Method Article

A تعدد في منصة الفرز القائم على luciferase المراسل لاستجواب المرتبطة بالسرطان نقل الإشارة في الخلايا المستزرعة

DOI:

10.3791/50369

⸱

July 3rd, 2013

 , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التوصل إلى فهم مستوى النظم من العمليات الخلوية هو هدف بيولوجيا الخلية في العصر الحديث. نحن هنا وصف استراتيجيات للصحفيين وسيفيراز المتنوعة من مختلف وظيفة الخلوية نقطة نهاية لاستجواب وظائف الجينات باستخدام الجينوم على نطاق والمكتبات رني.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاستجواب على نطاق الجينوم وظيفة الجين باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (رني) يحمل وعدا هائلا لتحديد السريع للين العريكة كيميائيا نقاط الضعف الخلايا السرطانية. مما يحد من إمكانيات هذه التكنولوجيا هو عدم القدرة على ترسيم بسرعة أساس الآلية من نتائج المظهري وبالتالي يسترشد بها في وضع استراتيجيات علاجية تستهدف جزيئيا. نحن هنا الخطوط العريضة الأساليب لتفكيك الظواهر الخلوية الناجمة عن الجين رني بوساطة استهداف باستخدام أنظمة مراسل المضاعفة التي تسمح رصد سرطان مفتاح عمليات الخلية المرتبطة. هذه المنهجية الفرز نسبة عالية هي متعددة ويمكن تكييفه بسهولة لفحص أنواع أخرى من مكتبات الجزيئية كبيرة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجموعة متنوعة من الصحفيين على وسيفيراز لرصد مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية خلية متاحة تجاريا. غالبية هذه البروتينات الحمض النووي يبني ترميز وسيفيراز التي يسببها وصريح من قبل المحفزات خلية معينة أو اضطرابات. الأكثر صحفيين قوية مقرها transcriptionally وضع التعبير عن انزيم luciferase المراسل تحت سيطرة عناصر محسن الاصطناعية أو مناطق المروج الجين راسخة لموثوقيتها في الإبلاغ عن ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية النسخي 1،2 حدث. وهناك أيضا نظم عبر مراسل luciferase التي تستخدم GAL4-UAS لدفع وسيفيراز تعبير البروتين. GAL4 هي الخميرة النسخي المنشط وUAS هو محسن الذي يربط GAL4 خصيصا لتفعيل النسخ من تسلسل الجينات وضعت أسفل تيا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول كامل يستغرق حوالي 4 أيام.

1. إعداد الخلايا لسيرنا ومراسل ترنسفكأيشن

وسوف أعرض هنا بروتوكولا لاستجواب المكتبات سيرنا باستخدام مجموعة صغيرة من الرناوات siRNAs (384 مختلفة سيرنا برك مجموعة في 96 شكل جيد مع كل تجمع يتألف من الرناوات siRNAs 4X استهداف جين واحد) من مكتبة سيرنا على نطاق الجينوم لأغراض التوضيح. لهذه الدراسة خاصة، ونحن سوف يستغل HCT116 الخلايا التي تظهر إشارات WNT وKRAS المنحرف، والنشاط P53. فإن خط الخلية المناسبة في الدراسات التي تهدف إلى استجواب العمليات الخلوية الأخرى ذات ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من التقدم في رسم المشهد طفرية من السرطانات المختلفة باستخدام ضخمة جهود تسلسل الجينوم 12-14، ونحن ما زلنا لا نملك في مكان مقاربة منهجية لترجمة هذه الملاحظات إلى استراتيجيات التدخل. في سرطان القولون والمستقيم (CRC)، والطفرات التي من المتوقع أن تؤثر على مكونات ثلاث عمليات الخلوية - WNT / β كاتينين، P53، وKRAS إشارات - توجد في 99٪ من جميع الأورام تشير الى أنها الدوافع الرئيسية لتحول الخلوية في القناة الهضمية 13. وبالتالي، من المرجح المخصب مجموعات بيانات.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك العديد من مروجي أنظمة المستندة إلى مراسل luciferase المراسل (مثل PROMEGA، نظم الاستهداف، نيو انغلاند Biolabs، والحرارية فيشر) التي توفر الموارد على الخط مفيدة لأولئك مسلية شاشة عالية الإنتاجية للمرة الأولى. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن عددا من الاستعراضات ممتازة بشأن تحقيق الاستخدام الأمثل للشاشات عالية الإنتاجية لاكتشاف الجين وكيفية المستندة إلى رني يمكن أن تكون متكاملة مع قواعد البيانات نتائج الفرز-OMICS المستندة إلى الأخرى أن تكون مفيدة 15،16. طرق لاختيار "ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

موافق وLL هي الكتاب على براءات الاختراع في انتظار المتعلقة المضاعفة التكنولوجيا وسيفيراز.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نعترف الدعم المالي من CPRIT (RP100119) ومؤسسة وولش (I-1665).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS< / strong>
PathDetect Elk1 Trans-Reporting SystemAgilent Technologies Inc.219005
نظام التنميط المسار Luciferase 4 pp53-TA-Luc VectorClontech Lab Inc.631914
كاشف النفداء EffecteneQiagen Inc.301427
فحص مراسل لوسيفيراز المزدوجPromega Corp.E1960
Cypridina Luciferase فحص كاشفأنظمة استهدافخلايا VLAR-1
HCT116ATCCCCL-247
CytoTox-Fluo Celltoxicity AssayPromega Corp.G9260
MultiFlo Microplate DispenserLabsystems Inc.نموذج 832
محطة عمل أتمتة المختبر Biomek FXPBeckman Coulter Inc.A31842
PHERAstar FS- قارئ الألواح الدقيقة HTS متعدد الأوضاعBMG Labtech Inc.0471-101A
مقاييس الدم Reichert ذات الخط الساطعشركة هوسر العلمية1490
نظام < td colspan = "4" >< قوي > معدات < / قوي >

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
  2. Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent repor....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Luciferase ScreeningCancer Signal TransductionRNA Interference Gene TargetingReporter Gene AssaysFirefly Luciferase AssaySecreted Luciferase MeasurementCell Lysate PreparationTransient Transfection ProtocolHCT116 Colorectal Cancer CellsPathway Activity Monitoring

Related Articles