يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة النخاع الابتدائية الجرذ الداخلية جمع خلايا القناة

14.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50366

⸱

يونيو 21, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

أرجينين-فاسوبريسين (AVP) تسيطر على صقل الجسم توازن المياه من خلال تسهيل استيعاب المياه بواسطة الخلايا الرئيسية الكلوي. هنا، نقدم بروتوكول لزراعة النخاع الفئران الداخلية الابتدائي جمع خلايا القناة مناسبة لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء إعادة امتصاص الماء AVP بوساطة.

الملخص

أرجينين-فاسوبريسين (AVP) يسهل إعادة امتصاص الماء بواسطة الكلى جمع الخلايا الرئيسية لاصق، وبالتالي غرامة الإيقاعات الجسم توازن الماء. AVP تربط لمستقبلات V2 فاسوبريسين (V2R) على سطح الخلايا وبالتالي يدفع توليف المخيم. هذا يحفز عمليات الإشارات الخلوية مما يؤدي إلى تغييرات في الفسفرة من قناة المياه aquaporin-2 (AQP2). بروتين كيناز A phoshorylates AQP2 وبالتالي يتسبب في إزفاء من AQP2 من حويصلات داخل الخلايا في غشاء البلازما تسهيل استيعاب الماء من البول الابتدائي. الانحرافات الإفراج AVP من إشارات النخامية أو AVP تنشيط في الخلايا الرئيسية يمكن أن يسبب مرض السكري الكاذب المركزي أو كلوي، على التوالي؛ يرتبط على الدم مرتفعة البلازما مستوى AVP مع أمراض القلب والأوعية الدموية مثل قصور القلب المزمن ومتلازمة غير لائق المضاد لإدرار البول إفراز الهرمون.

هنا، نقدم بروتوكول للcultivatiعلى من الفئران النخاعية الداخلية الابتدائي جمع مجاري الهواء (IMCD) الخلايا والتي تعبر V2R وAQP2 التطور الطبيعي. الخلايا هي مناسبة لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء سيطرة AQP2 وبالتالي لاكتشاف الأهداف المخدرات رواية لعلاج الأمراض المرتبطة التقلبات من استيعاب المياه AVP بوساطة. ويتم الحصول على الخلايا IMCD من الفئران للنخاع الداخلية الكلوي وتستخدم للتجارب بعد ستة إلى ثمانية أيام البذر. يمكن تربيتها خلايا IMCD في الأطباق العادية خلية ثقافة والقوارير واللوحات عيار الصغرى من الأشكال المختلفة، فإن الإجراء يتطلب بضع ساعات فقط، وغير مناسبة للمختبرات زراعة الخلايا القياسية.

المقدمة

في الكلى جمع الخلايا الرئيسية لاصق، أرجينين-فاسوبريسين (AVP) تسيطر على استيعاب المياه من خلال تحفيز الإدراج من الماء قناة aquaporin-2 (AQP2) في غشاء البلازما. AVP بربط البروتين يقترن G فاسوبريسين نوع 2 مستقبلات (V2R) تحفيز محلقة أدينيليل وبالتالي تشكيل المخيم. بدء هذه السلسلة يشير يؤدي إلى تنشيط بروتين كيناز ألف (PKA). PKA phosphorylates AQP2 في سيرين 256 (S256)، والذي هو المحرك الرئيسي لإعادة توزيعها في الفترة من حويصلات داخل الخلايا في غشاء البلازما. إدراج غشاء يسهل استيعاب المياه على طول الانحدار ناضح وغرامة الإيقاعات الجسم التوازن المياه.

ويرتبط التقلبات من استيعاب المياه AVP بوساطة، وذلك بسبب الانحرافات من إفراز AVP أو أسباب إشارات AVP تنشيط أو يعانون من أمراض حادة. انخفضت استيعاب المياه التي تسببها طفرات من V2R أو AQP2 يؤدي إلى مرض السكري الكاذب كلوي، في حين أن ELEVويرتبط انبعاث العوادم بلازما الدم مستوى AVP مع استيعاب المفرط للمياه في أمراض القلب والأوعية الدموية مثل قصور القلب المزمن ومتلازمة غير لائق المضاد لإدرار البول إفراز هرمون (SIADH).

