مقالة منهجية

تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية

DOI:

10.3791/50443

⸱

يوليو 16, 2013

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكالسيوم بين الخلايا 2 + موجات عبر قنوات تقاطع الفجوة وhemichannels. هنا، نحن تصف طريقة لقياس الكالسيوم بين الخلايا 2 + موجات في الخلية monolayers في استجابة لحافز الميكانيكية وحيدة الخلية المحلية وتطبيقه على التحقيق في خصائص وتنظيم قنوات تقاطع الفجوة وhemichannels.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاتصالات بين الخلايا أمر ضروري لتنسيق العمليات الفسيولوجية بين الخلايا في مجموعة متنوعة من الأجهزة والأنسجة، بما في ذلك الدماغ والكبد، شبكية العين، القوقعة والأوعية الدموية. في إعدادات التجريبية، بين الخلايا كا 2 + موجات يمكن استخلاصها من خلال تطبيق التحفيز الميكانيكي لخلية واحدة. وهذا يؤدي إلى الإفراج عن الجزيئات داخل الخلايا مما يشير IP 3 والكالسيوم 2 + التي بدء انتشار كا 2 + الموجة بتكثف من الخلية حفز ميكانيكيا إلى الخلايا المجاورة. يتم توفير المسارات الجزيئية الرئيسية التي تتحكم بين الخلايا كا 2 + انتشار الموجة عبر قنوات تقاطع الفجوة من خلال نقل مباشر من IP (3) وhemichannels من خلال الافراج عن ATP. ويسمح تحديد وتوصيف خصائص وتنظيم connexin مختلفة والأشكال الإسوية pannexin كقنوات تقاطع الفجوة وhemichannels من قبل quantificatioن من انتشار الكالسيوم بين الخلايا 2 + الموجة، سيرنا، واستخدام مثبطات قنوات تقاطع الفجوة وhemichannels. هنا، نحن تصف طريقة لقياس بين الخلايا كا 2 + الموجة في الطبقات الوحيدة من الخلايا البطانية القرنية الأولية محملة Fluo4-AM ردا على التحفيز الميكانيكي للرقابة والمترجمة استفزاز من قبل، وتشوه قصيرة الأمد الحاد في الخلية نتيجة لذلك من لمس غشاء الخلية مع micropipette الزجاج التي تسيطر عليها مياداة مجهرية التي يبلغ قطرها غيض من أقل من 1 ميكرون. نحن أيضا وصف عزلة الابتدائي الأبقار الخلايا البطانية القرنية واستخدامه كنظام نموذج لتقييم النشاط Cx43-hemichannel باعتبارها القوة يحركها لبين الخلايا كا 2 + موجات من خلال الافراج عن ATP. وأخيرا، نحن مناقشة استخدام، ومزايا والقيود والبدائل لهذا الأسلوب في سياق الفجوة قناة تقاطع والبحوث hemichannel.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاتصالات بين الخلايا وإشارات ضرورية لتنسيق العمليات الفسيولوجية في استجابة لمنبهات خارج الخلية في الأنسجة و1،2 مستوى كامل الجهاز. يتم إنشاء الطريق الأكثر مباشرة للاتصال بين الخلايا من حدوث تقاطعات الفجوة. تقاطعات الفجوة هي لويحات من القنوات تقاطع الفجوة، والتي هي القنوات البروتينية التي شكلتها لرسو السفن وجها لوجه من اثنين connexin (CX) hemichannels من الخلايا المتجاورة 3،4 (الشكل 1). تقاطعات الفجوة تسمح بمرور الجزيئات الصغيرة إشارة ذات وزن جزيئي أقل من 1.5 كيلو دالتون، بما في ذلك كا 2 + 3 5 أو IP، مما تسبب في وتحوير كا 2 + الإفراج من المخازن داخل الخلايا من الخلايا المجاورة 6 (الشكل 2). قنوات تقاطع الفجوة وينظم بإحكام بواسطة البينية بين الجزيئات والتفاعلات البروتين والعمليات مما يشير الخلوية، مثل تعديل الأكسدة والفسفرة 7. GJS تسهيل الاستجابة المنسقة من الخلايا متصلة، فيعمل كمادة كيميائية ومخلى الكهربائية. على سبيل المثال، انتشار إمكانات العمل القلب عبر myocytes الأذيني البطيني ويتم بوساطة قنوات GJ المستندة إلى معادل 85. CXS يكن لديك سوى دور كقنوات تقاطع الفجوة، ولكن أيضا تشكيل hemichannels المفردة، وبالتالي تعمل كقنوات في الأغشية على نحو مماثل لقنوات ايون العادية 8-10 (الشكل 1). المشاركة Hemichannels في إشارة نظير الصماوي بين الخلايا المجاورة عن طريق التحكم في تبادل الأيونات والجزيئات يشير بين البيئة داخل وخارج الخلية.

