعة، غلة فصل الحيوانات المستنسخة جيدا (حوالي 15-25) تتراوح بين سنة وأربع خلايا بمتوسط من 2.2 في استنساخ الخلايا. هذه البيانات يمكن استخدامها لتحديد متوسط ​​الخلية مضاعفة الوقت للأنسجة تحت الدراسة.

2. تشريح

  1. نقل بلطف اليرقات / الشرانق إلى الزجاج واضحة طبق تشريح تحتوي على 1X PBS.
  2. باستخدام مجهر تشريح وافرة ضوء، فهم بلطف بواسطة يرقة البطن مع اينوكس حاد # 5 forcep، وقطع الثالثة الأمامي مع المقص الصغير، وعكس الثالث الأمامي بالضغط على منطقة الفم إلى الداخل تجاه الخلفي في حين الضغط على اليرقات بشرة ثابت (الشكل 1A). إزالة بعناية opaquه الدهون في الجسم والقناة الهضمية أي المتبقية لزيادة وضوح من الأنسجة المطلوب، مثل الجناح، العين أو الدماغ. تشريح الأنسجة المطلوب؛ إزالة نظيفة أجنحة من القصبة الهوائية وبشرة مع ملقط، من عيون-السنانير الفم، أو الدماغ من العينين (الشكل 1G).
  3. لتشريح خادرة؛ استخدام forcep لفهم بلطف خادرة من قبل الطرف الأمامي من حالة العذراء حيث هناك فقاعة الهواء، لتجنب إتلاف خادرة داخل (الشكل 1C). ملقط أو مقص الصغرى في اليد معارضة يمكن أن تستخدم للمساعدة في موقف خادرة عائمة لاستيعاب السليم. خفض نظيفة من خلال الطرف الخلفي للخادرة مع مقص الجزئي. وينبغي بذل هذا الخفض مستعرضة في زاوية طفيف باتجاه الجزء الظهري للحيوان، للافراج عن الضغوط الداخلية دون فرض الدهون histolyzed إلى الأنسجة المطلوب في الصدر والرأس. قطع بعناية على طول متوسط ​​الظهرية، وتجنب الأجنحة الأمامية ومجمع العين والدماغ. إزالة بعناية خادرة من العذراءحالة على استيعاب الحافة الخلفية من البشرة العذراء وإخراجه من حالة العذراء (1D الشكل). كزة ثقب صغير في الجزء الأمامي إهاب إلى مجمع العين والدماغ مع ملقط. باستخدام ماصة باستير الزجاج مع لمبة المطاط، وغسل بلطف PBS حل تشريح من خلال خادرة تشريح جزئيا لازالة الدهون histolyzed وأي نوع من الأنسجة المتبقية الأمعاء. هذا أيضا يزيت بشكل فعال ماصة الزجاج مع الدهون والبروتينات، مما يقلل من الإصابة الأنسجة تشريح من الالتصاق إلى الداخل من ماصة الزجاج في وقت لاحق.
  4. للحصول على أجنحة العذراء، إهاب تخيم على الجناح والجناح نفسه يجب نزعها من خادرة (الشكل 1E). ويمكن أن يتم هذا من خلال عقد خادرة بنسبة الرأس مع forcep واحد أثناء استخدام forcep آخر إما إلى فهم الطرف الأكثر الخلفي من إهاب الجناح وسحب أو المناورة forcep تحت جناح قرب المفصلي قبل الإطاحة به من جانب الذبيحة (Figure 1E). ومن ثم يمكن خفض الجناح أو تمزق في المفصلي لإزالته من الجسم ووضع في كومة بعيدا عن الذبائح وغيرها من المواد.
  5. للحصول على عيون العذراء أو الدماغ، وغسل خادرة حتى يصبح مجمع العين والدماغ طردت وخالية من خادرة (الشكل 1F، 1H). باستخدام forcep، وسحب بلطف العين العذراء بعيدا عن الدماغ وحفظ الأنسجة المطلوب.
  6. لا يستغرق وقتا أطول من 45 دقيقة لتشريح كل عينة، كما يصبح أقل دقة النتائج وتترك الخلايا لفترة أطول في برنامج تلفزيوني بعد فتح الحيوانات.

