تقييم الظواهر الاعصاب في ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الدوبامين عن طريق تسلق فحوصات والجامعة المناعية الدماغ

خصوصية المقايسات وصفها هنا تعتمد على استخدام خط الطيران GAL4 الذي يستغل متواليات التنظيمية من الجين هيدروكسيلاز التيروزين لتحقيق التعبير معينة في الخلايا العصبية الدوبامين ^3. هيدروكسيلاز التيروزين يحفز الخطوة الأولى ومعدل منظم للفي تركيب الدوبامين. مناعية TH في الكبار يتراكب الدماغ يطير مع أن الدوبامين، مما يجعل TH مرشح جيد لتحديد الخلايا العصبية DA في الجسم الحي (انظر على سبيل المثال ^6). وعلاوة على ذلك، فإن نمط التعبير عن THGal4 هو أكثر تحديدا من ذلك من GAL4 خطوط أخرى مثل DdcGal4، والذي يحتوي على متواليات التنظيمية من الجين كربوكسيل دوبا ويدفع التعبير المعدلة وراثيا ليس فقط في الخلايا العصبية DA، ولكن أيضا في الخلايا العصبية سيروتونيني المفعول ومجموعات فرعية من الخلايا الدبقية ³ .

Feany وبندر (2000): لاحظ أولا أن التعبير عموم العصبية للإنسان الجين α-synuclein PD-مرتبط يسرع الفقدان التدريجي من ستاrtle التي يسببها السلوك انجذاب بالجاذبية السلبية في ذبابة الفاكهة. وقد لاحظنا نتائج مماثلة باستخدام الخلايا العصبية DA-محددة خط THGal4 لدفع expressionof إلى α-synuclein التحوير ¹⁰ وتستخدم هذه ظيفية للقراءة لدراسة دور اعصاب من مسار Nrf2 في هذا ذبابة الفاكهة نموذجا للPD ^14. ويتم تكييف الفحص المحددة الموصوفة هنا من ² و ^3.

ذبابة الفاكهة الدماغ يحتوي على أكثر من 100 الخلايا العصبية DA، وترتيبها في لا يقل عن 5 مجموعات مختلفة (PPL1، PPL2، PAL، PPM1 / 2، PPM3) التي يمكن تصور كليا يتصاعد الدماغ عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر (انظر على سبيل المثال ¹¹ و ^7). انها لا تزال مثيرة للجدل سواء أو ليس عدد الخلايا العصبية DA في الانخفاض الدماغ ذبابة الفاكهة مع تقدم العمر ^{9 و 11،} ولكن لوحظ تنكس عصبي التي تعتمد على العمر في الذباب حيث تم تحور الجينات PD-مرتبط / بإفراط (overexpressed) لنمذجة الأمراض التي تصيب الإنسان5. التعبير عن الإنسان α-DA synuclein في الخلايا العصبية لديها مثل هذا التأثير، وبالتالي، قد استخدمت كنموذج لPD. هنا نحن تصف مقايسة لالخلايا العصبية DA الاعتماد في الدماغ كله يتصاعد باستخدام TH كعلامة الخلية. وقد تم تكييف هذا الاختبار في الفترة من ¹³ و ^10.