في العديد من أنواع الخلايا (مثل الخلايا الظهارية وخلايا بانية للعظم، الخلايا النجمية والخلايا البطانية، وغيرها) وأجهزة (مثل الدماغ والكبد وشبكية العين، القوقعة والأوعية الدموية)، بين الخلايا كا 2 + موجات أساسية لتنسيق الاستجابات المتعددة الخلايا 11. الزيادات في داخل الخلايا كا 2 + المستويات في خلية معينة لا تقتصر على هذه الخلية، ولكن تنتشر إلى الخلايا المجاورة المحيطة بها، وبالتالي إنشاء الكالسيوم بين الخلايا 2 + الموجة 12،13. هذه بين الخلايا كا 2 + موجات مهمة لتنظيم فسيولوجية طبيعية من طبقات الخلايا باعتبارها مخلى وارتبط التقلبات مع العمليات الفيزيولوجية المرضية 11. في بطانة القرنية وظهارة، مجموعات مختلفة 14-24، بما في ذلك منطقتنا 25-33، ودرس آليات وأدوار الاتصالات بين الخلايا. في الخلايا غير منفعل، مثل الخلايا البطانية القرنية، واثنين من وسائط مختلفة من الاتصالات بين الخلايا تحدث 28،29، وهي فجوة التواصل بين الخلايا صلي والاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي. ينطوي على فجوة الاتصال بين الخلايا صلي على التبادل المباشر للجزيئات إشارة عبر الفجوة التقاطعات 7. الفجوة و Juncالاتصالات بين الخلايا tional أمر بالغ الأهمية للحفاظ على توازن الأنسجة، والسيطرة على تكاثر الخلايا، وإنشاء استجابة المتزامنة للإجهاد خارج الخلية 10،34،35. في عدد من الحالات المرضية، يتم تقليل الفجوة اقتران تقاطع بسبب CXS المعيبة، والتي تؤثر بهذا الفجوة صلي الاتصالات بين الخلايا 36. وهذا يؤكد أهمية وتأثير فجوة الاتصال بين الخلايا صلي في الكائنات متعددة الخلايا. وعلى النقيض من فجوة الاتصال بين الخلايا صلي والاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي ليست متوقفة على بدل خلية خلية، لأنه ينطوي على الافراج عن رسل خارج الخلية إنتشاري (الشكل 2). يتم إطلاق أنواع مختلفة من الجزيئات يشير في الفضاء خارج الخلية عن طريق إشارات الخلايا. ثم يتم نقل جزيء إلى الخلية المستهدفة حيث يتم الكشف عنها بواسطة بروتين مستقبلات محددة. وفي وقت لاحق مجمع مستقبلات إشارة يؤدي الى استجابة الخلوية، التييتم إنهاء عن طريق إزالة إشارة، تعطيل أو إزالة التحسس. صدر محبة للدهون رسل إشارة خارج الخلية اختراق الغشاء وتعمل على مستقبلات الخلايا. في المقابل، رسل ماء لا عبور الغشاء البلازمي للخلية الاستجابة، ولكن بمثابة يجند التي تربط لسطح أعرب البروتينات المستقبلة، التي تتابع بعد ذلك إشارة إلى البيئة داخل الخلايا. ثلاث عائلات رئيسية من البروتينات مستقبلات سطح الخلية المشاركة في هذه العملية: ايون قناة مرتبطة، المرتبط بالإنزيم، وربط بروتين G. الجزيء رسول صدر يمكن أن تعمل على المستقبلات من نفس الخلية (autocrine)، على الخلايا المستهدفة على مقربة (نظير الصماوي)، أو على الخلايا المستهدفة البعيدة التي تتطلب نظام الدورة الدموية (الغدد الصماء).

في العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك بطانة القرنية 28،29، ATP هو واحد من عوامل نظير الصماوي ماء الرئيسية التي تدفع انتشار بين الخلايا كا 2 + موجات 37-40. الدرجي تشوه الميكانيكية، نقص الأكسجة، التهاب أو التحفيز من قبل وكلاء مختلف، ATP يمكن أن تنطلق من الخلايا السليمة 41-44 استجابة لإجهاد القص، وتمتد، أو ناضح تورم 44،45. وقد افترض آليات ATP-الافراج مختلفة، بما في ذلك إيماس حويصلي 44 وعدد كبير من آليات النقل، مثل راديو كاسيت ATP ملزم (ABC) الناقلون، قنوات أنيون التي تعتمد على الجهد البلازمي 46، P2X7 قنوات مستقبلات 47،48، وكذلك hemichannels connexin 49-52 وhemichannels pannexin 43،49،53. ATP خارج الخلية يمكن ان تحلل بسرعة إلى ADP، AMP والأدينوساين 54،55 من قبل ectonucleotidases التي تكون موجودة في البيئة خارج الخلية. سوف ATP صدر خارج الخلية والمستقلب ADP 56 ينتشر عن طريق نشرها. وقد تورط التفاعل اللاحقة من هذه النيوكليوتيدات مع مستقبلات purinergic في الخلايا المجاورة في عropagation من بين الخلايا كا 2 + موجات 28،37،51. فئتين مختلفتين من المستقبلات purinergic موجودة: الأدينوزين هو يجند الطبيعية الرئيسية لP1-purinoceptors، في حين أن كلا البيورين (ATP، ADP) وبيريميدين (UTP، UDP) النيوكليوتيدات تعمل على معظم P2-purinoceptors 57.

الاتصالات بين الخلايا يمكن التحقيق من قبل وسائل مختلفة مثل تحميل كشط، ونقل صبغ، uncaging المحلية من منبهات مثل IP 3 والكالسيوم 2 +، التحفيز الميكانيكي، الخ. نحن هنا وصف دراسة كا 2 + موجة الانتشار التي تسببها التحفيز الميكانيكي من خلية واحدة. الاستفادة من دراسة كا 2 + انتشار الموجة عن طريق التحفيز الميكانيكي هو أنه يوفر أداة سهلة لقياس انتشار كا 2 + الموجة مع مرور الوقت وأنه يسمح بمقارنة كميا المعالجة المسبقة مختلفة من الخلايا. في بطانة القرنية، وهذه كا 2 + بين الخلايا موجات تسمح لشركةاستجابة منسقة من أحادي الطبقة، وهو يتصرف بموجب كآلية دفاع ممكن من بطانة القرنية غير التجدد مساعدة البطانة على تحمل الضغوط خارج الخلية أثناء الجراحة داخل العين، أو عند التعرض للالتهابات وسطاء خلال الرفض المناعي أو التهاب القزحية 58،59.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عزل الخلايا البطانية القرنية

قبل الشروع في العمل: عزل الخلايا من العيون العذبة، التي تم الحصول عليها من مسلخ المحلية، في أقرب وقت ممكن بعد enucleating العين. تأكد من أن العين كانت منزوعة النواة من بقرة القصوى 18 شهرا من العمر، خمس دقائق بعد الوفاة والحفاظ عليها في محلول الملح المتوازن ايرل - 1٪ محلول اليود عند 4 درجة مئوية لمدة النقل إلى المختبر.