أهمية استيعاب المياه AVP بوساطة لا ينبع فقط من آثاره في المرض. وإزفاء AVP التي يسببها من الحويصلات AQP2 الحاملة لوالانصهار مع غشاء البلازما يمثل عملية exocytic بدقة مخيم معتمدة، وهو حاليا غير مفهومة جيدا. أمثلة أخرى لإيماس التي تعتمد على المخيم إفراز الرينين في الكلى وH + إفراز في المعدة. ولذلك، توضيح من الآليات الجزيئية التي تنظم AQP2-إزفاء في الخلايا الرئيسية الكلوي لا يساعد فقط على فهم العمليات الجزيئية مماثلة في أنواع الخلايا الأخرى ولكن أيضا قد يمهد الطريق لعلاجات جديدة لعلاج الأمراض المرتبطة اضطرابات من استيعاب المياه AVP بوساطة .

Elucidating آليات السيطرة AQP2 يتطلب جمع القناة نماذج الخلية الرئيسية. لهذا عدد من مختلف الثدييات خطوط الخلايا الكلى متوفرة. ومع ذلك، هذه النماذج لديها العديد من السلبيات. في كثير من النظم خلية مستوى البروتين من AQP2 منخفضة (الجدول 1؛ M1، HEK293، COS-7، MDCK، LLC-PK1) 1-10، والبعض الآخر ectopically overexpress الإنسان (MCD4، WT10) 11،12 أو الفئران (CD8) 13 AQP2. في MCD4 وCOS-7 الخلايا لا يتم التعبير عن مستقبلات V2. على حد علمنا ليس هناك خط خلية دائمة كنموذج المتاحة، والتي هي مستمدة من النخاعية الداخلية الكلى جمع القناة، أن جزءا من الكلى حيث AQP2 التعبير هو الأكثر وفرة، ولكن من القشرية جمع القناة 1،11،13-16 . نماذج الخلية مثل هذه هي على سبيل المثال تستخدم على نطاق واسع خلد mpkCCD (مثلا 17) أو mTERT-CCD 14 خطوط الخلايا التي أنشئت مؤخرا. كلا الخطين الخلية التطور الطبيعي صريحة AQP2 ولكن منذ V2R أنها مشتقة منالقشرية القناة جمع الأرجح تحتوي على بروتيوم مختلفة مقارنة النخاعية الداخلية جمع مجاري الهواء (IMCD) الخلايا. يجب عليهم على سبيل المثال التعبير عن مختلف نا + أنظمة النقل.

هنا، نقدم بروتوكول لثقافة الخلايا IMCD الابتدائية تعبر عن V2R وAQP2 التطور الطبيعي. هذا النموذج، وبالتالي، يمثل أكثر عن كثب الوضع الفسيولوجية في القناة جمع الكلوي. كما يتطلب إنشاء ثقافة فقط المعدات المختبرية القياسية مختبرات أخرى يمكن اعتماد هذا النهج بسهولة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد

  1. إعداد أطباق ثقافة
    1. ذوبان الكولاجين النوع الرابع O / N عند 4 ° C وحلها في 0.1٪ حامض الخليك العقيمة. حجم لاستخدام يعتمد على نوع وعدد من الأطباق التي كانت الخلايا ليكون المصنف. استخدام 2 ميكروغرام / سم 2.
    2. احتضان الأطباق على الأقل لمدة 1 ساعة على RT ويغسل مرتين مع الماء المقطر (A. tridest).
    3. السماح للأطباق لتجف بشكل صحيح.
  2. مكملات من المتوسطة
    1. زيادة مستوى الجلوكوز يصل إلى 4.5 جرام / لتر وذلك بإضافة 1.75 ز الجلوكوز إلى 500 مل المتوسطة. لضبط المتوسطة إلى 600 mosmol، إضافة 100 ملي مول كلوريد الصوديوم واليوريا 100 ملم، لزيادة الأسمولية بنسبة 200 mosmol و 100 mosmol، على التوالي.
    2. إضافة 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1٪ ultroser، 500 DBcAMP ميكرومتر، 20 U / مل نيستاتين و 0.25 ميكروغرام / مل جنتاميسين (1:200 التخفيف من محلول المخزون مع تركيز 50 ميكروغرام / مل) إلى 600 mosmol DMEM المتوسطة طازجة في اليوم من التحضير.
  3. حل انزيم
    1. إضافة 1 ملغ / مل هيالورونيداز و 2.2 ملغ / مل كولاجيناز إلى DPBS المحتوية على 0.25 ميكروغرام / مل جنتاميسين والنيستاتين. إعداد 1 مل من هذا الحل انزيم لهضم 2 الكلى للنخاع الداخلية. يجب تعقيم الحل عن طريق الترشيح ويتم تخزينها في 50 مل أنابيب فالكون.

2. زراعة النخاع الابتدائية الجرذ الداخلية جمع مجاري الهواء (IMCD) خلايا

جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات هي التي يتعين الاضطلاع بها في الامتثال للتشريعات المحلية والاتحادية.

  1. تخدير الفئران في CO 2 (في مربع مشبعة CO 2) أو isoflurane و(U-400 وحدة التخدير، Univentor المحدودة، مالطة؛ تدفق الهواء 350-400 مل / دقيقة مع 2-2.5٪ isoflurane و). قطع رأس الحيوانات لوقف نزيف الذي يسمح الكشف الدقيق للحدود بين بيضاء الداخلية والنخاع الخارجي أكثر قتامة. وبالإضافة إلى ذلك، النزيف يقلل من عدد كرات الدم الحمراء المعزولة. إزالة الكلى وغسلها في DPBS العقيمة تستكمل مع الجنتاميسين والنيستاتين (انظر أعلاه) على الجليد. جميع خطوات أخرى هي التي يتعين الاضطلاع بها تحت ظروف معقمة مقاعد البدلاء النظيفة.
  2. نقل الكلى من حل DPBS على ضغط معقمة لإزالة السائل الزائد. إزالة الكبسولة الكلى الدهنية مع ملقط معقم، ومقص.
  3. وبعد أن زال الكلى ثابتة في ضغط، وقطع قليلا بجانب المحور الطولي للجانب الخارجي (القشرية). تأكد من عدم قطع طريق تماما، ولكن ترك الأمر في قطعة واحدة، مرتبطة في الحوض الكلوي.
  4. مع مقص منحني تشريح بعناية للنخاع الداخلية بيضاء، والتي تحيط بها النخاع الخارجي متلألئ روز. جمعها في DPBS، التي تحتوي على جنتاميسين والنيستاتين في 60 ملم صحن الثقافة على الجليد.
  5. مرة واحدة يتم عزل جميع للنخاع والتي تم جمعها على الجليد، والحد من حجم DPBS إلى مستوى حيث يتم تغطيتها فقط مع العازلة. استخدام razorblade معقمة لقطع للنخاع إلى مكعبات من 5مم 3.
  6. تذوب وجولة على نهاية حادة من العقيمة باستور ماصة عن طريق إمساكه لفترة وجيزة في لهب. تأكد يتم تبريد ماصة قبل المتابعة.
  7. نقل تعليق الأنسجة إلى 50 مل أنابيب فالكون يحتوي الطازجة حل انزيم العقيمة مع هيالورونيداز وكولاجيناز (انظر 1.3.1) باستخدام مدورة ماصة باستير. إغلاق الغطاء بإحكام واحتضان عند 37 درجة مئوية في إطار التحريض المستمر (220 دورة في الدقيقة) في حمام المياه العادية الطاولة ل1،5-2 ساعة.
  8. لسحن لتعليق، ماصة الخليط صعودا وهبوطا عدة مرات مع الجولة ماصة باستير (انظر أعلاه) حتى يصبح عكر متجانس تعليق.
  9. الطرد المركزي تعليق لمدة 5 دقائق في 300 XG و 16 درجة مئوية. تجاهل طاف، resuspend الكرية جيدا في DPBS، التي تحتوي على جنتاميسين والنيستاتين وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. كرر هذه الخطوة غسل مرة واحدة.
  10. resuspend الخلايا في المتوسط ​​تستكمل بالكامل والبذور لهم في جأطباق ulture و / أو لوحات جيدا عيار الصغرى. وإعداد 2 للنخاع (1 الحيوان) تسفر عن خلايا كافية لواحد صحن الثقافة 60 ملم.
  11. بعد 24 ساعة، وغسل الخلايا مرتين مع 600 mosmol DMEM وإضافة المتوسطة الطازجة. خلال الأسبوع المقبل وينبغي غسل الخلايا 2-3 مرات (الشكل 1). بعد 6-8 أيام البذر، وخلايا IMCD يمكن استخدامها لإجراء التجارب. تذكر لاحتضان لهم في وسيط وبدون DBcAMP ونيستاتين لمدة 24 ساعة قبل بدء التجربة. وإلا AQP2 سوف يكون موجودا حصرا في غشاء البلازما.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