1. باغت بفعل سلبي الفحص انجذاب بالجاذبية

1. حدد الذباب من النمط الجيني المطلوب، بفصلها بين الجنسين، وبشكل عشوائي مجموعة منهم في أفواج من 20-30 الحيوانات والوجه لهم في قوارير غذائية جديدة كل 2-3 أيام؛ اختبار كل مجموعة من الذباب (أي الأفواج في العمر كعينة، واحد الفوج / التركيب الوراثي) على الأقل مرة في الأسبوع.
2. ثلاثين دقيقة قبل الاختبار انجذاب بالجاذبية السلبية، تخدير الذباب مع CO ₂ ووضعها في أنابيب من البلاستيك واضحة قبل صفت أدلى مع اثنين من قارورة فارغة الغذائية (انظر الجدول مواد) انضم في فتحاتها مع الشريط واضحة (أبعاد الغرفة: 19 سم x 2.85 سم). في المقايسات لدينا عادة نحن نستخدم 25 الذباب / أنبوب.
   ملاحظة. يمكن أن تختلف مدة الشفاء من التخدير من بضع دقائق إلى عدة ساعات (على سبيل المثال O / N) وينبغي أن يكون الأمثل للالمورثات محددة اختبارها.
3. بمناسبة ارتفاعات مختلفة (1-20 سم) على قطعة من الورق النشاف والشريط ورقة على السطحية العموديةه، عمودي على مقاعد البدلاء.
4. وضع أنابيب أمام ورقة: يجب أن تكون جميع أنابيب الانحياز وأقرب ما يمكن إلى ورقة للسماح الارتفاع دقيقة.
5. ضع الكاميرا الرقمية (راجع "معدات خاصة" جدول) أمام الأنابيب، على مسافة من 20-30 سم من الورق، وعلى الوقوف (على سبيل المثال مربع طرف ماصة)، حدد "فيلم" الخيار والبدء تسجيل، في هذا الوقت يجب عليك أيضا بدء الموقت لتتبع الوقت بين محاكمات متتالية.
6. السماح للذباب للجمع في الجزء السفلي من الأنبوب من خلال الاستفادة من أنبوب لبضع ثوان (مثلا 10 ثانية). يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة على الدوام (أي نفس المدة، نفس القوة، نفس المشغل) في كافة مراحل التجربة برمتها.
7. حركات الذباب سجل 'مع الكاميرا الرقمية لمدة 10 ثانية.
8. كرر الخطوات من 1،5-1،7 أربعة عشر مرات على فترات مين واحد.
9. تحليل البيانات:
   1. حساب عدد من الذباب التي هي فوق2 سم علامة بعد 10 ثانية عن طريق التفتيش البصري من الأفلام المسجلة.
      ملاحظة: في ظروف مقايسة لدينا فعل السلوك انجذاب بالجاذبية السلبية الذباب 'لا تستمر إلى ما بعد اول 10 ثانية بعد مذهلة (أي التي الذباب تتحرك في كل الاتجاهات 10 ثانية بعد مفاجئة لهم). قفز مسافة لا تقل عن طريق الذباب السيطرة (أي 1 أسبوع الذباب القديمة معربا عن سائق THGal4، انظر أسطورة من الشكل 1) في هذا الإطار الوقت كان 2 سم. وبالتالي، استخدمنا علامة سم 2 كمرجع لتحليل أنشطة التسلق من الذباب من الأعمار والأنماط الجينية 10 ثانية بعد الشروع في سلوك مختلف. قد تتطلب هذه المعايير تعديل لمراعاة الاختلافات في سلوك الذباب اختبار (بسبب مثلا لخلفيات وراثية مختلفة، أو ظروف المختبر). لاحظ أنه في ظروف مقايسة لدينا، كل اختبار الأنماط الجينية أداؤها أسوأ أو على غرار الذباب من النمط الجيني السيطرة.
   2. أخذ متوسط ​​نتائج من خمسة عشرالمحاكمات.
   3. متوسط ​​صريحة كنسبة مئوية من مجموع عدد الذباب في الأنبوب (= نشاط تسلق٪)، وعدد من يكرر (N) وتعطى من قبل عدد من الأفواج المستقلة اختبار لكل الوراثي
   4. تقييم دلالة إحصائية بين الأنماط الجينية المختلفة على مر الزمن. ويمكن تحقيق ذلك مع ر اختبار الطالب (عند المقارنة بين اثنين من المورثات) أو تحليل ANOVA 2 في اتجاه تليها Bonferroni بعد مخصصة اختبار (عند تنفيذ مقارنات متعددة) باستخدام البرمجيات التجارية مثل GraphPad (GraphPad البرامج، Inc.La جولا، CA، الولايات المتحدة الأمريكية).

لاحظ

نحن لدينا أداء جميع المقايسات في نفس الوقت من اليوم، في RT وتحت ظروف الإضاءة نفسها. الحفاظ على الذباب في ساعة الضوء / الظلام بيئة دورة 12 من المستحسن للسيطرة على تأثير إيقاعات الساعة البيولوجية على السلوك الحركي للذباب '.

2. التيروزين المناعي هيدروكسيلازمقايسة من الجبال الدماغ كله

الحلول ومخازن

حل تثبيتي: امتصاص العرق 4٪ (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)

غسل العازلة: 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني

حجب العازلة: 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 0.15 M كلوريد الصوديوم، 0.1٪ تريتون X-100 و 0.5٪ BSA

تصاعد وسائل الإعلام: Mowiol-Dabco (انظر بروتوكول الموصوفة في هارلو E، لين دال، والأجسام المضادة-A دليل المختبرات، ومختبرات كولد سبرينغ هاربر الصحافة، كولد سبرينج هاربور، NY، الولايات المتحدة الأمريكية، 10:418 (1988))