  1. تأخذ العين من محلول الملح المتوازن وايرل - 1٪ محلول اليود ووضعه في طبق بيتري (100 × 20 مم).
  2. تعقيم العين مع محلول يحتوي على 70٪ من الإيثانول وشطف مع محلول الملح المتوازن ايرل تحتوي على 1٪ اليود.
  3. من هذه الخطوة على، والعمل في غطاء العقيمة. تشريح بعناية القرنية من العين ووضعه في طبق بتري (35 × 10 مم) التي تحتوي على محلول الملح المتوازن ايرل، مع طبقة الخلايا الظهارية التي تواجه التصاعدي. بعناية إزالة أي قزحية STI الأنسجة المتبقيةليرة لبنانية تعلق على القرنية إذا لزم الأمر.
  4. نقل القرنية لمحلول الملح المتوازن ايرل آخر تحتوي على طبق بيتري مع طبقة الخلايا البطانية التصاعدي وشطف مرتين مع محلول الملح المتوازن ايرل.
  5. نقل القرنية مع الطبقة البطانية التي تواجه التصاعدي إلى الرملية، وهو طبق على شكل كوب، وتغطية ذلك مع متوسط ​​النمو. يتكون المتوسطة نمو متوسطة Dulbecco في التعديل النسر يحتوي على 25 الجلوكوز ملي، و 10٪ مصل بقري جنيني، 6.6٪ L-الجلوتامين، 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين-B، و 1٪ خليط مضاد حيوي مضاد فطري تحتوي على 10،000 وحدة / مل من البنسلين، 10،000 ميكروغرام / مل من الستربتوميسين، و 25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B.
  6. إزالة المتوسطة مع ماصة الشفط.
  7. تطبيق 300 ميكرولتر من محلول التربسين (0.5 غرام / لتر) إلى الطبقة البطانية للقرنية (يتم الانتهاء من جميع الخطوات التي تشمل التربسين باستخدام نفس التركيز).
  8. وضع الساعة الرملية التي تحتوي على القرنية في طبق بيتري تغطيتها ووضعها في المؤتمر الوطني العراقيubator لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  9. كشط بلطف الخلايا البطانية بعيدا عن القرنية مع مصقول النار هوك على شكل الزجاج ماصة باستير في غطاء العقيمة.
  10. تمتص قبالة محلول يحتوي على الخلايا البطانية وإضافته إلى قوارير الثقافة (25 سم 2) تحتوي على 4 مل من مستنبت.
  11. تطبيق 300 ميكرولتر من متوسط ​​النمو إلى القرنية وتكرار تجريف وإضافة محلول يحتوي على الخلايا البطانية للقارورة الثقافة.
  12. كرر هذه الخطوة الأخيرة (1.11) مرة أخرى.
  13. وضع الثقافة قوارير تحتوي على الخلايا البطانية القرنية في متوسط ​​النمو في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  14. بعد يومين، إضافة 6 مل من مستنبت.
  15. تحديث المتوسطة النمو كل يوم الثاني.

2. الثقافة الخلية

  1. إزالة مستنبت وغسل الخلايا مرتين مع محلول الملح المتوازن ايرل، وعندما يتم التوصل confluency (داخل ابوT 10 أيام بعد العزلة).
  2. إضافة 1.5 مل من محلول التربسين إلى الخلايا لفصل بينها ووضع القارورة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 3 إلى 4 دقائق.
  3. إضافة 12 مل من وسط النمو. ماصة متوسطة ثلاث مرات الدخول والخروج لتفريق الخلايا وعدد الخلايا.
  4. بذور الخلايا مع جزء متغير تبعا لكثافة الخلايا ووضعها في الحاضنة. إعداد شريحتين جيدا حجرات (بمساحة 4.2 سم 2) مع عدد خلايا من خلايا 165،000 (39،286 كثافة الخلايا لكل سم 2). إعداد 80 سم 2 قوارير الثقافة لمرور جديدة في مناطق ذات كثافة من 6،250 لكل سم 2، وإضافة مستنبت الطازجة تصل إلى وحدة تخزين ما مجموعه 25 مل.
  5. تحديث المتوسطة كل يومين.
  6. يتم التوصل Confluency من طبقة الخلايا بعد 3 إلى 4 أيام. استخدام الخلايا لإجراء التجارب.
  7. عندما يتم التوصل confluency من طبقة الخلايا في قوارير، كرر الخطوات من 2،1-2،6. مزارع الخلايا يصل إلى مرور 2 يمكن استخدامها جمعةأو التجارب.