فإن زراعة ناجحة لخلايا الفئران IMCD الأولية يؤدي إلى أحادي الطبقة متموجة بعد 6-8 أيام البذر (الشكل 2). لكل 60 مم طبق الثقافة هناك ما يقرب من 6 × 10 6 خلايا. الخلايا التمسك بإحكام إلى أطباق ثقافة، كما كانت مغلفة هذه مع الكولاجين النوع الرابع، وهو أحد مكونات الغشاء القاعدي 18. ولذلك، فإن الخلايا IMCD لا فصل حتى خلال عدة إجراءات الغسل الكامل. ما يصل إلى 80٪ من الخلايا المستزرعة التعبير عن V2R التطور الطبيعي وAQP2. هذه هي الخلايا الرئيسية، في حين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نقدم بروتوكول مفصلة لإعداد وزراعة الخلايا IMCD الفئران الأولية. النهج غلة تصل إلى 21 سم 2 من الخلايا من الفئران واحدة 20. التجربة يتطلب معيار معدات زراعة الخلايا ويمكن أن يقوم بها شخص واحد في غضون ما يقرب من 6 ساعة. ولذلك، فإن هذا النهج هو مناسبة كوسيلة المختبر القياسية.

يمكن المصنف الخلايا الأولية IMCD الفئران في أطباق ثقافة حجم مختلفة، تتراوح ما بين 96 إلى 60 لوحات جيدة ملم الأطباق. ومع ذل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG؛ KL 1415/3-2 وKL 1415/4-2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكولاجين من النوع الرابع ماوسBD Biosciences356233
HyaluronidaseSIGMAH6254
نوع الكولاجيناز CLS-IIBiochrom AGC2-22
DMEM + GlutMAXInvitrogen GIBCO21885108
NystatinSIGMAN4014
Ultroser GCytogen15950-017
الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEA) BiochromAGK0293
GentamicinInvitrogen GIBCO15710
DBcAMPBIOLOGD009

المراجع

  1. Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
  2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
  3. Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
  4. Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
  5. Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
  6. Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
  7. Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
  8. Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
  9. Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
  10. Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
  11. Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
  12. Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
  13. Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
  14. Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
  15. Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
  16. Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
  17. Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
  18. Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
  19. Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
  20. Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
  21. Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
  22. Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
  23. Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
  24. Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
  25. Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
  26. Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
  27. Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
  28. Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
  29. Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
  30. Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman

الوسوم

خلايا القنوات الجامعة للنخاع الداخلي الأولية من الجرذعزل النخاع الداخليالهضم الإنزيمي للأنسجةبروتوكول زراعة الخلاياإشارات الفازوبريسين الأرجنينيانتقال الأكوابورين-2تعبير مستقبل V2الطلاء بالكولاجينتحليل لطخة ويسترنمجهر الفلورة المناعية
زراعة النخاع الابتدائية الجرذ الداخلية جمع خلايا القناة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.