3. الأنسجة التفكك والحمض النووي تلطيخ

  1. باستخدام ماصة باستير مشحم، بعناية نقل الأنسجة تشريح إلى 0.5 مل من الحمض النووي لايف الحل وصمة عار في 5 مل أنبوب البوليسترين (الشكل 1G). نقل اقل PBS ممكن (أقل من 300 ميكرولتر) في الحل وصمة عار الحمض النووي، والتخفيف من التربسين سوف تمنع تفكك الأنسجة.
  2. احتضان الأنابيب مع SHAKIنانوغرام في 23 درجة مئوية في 500 دورة في الدقيقة (نستخدم إيبندورف Thermomixer).
  3. احتضان لمدة 70 دقيقة، ثم دوامة بلطف لمدة 5 ثوانى على سرعة متوسطة (الإعداد من 5). سوف vortexing لالمفرط يسبب تمزيق الخلايا وشكل الحطام، بينما كيل vortexing لسيؤدي إلى كتل الخلايا. عودة العينات إلى اهتزاز في 23 درجة مئوية في 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 إلى 20 دقيقة إضافية قبل vortexing للهم مرة أخرى لمدة 5 ثوانى بسرعة 5.
  4. للأدمغة وعيون العذراء أقدم من 36hAPF، لا بد من تعديل بروتوكول. فصل الأنسجة في الحمض النووي الحل وصمة عار في 23 درجة مئوية في 500 دورة في الدقيقة ل45-60 دقيقة في 1.7 مل أنابيب microcentrifuge. ثم واحد تلو الآخر يدويا فصل أجزاء كبيرة من الأنسجة عن طريق نقل إلى طبق تشريح جنبا إلى جنب مع حوالي 50 ميكرولتر الحمض النووي الحل وصمة عار وpipetting لالسريع صعودا وهبوطا مع رسمها يدويا ماصة باستير 16 (حوالي 100-150 افتتاح ميكرون). نقل كل عينة فصلها مع بقية 0.5 مل من الحمض النووي الحل وصمة عار في أنبوب مل 5. احتضان ل45 إضافية-30 دقيقة (ما يصل إلى 90 دقيقة من إجمالي وقت الحضانة) في 23 درجة مئوية مع اهتزاز عند 500 دورة في الدقيقة حتى كتل لم تعد مرئية.
  5. يجب أن يكون كاملا عينات فصل عدد قليل جدا من قطع مرئية كبيرة من الأنسجة، على الرغم من ملاحظة أن سوف ديكي شفافة بشرة الجناح العذراء لا فصل.