إجراء

1. وضع الذباب في طبق تشريح مليئة ETOH 70٪ لمدة 1 دقيقة لإزالة الشمع بشرة.
2. نقل الذباب لطبق تشريح أخرى مليئة الجليد الباردة PBS.
3. تشريح الدماغ:
   1. ضع يطير مع ما يصل الجانب البطني (اختياري: أجنحة إزالة والساقين).
   2. ضبط استخدام واحدة من ملقط ل: سحب الرأس بعيدا عن الجسمالابقاء على الجسم وآخر على التمسك بشرة تحت العين لمنع تلف الدماغ
   3. إزالة خرطوم.
   4. الابقاء على بشرة الرأس على طرفي نقيض من شق ترك الباب مفتوحا بعد إزالة خرطوم وسحب في اتجاهين متعاكسين حتى تتم إزالة الدماغ من الكبسولة الرأس.
   5. إزالة كل بشرة من الدماغ.
   6. إزالة جميع الأنسجة القصبة الهوائية مليئة بالهواء، وهذا سوف يمنع الدماغ من خلال تطفو الخطوات التالية الحضانة.
4. قطع بضعة ملليمترات قبالة الطرف من طرف P-200 ماصة ويوازن ذلك مع 0.1٪ تريتون حل X-100/PBS
5. باستخدام معدة طرف P-200 ماصة، نقل أدمغة إلى 0.5 مل أنبوب إيبندورف مليئة 0.5 مل من 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني والحفاظ على الجليد حتى تشريح كاملة.
6. إصلاح العقول في RT لمدة 20 دقيقة: تطبيق التناوب لطيف عن طريق وضع أنابيب إيبندورف على الرف ووضع رف على nutator.
7. إزالة تثبيتياستخدام P-1000 الصغيرة ماصة، إضافة 0.5 مل من 0.1٪ X-100/PBS تريتون، مزيج من قبل انقلاب والسماح احتضان لمدة 1 دقيقة، كرر هذه الخطوة غسل مرة واحدة.
8. إزالة العازلة من غسل الثاني، إضافة 0.5 مل من 0.1٪ تريتون X-100/PBS والسماح احتضان عند RT لمدة 20 دقيقة؛ كرر هذه الخطوة مرتين.
9. إزالة العازلة غسل أدمغة والسماح للاحتضان في عرقلة العازلة (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 0.15 M كلوريد الصوديوم، 0.1٪ تريتون X-100 و 0.5٪ BSA) لمدة 1 ساعة على RT.
10. احتضان العقول مع تخفيف 1:100 من الأجسام المضادة لمكافحة TH (انظر "جدول الكواشف محددة") في عرقلة الحل، لمدة يومين، في 4 درجات مئوية، مع دوران طيف (انظر الخطوة 2.6).
11. تكرار غسل الخطوات 2.7. و2.8 ..
12. تتوازن أدمغة مع تخفيف 1:200 من الثانوية antibodyin عرقلة الحل، لمدة يومين، في 4 درجات مئوية، مع تناوب لطيف.
13. تكرار غسل الخطوات 2.7. و2.8 ..
14. إعداد الشرائح التركيب كما هو موضح في الشكل 2A:
    1. ADD 2 X 25 قطرات ميكرولتر من تصاعد وسائط إلى غطاء زجاجي (24 × 60 مم، لا. 1.5).
    2. مكان كأسين الغطاء (حجم 18 × 18 مم، رقم 2) على تركيب وسائل الاعلام مما يترك فجوة في منتصف الشريحة واسمحوا الجافة.
    ملاحظة. تحقق من صاحب العينة على مرحلة المجهر متحد البؤر الخاصة بك. يمكنك جعل غطاء زجاجي نفس حجم 25 × 75 مم الشريحة عن طريق ربط 22 × 22 مم 1.5 غطاء زجاجي إلى واحدة من نهايات (استخدام طلاء الأظافر، والشريط).
15. إزالة العازلة غسل، إضافة 50 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام والسماح للعقل لكي تتوازن معها من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
16. باستخدام قطع P-200 ماصة (انظر الخطوة 2.4) نقل أدمغة إلى الشريحة في الفضاء بين coverslips على اثنين وغطاء لهم مع ساترة لا. 1.5 (انظر الشكل 2A؛ لتوجيه العقول على الشريحة انظر صفحة ^7).
    ملاحظة: هي التي شنت هذه العينات بين كأسين غطاء للسماح التصور على حد سواء الأمامي ومقر البريد المركزيالجانب rior من الدماغ.
17. ملء الفضاء كله بين النظارات غطاء مع تصاعد وسائل الإعلام؛ ماصة من زاوية واحدة لإزالة كل الهواء؛ اسمحوا الجافة وختم بطلاء الأظافر.
18. لتقييم عدد من الخلايا العصبية الدوبامين في كتلة معينة الحصول على سلسلة من المقاطع البصرية على طول المحور Z مع 1.0 ميكرون خطوة حجم باستخدام المجهر متحد البؤر (لتحديد التشريحية للمجموعات الدوبامين في الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة انظر صفحة ^7).