3. التحفيز الميكانيكي لإحداث موجة الكالسيوم

  1. تحميل الخلايا في الشريحة حجرات مع 10 ميكرومتر فلوو-4 صباحا في الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حين تهز بلطف.
  2. إزالة فلوو-04:00 حل، وغسل الخلايا خمس مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة، احتضان الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة وترك الخلايا لمدة لا تقل عن 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل القياس.
  3. تثير في 488 نانومتر مع الأرجون ليزر واستخدام شعاع الخائن HFT 488، وجمع الانبعاثات مضان في 530 نانومتر باستخدام longpass الانبعاثات مرشح LP 505، تعيين الثقب في الحد الأدنى. استخدام الغمر 40X الهدف النفط (هواء، 1.2 NA). في التجارب مع ARL-67156، واستخدام الهدف 10X (هواء، 0.3 NA).
  4. بحث عن حقل في الخلايا التي هي متكدسة على المجهر متحد البؤر.
  5. موقف ماصة بحيث يكون في 45 درجة فيما يتعلق الشريحة حجرات ولمس غشاء الخلية.إثارة (≈ 1 ثانية) التحفيز الميكانيكي قصيرة إلى خلية واحدة. يتكون التحفيز الميكانيكي ل، تشوه قصيرة الأمد الحاد للخلية عن طريق لمس لفترة وجيزة أقل من 1٪ من غشاء الخلية مع micropipette الزجاج (قطر الحافة <1 ميكرون) بالإضافة إلى nanopositioner الكريستال كهرضغطية، تعمل من خلال مكبر للصوت الذي هو شنت على الصغرى مناور. مصنوعة بال micropipettes الزجاج مع ساحبة مسرى مكروي. تأكد من أن nanopositioner تشغلها الجهد بين 0.2 و 1.5 V خلال التحفيز الميكانيكي. A الجهد أعلى من 1.5 V يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا. لكل نوع من الخلايا وحالة، والجهد الأمثل لتحفيز الميكانيكية دون تلف الخلايا يجب أن تحدد بعناية من خلال تطبيق سلسلة من الفولتية المنخفضة بدءا من (0.2 V) على ارتفاع (1.5 V) الجهد. الجهد هو مقياس لقوة من التحفيز منذ هذا الجهد يحدد إجهاد والتوتر التي يتم تطبيقها على غشاء الخلية. الويمكن حساب قوة من التحفيز الميكانيكي عن طريق ضرب إجهاد ميكانيكي مع المنطقة. نظرا لأن كلا من منطقة (<3.14 ميكرون 2) والضغط الميكانيكية هي منخفضة جدا، وقوة من التحفيز الميكانيكي منخفضة. (لاحظ أنه عند تلف خلية، التسريبات مضان الخروج من الخلية والخلية يتحول الظلام.)
  6. قياس التغيرات المكانية في [كا 2 +] ط أعقاب التحفيز الميكانيكي مع المجهر متحد البؤر.
  7. جمع وتخزين الصور.
  8. رسم المنطقة المضلعة من مصلحة لتحديد مساحة السطح الكلي للخلايا مستجيبة (منطقة نشطة، AA) باستخدام البرنامج من المجهر متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنفيذ جميع التجارب في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة، ويتم تنفيذ بروتوكول يتم شرحها تحت إشراف وموافقة ورعاية الحيوان واللجنة الاستخدام من جامعة لوفين الكاثوليكية.