4. التدفق الخلوي

  1. بدوره على عداد الكريات أقلم وفتح البرنامج أقلم. وينبغي أن تتحول الليزر عداد الكريات على طريق القائمة بدء التشغيل، ويجب أن يتم تنفيذ اختبار الأداء اليومي مع الخرز تتبع الأداء مع عشرات كافية قبل كل يوم من الحصول على البيانات. وينبغي أن تكون مستويات السوائل على الأقل نصف كاملة والنفايات أفرغت قبل اختبار الأداء. ويمكن الاطلاع على تفاصيل لبدء التشغيل، معايرة وتشغيل أقلم في دليل المستخدم أقلم ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
  2. تصميم TE جديدةmplate من خلال خلق المؤامرات 4 نقطة و 2 رسوم بيانية في مساحة عمل فارغة مع المعلمات مبين في 4.3، أو تحديد قالب مصممة مسبقا مناسبة للتجربة، وبيان عدد العينات التي سيتم جمعها. قدمنا ​​قوالب أقلم (الملفات في. الحصول على الشكل) ليعيش ذبابة الفاكهة تحليل دورة الخلية مع Vybrant DyeCycle البنفسج وGFP أو طلب تقديم العروض التعبير في الملحق I.
  3. تشمل القوالب المتوفرة أربع قطع نقطة واثنين من رسوم بيانية مع المعلمات مبين في الشكل 2. قنوات لكشف ما يلي: FSC وSSC - مبعثر إلى الأمام والجانب مبعثر تشير إلى حجم الخلية وغشاء التعقيد، VL1 الارتفاع (H)، عرض (W) والمنطقة (أ) - تشير إلى الإثارة ليزر البنفسج من DyeCycle تلطيخ البنفسج الحمض النووي، وBL1 -A - الليزر الأزرق القناة 1 المنطقة، مشيرا إلى GFP مضان. القالب المنصوص عليها تحليل كراسة الشروط غير مطابقة للنموذج لتحليل GFP، إلا أنه يستخدم القناة الليزر الأزرق 3 (BL3-A)، والذي هو optimiزيد للكشف عن طلب تقديم العروض.
  4. المؤامرات نقطة في قوالب لديها بوابات لتقييد التحليل للسكان والمطلوب للحد من الحطام وخلية كتل من تحليل (الشكل 2). بوابة 1 يستثني الحطام وكتل على أساس SSC مقابل FSC (الشكل 2A). بوابة 2 يستثني الخلايا غير ملوثين، خلايا أفكارك G1 الفرعية وكتل الخلايا استنادا إلى تحديد singlets (VL1Area مقابل VL1Width) (الشكل 2B). بوابة 3 هو بوابة المشتقة، تشمل الخلايا داخل البوابات 1 و 2، ويحدد GFP (أو RFP) خلايا السلبية مقابل محتوى الحمض النووي على أساس VL1Height (الشكل 2C). بوابة 4 هو بوابة المشتقة، تشمل الخلايا داخل البوابات 1 و 2، ويحدد GFP (أو RFP) الخلايا إيجابية مقابل محتوى الحمض النووي (الشكل 2C). وتستخدم المؤامرات نقطة من حجم الخلية كما تم قياسها بواسطة GFP (أو RFP) مقابل مبعثر إلى الأمام (FSC) لتوليد جيتس 5 و 6 (الشكل 2D). رسوم بيانية مؤامرة محتوى الحمض النووي اثنين على العد المحور السيني وخلية على Y-AXIق للسكان يحددها بوابة 3 وبوابة 4. (الشكل 2E و2F) المدرج الإحصائي يمكن أيضا أن يدرج لحجم الخلية إذا رغبت (لا يظهر). للاطلاع على حجم رسوم بيانية الخلية، يجب تعيين السكان إلى غيتس 5 و 6، بالتآمر FSC على المحور السيني وتعول على المحور الصادي.
  5. ضبط التسجيل بحيث يتوقف عند 10،000 GFP أو طلب تقديم العروض الأحداث الإيجابية (وهذا سوف يكون بوابة 4، وبوابة المشتقة من بوابة 1، بوابة 2 وبوابة إيجابية GFP أو طلب تقديم العروض). كانت 10،000 GFP الأحداث الإيجابية تقليديا هدفا لمحات جودة المنشور 9،11 - يتراوح من 6،000. نقترح استخدام ما لا يقل عن 15 أجنحة أو العينين، أن ما يقرب من 50٪ GFP إيجابية للحصول على ما يكفي من بوابة 4 أحداث 10 لمحات ذات جودة عالية. ومع ذلك، لقد حصلنا على البيانات بنجاح واضحة لأولي تحليل دورة الخلية من عدد قليل من 6 أجنحة (الشكل 3A). ضبط مستوى الصوت لاقتناء 300 ميكرولتر، وهذا سوف نستخدم حوالي 460 ميكرولتر من إجمالي عينة مل 0.5. تاويبين بلي 2 إعدادات عتبة والجهد المناسب المقدمة في قالب على سبيل المثال في الشكل 2.
  6. تشغيل العينات في حساسية معيار أو حساسية عالية 100 ميكرولتر / دقيقة وقياسية. نجد شيئا يذكر لولا الاختلاف في تحليلنا مع مستويات حساسية مختلفة. ونظرا لتركز الصوتية من الخلايا، وهذا يمكن عداد الكريات قياس بدقة عينات في معدلات تدفق عالية جدا. على عكس cytometers التقليدية، نجد أي حل وسط من خلال الحصول على البيانات بسرعات تصل إلى 1،500 الأحداث في الثانية الواحدة. ملفات البيانات المسجلة التي يولدها البرنامج أقلم هي في صيغة السفح، وهو متوافق مع معظم الخلية دورة النمذجة البرمجيات.

