نحن هنا وصف عزلة cardiomyoctyes فأر بالغ باستخدام نظام نضح Langendorff. الخلايا الناتجة CA2 +-تسامحا، هادئة كهربائيا ويمكن أن يكون مثقف وtransfected مع-الغدة أو lentiviruses للتلاعب الجيني. ويمكن أيضا تحليل وظائفها باستخدام نظام MMSYS وتقنيات المشبك التصحيح.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد وفرت استخدام العضلية الأولية (CMS) في الثقافة تكملة قوية لنماذج الفئران من أمراض القلب في دفع فهمنا لمرض القلب. على وجه الخصوص، وقد أدت القدرة على دراسة توازن الأيوني، وظيفة القناة الايونية، استثارة الخلوية والإثارة، تقلص اقتران والتعديلات في ظروف المريضة والطفرات المسببة للمرض إلى رؤى كبيرة في أمراض القلب. علاوة على ذلك، فإن عدم وجود خط الخلية كافية لتقليد الكبار خلد مضادة، والقيود المفروضة على الأطفال حديثي الولادة مضادة (التي تفتقر إلى العديد من الخصائص الميكانيكا الحيوية الهيكلية والوظيفية من الكبار CMS) في الثقافة أعاقت فهمنا للتفاعل معقد بين مسارات الإشارات، القنوات الأيونية وخصائص مقلص في قلب الكبار تعزيز أهمية دراسة الكبار العضلية معزولة. هنا، فإننا نقدم طرق لعزل والثقافة، والتلاعب في التعبير الجيني عن طريق الغدانية-expreالبروتينات ssed، وتحليل وظيفي لاحقة من العضلية من الماوس الكبار. فإن استخدام هذه التقنيات تساعد على تطوير البصيرة الآلي في مسارات الإشارات التي تنظم استثارة الخلوية، كا 2 + ديناميات وانقباض وتوفير توصيف أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الكثير من أمراض القلب والشرايين.
المقدمة
خدموا نماذج الفئران من مرض القلب والأوعية الدموية كأدوات فعالة لتوضيح الآليات الأساسية المرض 1،2 فضلا عن تحديد الأهداف العلاجية المحتملة 1،3. على وجه الخصوص، واستخدام كلا النموذجين الفئران من أمراض القلب المكتسبة (مثل الضغط الزائد) 4،5 ونماذج الماوس المعدلة وراثيا قد تقدم فهمنا لمرض القلب 6-8. استخدام تقنيات زراعة الخلايا لدراسة الإشارات شلالات 3،9،10 وتغييرات في البروتينات الفردية التي تكمن وراء استثارة الخلوية والإثارة، تقلص اقتران في قلب 11-13 على مستوى خلية واحدة ويكمل في الجسم الحي نماذج الماوس. ومع ذلك، فإن عدم وجود خطوط الخلايا الكافية التي تعكس ه....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. Cardiomyocyte عزل
المواد (الشكل 1)
Microdissecting ملقط
ملقط الأنسجة
ملقط مرقئ حساسة
ملقط مرقئ
Microdissecting، مسننة، ملقط منحنية
مقص العاملة، على التوالي
مقص العاملة، منحني
15 مل أنابيب فالكون (5)
60 مم طبق بتري
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
شبكة النايلون - 400 ميكرون حجم المسام
قمع صغير
الشمع المغلفة، مضفر الحرير 4-0، 19 مم، 7-10 سم طويلة
إبرة تحت الجلد غير، نهاية حادة، 24 G أو إبرة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عزلة النتائج cardiomyoctyes الكبار في الخلايا على شكل قضيب، مخططة، وهادئة (لا ضرب عفويا) (الشكل 5A). والخلايا الميتة تبدو مدورة وسوف لا تكون موجودة التصدعات. خلايا هادئة يمكن أن يكون مثقف وtransfected مع اتش للتلاعب التعبير الجيني (أرقام 5B و5C). بعد 24 ساعة من الثقافة، لا يغير من التشكل من الخلايا الحية، فإنها لا تزال كا 2 +-تسامحا، ويمكن الخطى من قبل التحفيز المجال. مع الإجراء المقترح، يمكن تحقيق عائد من خلايا قابلة للحياة 80-90٪.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا التقرير، وصفناها التقنيات اللازمة لعزل ناجحة وثقافة الكبار مضادة من القلب الماوس. أسلوبنا يسمح لدراسة لاحقة من وظيفة CM واستثارة باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه. المعلمة الحرجة لدراسة وظيفة من الكبار مضادة هي الصحة ونوعية مضادة معزولة. كما هو موضح أعلاه، لدينا تقنيات تسمح لارتفاع العائد من الخلايا الوظيفية التي هي قابلة للتلاعب في التعبير الجيني باستخدام / عدوى lentiviral الغدانية في الثقافة، وتحليل استثارة الخلوية وظيفة مقلص.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كلوريد الصوديوم | سيجما | S7653 | |
| كلوريد البوتاسيوم | سيجما | P9333 | |
| كلوريد المغنيسيوم | سيجما | M8266 | |
| هيبس | سيجما | H3375 | |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | سيجما | S8282 | |
| D-الجلوكوز الحد الأدنى | سيجما | G8270 | |
| تورين | سيجما | T0625 | |
| 2،3-بوتانيديون مونوكسيم | سيجما | B0752 | |
| كولاجيناز ب | روش للعلوم التطبيقية | 11088807001 | |
| كولاجيناز دي | روش العلوم التطبيقية | 11088858001 | |
| البروتياز الرابع عشر من Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| الألبومين من مصل الأبقار | سيجما | A2153 | |
| كلوريد الكالسيوم | Sigma | C8106 | |
| الحد الأدنى من الوسائط الأساسية | Sigma | 51411C | |
| محلول الألبومين من مصل الأبقار | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| البنسلين الستربتومايسين | Sigma | P4333 | |
| وسائط الأنسولين ترانسفيرين السيلينيت الصوديوم ملحق | سيجما | I1884 | |
| كلوريد السيزيوم | سيجما | 289329< / أ> | |
| الغلوتامات | سيجما | G3291 | |
| الأدينوزين 5'-ملح المغنيسيوم ثلاثي الفوسفات | سيجما | A9187 | |
| الإيثيلين جلايكول بيس (2-amin &# 8211 ؛ ثيليثير) -N ، N ، N '، N '، N'-حمض رباعي الأسيتيك | Sigma | E3889 | |
| محلول هيدروكسيد السيزيوم | Sigma | 232041 | |
| محلول هيدروكسيد Tetraethylammonium | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor قناع مجهر زجاجي | Dohegan Optical Company Inc. | ملقط | |
| ، 5.5 بوصة ، 1 × 2 أسنان | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| ملقط مولوني - 4.5 بوصة (11.5 سم) منحنى طفيف طويل ، | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont # 3 ، Dumostar ، حجم الطرف 0.17 × 0.10 مم | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| ملقط البعوض باكر 5 بوصات مستقيم مسطح | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| مقص تشريح دقيق 4.5 بوصة منحني حاد / حاد | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| مقص تشريح دقيق 3.5 بوصة مستقيم حاد / حاد 20 مم | Roboz Scientific | RS-5907 |
المراجع
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse asce....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
