استهدفت-استريز التي يسببها صبغ التحميل (TED) يدعم تحليل الديناميات داخل الخلايا مخزن الكالسيوم عن طريق التصوير مضان. تستند هذه الطريقة على استهداف من إستيراز الكربوكسيل المؤتلف إلى الشبكة الإندوبلازمية (ER)، حيث أنه يحسن إماطة اللثام المحلية الاصطناعية منخفضة تقارب كا 2 + الأصباغ مؤشر في التجويف ER.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير المباشر من الكالسيوم مع ER-المستهدفة استريز المستحثة صبغ تحميل (TED)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تصور ديناميات الكالسيوم المهم أن نفهم دور الكالسيوم في علم وظائف الأعضاء الخلية. لدراسة ديناميات الكالسيوم، أصبحت الاصطناعية الفلورسنت كا 2 + المؤشرات شعبية. هنا علينا أن نظهر TED (= يسببها استهدفت-استريز صبغ التحميل)، وهي طريقة لتحسين الإفراج عن كا 2 + الأصباغ مؤشر في التجويف ER من أنواع مختلفة من الخلايا. حتى الآن، تم استخدام TED في خطوط الخلايا، والخلايا الدبقية، والخلايا العصبية في المختبر. قواعد TED على كفاءة، المؤتلف استهداف نشاط إستيراز الكربوكسيل عالية لمعة ER باستخدام ناقلات التركيبات التي Carboxylesterases صريح (CES). أحدث ناقلات TED تحتوي على عنصر أساسي من CES2 تنصهر لبروتين أحمر فلوري، وبالتالي تمكين المتزامن التصوير اللونين. يتم تصوير ديناميات الكالسيوم الحرة في ER في لون واحد، في حين يظهر هيكل ER المقابلة باللون الأحمر. في بداية الإجراء، والخلايا transduced مع الفيروسة البطيئة. وفي وقت لاحق، والخلايا المصابة لإعادة المصنف coverslips على لتمكين أخيرا التصوير الخلية الحية. ثم، يتم تحضين الخلايا الحية مع استر acetoxymethyl (AM-استر) شكل من الاسعار المنخفضة للتقارب كا 2 + المؤشرات، على سبيل المثال Fluo5N-AM، MAG-Fluo4-AM، أو ماج-Fura2-AM. يتم تشكيل النشاط استريز في ER يشق قبالة سلاسل الجانب مسعور من النموذج AM من كا 2 + المؤشر وماء صبغة الفلورسنت / كا 2 + معقدة والمحاصرين في التجويف ER. بعد صبغ التحميل، ويتم تحليل الخلايا في مقلوب ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي. و perfused الخلايا باستمرار مع حلول قارع الأجراس تشبه وديناميات الكالسيوم ER هي تصور مباشرة بواسطة الوقت الفاصل بين التصوير. يتم التعرف الافراج الكالسيوم من ER من انخفاض في كثافة مضان في المناطق ذات الاهتمام، في حين أن إعادة تعبئتها من مخزن الكالسيوم ER تنتج زيادة في كثافة مضان. وأخيرا، يتم تحديد التغير في كثافة الفلورسنت بمرور الوقت من خلال حساب ΔF / F 0.
المقدمة
من أجل حل الاستجابات الفسيولوجية الكالسيوم من ER، قمنا بتطوير استراتيجية جديدة لتحسين محاصرة من الكالسيوم الاصطناعية الأصباغ الحساسة في ER. تمكن الطريقة المباشرة وغير مدمرة في الوقت الحقيقي رصد الحر ER الكالسيوم في وجود الكالسيوم خارج الخلية.
وظيفة وإشارات من الكالسيوم ER
تم العثور على إشارات الكالسيوم في الخلية أنواع مختلفة، مثل خلايا العضلات، الخلايا العصبية والخلايا الدبقية وتتراوح الوظائف من التوسط تقلص العضلات لتورطه في انتقال متشابك في التعلم والذاكرة 1،2. التغييرات في ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا البروتوكول يدخل تطبيق TED إلى خطوط الخلايا، الخلايا العصبية قرن آمون والخلايا الدبقية القشرية. هو أفضل عندما يتم التعبير عن TED أداء ناقلات TED ثابت، على سبيل المثال بواسطة ناقلات lentiviral. ويرد وصف تخطيطي لطريقة TED في الشكل 4.