5. تحليل البيانات

  1. رسوم بيانية من حجم الخلية ومحتوى الحمض النووي لGFP (أو RFP) السكان الإيجابية والسلبية يمكن مقارنة. ويمكن الطبقات يدويا عن طريق النسخ واللصق باستخدام برنامج أدوبي فوتوشوب. إذا تم تعيين المحور ص إلى تلقائي، فإن Y-المحور النطاق مع حighest العد لكل عينة. تتراكب اثنين من الرسوم البيانية مع مجموعة العمودي إلى autoscale يخلق تراكب رسوم بيانية مع المحاور المحددة لأقصى العالمية لكل السكان. وهذا يسمح المقارنة البصرية من السهل على التغيرات النسبية في دورة الخلية الإلغاء، حتى عندما مجموع أعداد الخلايا من GFP إيجابية وGFP السكان السلبية ليست ما يعادلها (على سبيل المثال في الشكل 3B). بدلا من ذلك، عرف المحور الصادي (الخيار اليدوي المحور الصادي) يمكن تعيين إلى قيمة ثابتة لرسوم بيانية. في هذه الحالة يمكن مقارنة أرقام الخلية النسبي لاثنين من السكان. كما يستخدم أقلم حجم محدد من عينة لكل شوط، الكمي المطلق للخلايا لكل شوط، في كل باب مع النسب المئوية من مجموع السكان، ويمكن الحصول عليها من جدول الإحصاءات ولدت تلقائيا أثناء تشغيل في مساحة العمل (على سبيل المثال في الشكل 3F ). ويمكن أيضا المؤامرات نقطة ورسوم بيانية تكون الطبقات بسهولة في البرنامج أقلم، ببساطة عن طريق سحب واسقاط عينات مختلفة من اله عينة القائمة ملف في الحق على الرسم البياني المطلوب من عينة مفتوحة للمقارنة. ولكن لتراكب مجموعات سكانية فرعية من داخل عينة واحدة (أي GFP إيجابية وسلبية GFP داخل نفس العينة)، ونحن نستخدم فوتوشوب.
  2. طريقتين يمكن استخدامها للعثور على النسب المئوية النسبية في مختلف مراحل دورة الخلية بالنسبة لعدد السكان. وتعتمد الطريقة على تقريب المناطق التي يحددها المستخدم لتحديد حدود G1، S، G2 و> قمم G2. هذا الأسلوب يسمح تقديرات سريعة وسهلة من النسب داخل المناطق المعرفة من قبل المستخدم (الشكل 3E). وضعناها مناطقنا استنادا إلى اختبار مباشرة مع الخلايا كيه سي ذبابة الفاكهة، وصفت لS-المرحلة باستخدام إيثينيل-deoxyUridine (EDU) التأسيس. يستخدم الأسلوب الثاني طرف ثالث نماذج البرمجيات لتقدير توزيع دورة الخلية. كنا ModFitLT (فيرتي برمجيات البيت) البرمجيات على سبيل المثال، في الشكل 3F.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 2 نتائج ممثلة لعينة الجناح اليرقات، معربا عن GFP في النصف الخلفي من الأنسجة، وذلك باستخدام قالب GFP المقدمة. ويتم الحصول على نتائج مماثلة مع نوع الأنسجة نفسها، ونمط التعبير عن طلب تقديم العروض باستخدام طلب تقديم العروض قالب المقدمة (الشكل 3A). النماذج المقدمة والفولتية (الجدول 2) هي مناسبة لتحليل عيون اليرقات (الشكل 3B)، والعقول، والأجنحة، وكذلك عيون العذراء، والعقول (الشكل 3D) والأجنحة. يمكن أيضا إنشا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول الموصوفة هنا يسمح لتحليل دورة الخلية، حجم الخلية النسبي وعدد الخلايا في الأنسجة الحية النسبية ذبابة الفاكهة في مراحل النمو المختلفة. عندما يقترن هذا التحليل مع نوع من الخلايا المحددة التعبير بروتين فلوري أو النسب تتبع، ويمكن الحصول على معلومات مفصلة حول الاستجابات الخلوية لدورة الخلية حصيف أو اضطرابات النمو. وكدليل على المبدأ، ونحن تعطلت هدوء في الطيران الدماغ العذراء بالإعراب عن G1-S المنظمين دورة الخلية في GFP المسمى استنساخ الخلية، مما يؤدي إلى تكرار الحمض الن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نشكر عايدة دي لا كروز لتطوير وتدريس البروتوكول الأصلي الذي يستند هذا الإصدار 10. ويدعم عمل في مختبر من قبل المعاهد الوطنية للصحة Buttitta منحة GM086517.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<قوي>الجدول 1. الكواشف والأدوات المطلوبة.< / strong>< / span >