في الأبقار الخلايا البطانية القرنية (BCEC)، يتم التعبير عن تقاطعات الفجوة الوظيفية وكلا الفجوة صلي الاتصالات بين الخلايا والاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي تسهم إسهاما كبيرا في التواصل بين الخلايا بطريقة تفا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا المخطوط، ونحن تصف طريقة بسيطة لقياس بين الخلايا كا 2 + انتشار الموجة في الطبقات الوحيدة من الأبقار الخلايا البطانية القرنية الأولية عن طريق توفير التحفيز الميكانيكي المترجمة والتي تسيطر عليها باستخدام micropipette. الخلايا حفز ميكانيكيا الاستجابة مع زيادة المحلية في مجال الملكية الفكرية داخل الخلايا 3 والكالسيوم 2 +، وكلاهما جزيئات إشارات بين الخلايا الأساسية التي تدفع بين الخلايا كا 2 + موجة انتشار 11،67. IP 3

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد أعمال البحث التي أجريت في المختبر من المنح المقدمة من مؤسسة أبحاث - فلاندرز (FWO؛ أرقام منحة G.0545.08 وG.0298.11)، وبين الجامعات الجذب برنامج البولنديين (سياسة العلوم البلجيكي؛ منح عدد P6/28 وP7/13) ومضمن في الأوساط البحثية FWO المدعومة. CDH هو زميل ما بعد الدكتوراه من مؤسسة البحوث - فلاندرز (FWO). المؤلفون ممتنون جدا لجميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر الجزيئية والخلوية اشارة (جامعة لوفين الكاثوليكية)، د. SP سرينيفاس (مدرسة جامعة إنديانا في علم البصريات، الولايات المتحدة الأمريكية)، ومختبر الدكتور Leybaert (جامعة غنت) ولل د. Vinken (VUB) الذين قدموا مناقشات مفيدة، إلى أقصى حد أو الإجراءات شاركوا في تطوير أدوات لدراسة hemichannels connexin.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول الملح المتوازن من إيرل (EBSS) مجساتInvitrogen-gibco-Molecular (كارلسروه ، ألمانيا)14155-048
اليودسيجما ألدريتش (ديزنهوفن ، ألمانيا)38060-1EA
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)مجساتInvitrogen-gibco-Molecular Projectes (كارلسروه ، ألمانيا)11960-044
L-glutamine (Glutamax)مجسات Invitrogen-gibco-Molecular (كارلسروه ، ألمانيا)35050-038
Amphotericin-BSigma-Aldrich (Deisenhofen ، ألمانيا)A2942
خليط المضادات الحيوية والمضادة للفطرياتالمجسات الجزيئية Invitrogen-gibco (كارلسروه ، ألمانيا)15240-096
مجسات التربسينInvitrogen-gibco-Molecular (كارلسروه ، ألمانيا)25300-054
Dulbeccoمجسات PBSInvitrogen-Gibco-Molecular Projectes (كارلسروه ، ألمانيا)14190-091
Fluo-4 AMInvitrogen-Gibco-Molecular Engines (كارلسروه ، ألمانيا)F14217
ARL-67156 (6-N ، N-Diethyl-b ، g-dibromomethylene-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen ، ألمانيا)A265
Apyrase VISigma-Aldrich (Deisenhofen ، ألمانيا)A6410
Apyrase VIISigma-Aldrich (Deisenhofen ، ألمانيا)A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR) تخليقالببتيد المخصص
Gap27 (SRPTEKTIFII) التحكمتخليق
(SRGGEKNVFIV)تخليق
siRNA1 Cx43 (الإحساس: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) تم شراء siRNA الملدن من Eurogentec (Luik ، بلجيكا)
siRNA2 Cx43 (الإحساس: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) تم شراء siRNA الملدن في Eurogentec (Luik ، بلجيكا)
siRNA التدافع: تسلسل مشوش ل siCx43-1 (الإحساس: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) تم شراء siRNA الملدن في Eurogentec (Luik ، بلجيكا)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)الإلكترون الحراري (Ulm ، ألمانيا)
TAT-L2-H126K / I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) ELECTRON (Ulm ، ألمانيا)
منزليحتان زجاجيتانمن الغرف مختبر Tek Nunc (روسكيلد ، الدنمارك)155380
مجهر متحد البؤر Carl Zeiss Meditec (جينا ، ألمانيا)LSM510
بيز &# 8211; جهاز تحديد المواقع النانوية الكريستالية المحاضرة (Piezo Flexure NanoPositioner)PI Polytech (كارلسروه ، ألمانيا)P-280
HVPZT-amplifierPI Polytech (كارلسروه ، ألمانيا)E463 HVPZT-amplifier
أنابيب زجاجية (استبدال الزجاج 3.5 نانولتر) WorldPrecision Instruments، Inc. ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية4878
Micr &# 8211 ؛ مجتذب lectrode Zeitz Instrumente (ميونيخ ، ألمانيا)WZ DMZ-Universal Puller
في الببتيد المخصصالببتيد المخصص THERMO