لقد استخدمت المقايسات الموصوفة هنا إلى دراسة دور الإجهاد واقية المسار Nrf2 في نموذج ذبابة الفاكهة من PD 14. يعتمد هذا النموذج على التعبير عن الإنسان الجين α-synuclein في الخلايا العصبية DA باستخدام TH GAL4 السائق 2، 10.

ويبين الشكل 1 نتيجة ممثل لانجذاب بالجاذبية السلبية التي يسببها جفل (تسلق) مقايسة في الذباب الذكور التعبير عن الجينات المحورة مختلفة تحت سيطرة السائق GAL4 TH. اختبار جميع الأنماط الجينية تظهر تراجعا في النشاط الحركي مع مرور الوقت، ومع ذلك، والذباب معربا عن PD-مرتبط، الإنسان α-synuclein التحوير تظهر وجود انخفاض المتسارع بالنسبة إلى الذباب التحكم في العمر كعينة (TH GAL4 السائق وحدها) أو تطير شارك في التعبير عن Nrf2 DNA شريك ملزم MAF-S. وقد لوحظت نتائج مماثلة في الذباب الإناث.

ويوضح الشكل 2 نتيجة ممثل لDA TH-المستندة إلى المناعيالخلايا العصبية العد. وكميا تأثير خلفيات وراثية مختلفة على عدد من الخلايا العصبية في أدمغة PPL1 من 4 أسابيع الذباب الذكور القديمة كما هو موضح في الشكل أسطورة. لاحظ خسارة صغيرة ولكنها هامة من الخلايا العصبية في أدمغة PPL1 من الذباب معربا عن α-synuclein.

الشكل 1. تم اختبار الذباب جفل التي يسببها مقايسة انجذاب بالجاذبية السلبية. الأفواج في سن المتطابقة من المورثات المشار إليه للنشاط الحركي على فترات مدة أسبوع واحد. تم حساب التسلق النشاط عن طريق حساب عدد من الذباب فوق 2 سم علامة 10 ثانية بعد التنصت على القارورة والتعبير عن هذه القيمة كنسبة مئوية من مجموع عدد الذباب الواردة في قارورة. تظهر البيانات يعني ± SEM من خمسة أفواج مستقلة من 20-30 الذباب. وجرى تقييم أهمية مع ANOVA اتجاهين مع Bonferroni بعد مخصصة اختبار (P <0.05). الفرقبين TH، كان α-Synflies والذباب من ثلاثة أنماط جينية أخرى اختبار هام في 4 و 5 أسابيع.

الشكل 2. كشف والعد من الخلايا العصبية DA بواسطة TH المناعي. A. مخطط التدفق يدل على بروتوكول لإعداد الشرائح الدماغ. للحصول على وصف أكثر تفصيلا من كل خطوة انظر النص. B. الممثل صورة مجهرية من جبل الدماغ كله (hemibrain الأيسر، عرض الخلفي) immunostained لTH. وقد حصلت مجموعة من متحد البؤر Z-سلسلة الصور مع لايكا SP2 المجهر متحد البؤر، الهدف النفط 40X (N / A 1.25)، متوسط ​​الإطار 2، خطوة بحجم 1 ميكرومتر، في شكل 1،024 X 1،024 وتجميعها كحد أقصى إسقاط ( معروضة). وسلط الضوء على موقف PPL1 DA الخلايا العصبية العنقودية. C. الممثل دورة الفتشوبLTS لDA الخلايا العصبية التهم التي تم الحصول عليها باستخدام المناعية TH. تم تقييم عدد من الخلايا العصبية في الكتلة PPL1 عن طريق فحص الصور الفردية من كل متحد البؤر Z-سلسلة. N يمثل عدد من عينات مستقلة تحليلها لكل الوراثي. البيانات هي وسائل ± SEM تم تقييم أهمية مع الطالب تي اختبار (* P <0.05). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

المورثات: 'يخدع'، THGal4 / +؛ THGal4 / +؛ 'UAS-ازل'، THGal4، UAS
-αSynuclein / +؛ THGal4، UAS-αSynuclein / +؛ 'UAS-MAF-S'، THGal4/UASMaf-S؛ THGal4 / +؛ 'UAS-α ازل / UAS-MAF-S'، THGal4، UAS-αSynuclein / UASMaf-S؛ THGal4، UAS-αSynuclein / +؛ 'keap1 EY5'، THGal4 / +؛ THGal4/keap1 EY5؛ 'UAS-α Syn/keap1 EY5'، THGal4، UAS-αSynuclein / +؛ THGal4، UAS -αSynuclein/keap1 EY5.

[مستنسخة من بارون وآخرون 2011) بالاتفاق مع "الوصول المفتوح" سياسة "نماذج الأمراض وآليات".]

فإننا نعلن أنه ليس لدينا مصالح مالية المتنافسة.