1. تحضير محاليل
وينبغي إعداد الحلول التالية قبل البدء، ويمكن تخزينها على النحو المشار إليه. ونحن عموما استخدام الزجاج المعقم والمواد البلاستيكية والمياه تعقيمها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوفر هذا البروتوكول نهجا غير التخريبية للتصوير مباشرة من حر ER الكالسيوم. انخفاض تقارب الاصطناعية كا 2 + يتم الافراج المؤشرات والمحاصرين في التجويف ER مع مساعدة من ER المستهدفة، المؤتلف نشاط انزيم استريز. تحسين التحميل من كا 2 + الأصباغ مؤشر إلى ER التجويف تمكن التصوير المباشر والسريع من ER ديناميات مخزن الكالسيوم.
أنواع الخلايا لTED
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد نوقشت مزايا وعيوب الأسلوب TED على نطاق واسع في المنشورات الحديثة 34،35. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المذكورة أعلاه، TED تلتف مشكلة تعطيل وperfusing الخلايا. وعلاوة على ذلك، لا بد من التأكيد على جانبين. مبدأ TED لER الكالسيوم التصوير يتطلب (1). التعبير المستهدفة من إستيراز الكربوكسيل النشطة في التجويف ER بمساعدة TED ناقلات بنيات و (2.) الإفراج كفاءة وتفضيلية من الاسعار المنخفضة للتقارب الاصطناعية AM-استرات الأصباغ الكالسيوم في التجويف ER.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG) BL567/3-1 وفريدريش باور شتيفتونغ. ونود أن نشكر روجر تسين Y.، معهد هوارد هيوز الطبي المختبرات في جامعة كاليفورنيا، سان دييغو لتزويدنا تاج RFP-T2. ونحن نعترف لله الحمد ديفيد بالتيمور، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا في باسادينا، وديدييه Trono، جامعة جنيف، جنيف، لتقديم لنا lentiviral البلازميدات FUGW، وpsPAX2/pMD2.G.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| (S) -3،5-DHPG (ثنائي هيدروكسي فينيل جلايسين) | Tocris | 0805 | |
| 5 '؛ -ATP-Na2 ، ATP ملح ثنائي الصوديوم هيدرات | Sigma | A26209-1G | |
| B-27 ، 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| كلوريد كاربامويل كولين (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
| حمض السيكلوبيازونيك (CPA) الصعود | العلمي | Asc-300 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | سيجما | D2650 | |
| DMEM مع Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| Dulbecco's PBS بدون Ca / Mg 1x | PAA | H15-002 | |
| مصل ربلة الساق الجنينية | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM ، 10 × 50 & mu ؛ ز | Invitrogen | F14204 | |
| Glutamate | Ascent Scientific | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham's F12 خليط العناصر الغذائية | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| Hank's BSS (1x) بدون Ca ، بدون Mg ، مع Phenol Red ، HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| مصل الحصان | SHD3250YK | Linearis | |
| Ionomycin Ca2 + < / sup> ملح | الصعود العلمي | Asc-116 | |
| الفئران EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2 الملحق 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| المتوسط العصبي | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127 ، امتصاص منخفض للأشعة فوق البنفسجية ، 2 جرام | Invitrogen | P6867 | |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
| Trypsin | ورثينجتون | LS-003707 | |
| مثبط التربسيني من جلايسين ماكس (فول الصويا) | Sigma | T6522 | |
| Materials< / strong> | |||
| النظام متحد البؤر: مجهر المسح الضوئي بالليزر المقلوب: FV1000 مع IX81 | Olympus | التكوين الخاص | |
| بالمستخدم النظام متحد البؤر: ليزر مجم الليزر FV10 وليزر الصمام الثنائي (405 ، 473 ، 559 ، 635) | أوليمبوس | التكوين الخاص بالمستخدم | |
| النظام متحد البؤر: رأس المسح FV10-SPD مع كاشف الطيف | التكوين الخاص | بالمستخدم أوليمبوس | |
| وحدة التحكم في السخان TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | للتحكم في سخان الحل |
| NIH ImageJ | WS Rasband ، ImageJ ، المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة ، http://rsb.info.nih.gov/ij/< / a> ، 1997-2006 | ||
| الهدف: UAPON20XW340 NA 0،7 WD 0،35 | Olympus | N2709100 | |
| الهدف: UPLFLN40XO | أوليمبوس | N1478700 | |
| الهدف: UPLSAPO60XO / 1.35 ، WD = 0.15 | أوليمبوس | N1480700 | |
| غرفة التروية ، | حسب الطلب | ||
| ، RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
| أنبوب التروية: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | للتروية |
| المضخة التمعجية MiniPlus 3 (4 قنوات) | جيلسون | n.a.perfusion | |
| سخان محلول مضمن واحد SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | يتم التحكم فيها بواسطة وحدة التحكم في السخان |
| أنابيب الشفط: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | لإدراج التروية |
| التسخين: Tempocontrol 37-2 رقمي ثنائي | القناة Pecon | n.a. |
المراجع
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calci....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