1 مل 10X Ca2 + < / sup> Mg2 + < / sup> PBS الحر (pH7.2)
9 مل 10X Trypsin-EDTA (Sigma)
5 & mu ؛ ل Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (لاحظ أن هذا هو 0.25X التركيز الموصى به لخلايا الثدييات. نجد أن التركيزات الأعلى سامة لخلايا <ذبابة >الفاكهة< >).فئة < / p>

10X Ca2 + < / sup> Mg 2 + < / sup> PBS مجاني (pH7.2): 1.37 مليون كلوريد الصوديوم ، 27 ملي كلوريد كلوريد ، 100 ملي مولار Na 2< / sub>HPO4< / sub> (ثنائي الأساسي) ، 20 ملي مولار KH2< / sub>PO4< / sub> (أحادي الأساسي) معدلة إلى الأس الهيدروجيني 7.2< / ص >

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
12 × 75 مم البوليسترين مستدير القاع 5 مل أنبوب اختبار BD Falcon3520585 مل أنابيب
Attune Acoustic Focus CytometerLife Technologies / Applied Biosystems4445315التكوين الأزرق / البنفسجي
Attune Cytometer Software (الإصدار 1.2.5) LifeTechnologies / Applied BiosystemsFree< / em>< strong>PC فقط
حبات تتبع الأداء Attune (5 × 106 حبات / مل) تقنيات الحياة / الأنظمة الحيويةالتطبيقية 4449754لاختبار الأداء اليومي
Dumont # 5 ملقط Inox أدوات العلوم الدقيقة11251-20
أطباق الأجنة 30 مم × 12 مم علوم المجهر الإلكتروني70543-30أطباق تشريح الزجاج
Eppendorf ThermomixerEppendorf022670051
محلول التربسين-EDTA (10x)SigmaT4174
Vannas-T & # 252 ؛ مقص الربيع bingen أدوات العلومالدقيقة 15003-08مستقيم 5 مم
Vybrant DyeCycle Violet StainLife Technologies / InvitrogenV35003
< td> FSC SSCBL1VL1
عتبة (x1000) < / td > < td > 100 < / td > <> 10 < / td > < td > 10 < / td > < td > 10 < / td > < / tr >
1150
< td colspan = "4" >< td colspan = "4" >< p class = "jove_step" > Live DNA Stain Solution (10 ml): < / p> < TD colspan = "4" >< جدول الحدود = "1" > < / tr > < td > الجهد (مللي فولت) < / td > < td > 2950 < / td > < td > 4250 < / td > < td > 1800 < / td>

الجدول 2. إعداد العتبة والجهد للتحليل في الشكل 2.< / strong>< / p>

المراجع

  1. Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
  2. Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
  3. Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34(2007).
  4. del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
  5. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  6. McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6(2004).
  7. Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
  8. Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
  9. Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
  10. de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
  11. Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
  12. Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
  13. Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
  14. Ashburner, M. Drosophila; A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Press. (1989).
  15. Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
  16. On-line Protocols of Protistology Workshop 2005 at The Marine Biological Laboratory [Internet]. , Woods Hole, M.A. Available from: http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm (2005).
  17. Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
  18. Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Attune DNA

مقالات ذات صلة