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18, 592-600 (2006).
  2. Mese, G., Richard, G., White, T. W. Gap junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2516-2524 (2007).
  3. Bruzzone, R., White, T. W., Paul, D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem. 238, 1-27 (1996).
  4. White, T. W., Bruzzone, R., Paul, D. L. The connexin family of intercellular channel forming proteins. Kidney Int. 48, 1148-1157 (1995).
  5. Decrock, E., et al. Connexin-related signaling in cell death: to live or let die? Cell Death Differ. 16, 524-536 (2009).
  6. Herve, J. C. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 1-4 (2007).
  7. Herve, J. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Duffy, H. S. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 29-65 (2007).
  8. Bruzzone, R., Barbe, M. T., Jakob, N. J., Monyer, H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 92, 1033-1043 (2005).
  9. Ebihara, L., Steiner, E. Properties of a nonjunctional current expressed from a rat connexin46 cDNA in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 102, 59-74 (1993).
  10. Evans, W. H., De Vuyst, E., Leybaert, L. The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter the signalling limelight. Biochem. J. 397, 1-14 (2006).
  11. Leybaert, L., Sanderson, M. J. Intercellular Ca2+ waves: mechanisms and function. Physiol. Rev. 92, 1359-1392 (2012).
  12. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  13. Himpens, B., Stalmans, P., Gomez, P., Malfait, M., Vereecke, J. Intra- and intercellular Ca2+ signaling in retinal pigment epithelial cells during mechanical stimulation. Faseb J. 13, 63-68 (1999).
  14. Williams, K. K., Watsky, M. A. Bicarbonate promotes dye coupling in the epithelium and endothelium of the rabbit cornea. Curr. Eye Res. 28, 109-120 (2004).
  15. Hernandez Galindo, E. E., Theiss, C., Steuhl, K. P., Meller, D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 76, 303-314 (2003).
  16. Williams, K., Watsky, M. Gap junctional communication in the human corneal endothelium and epithelium. Curr. Eye Res. 25, 29-36 (2002).
  17. Anderson, S. C., Stone, C., Tkach, L., SundarRaj, N. Rho and Rho-kinase (ROCK) signaling in adherens and gap junction assembly in corneal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 978-986 (2002).
  18. Joyce, N. C., Harris, D. L., Zieske, J. D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2572-2583 (1998).
  19. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Trinkaus-Randall, V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  20. Klepeis, V. E., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randall, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. J. Cell Sci. 114, 4185-4195 (2001).
  21. Laux-Fenton, W. T., Donaldson, P. J., Kistler, J., Green, C. R. Connexin expression patterns in the rat cornea: molecular evidence for communication compartments. Cornea. 22, 457-464 (2003).
  22. Rae, J. L., Lewno, A. W., Cooper, K., Gates, P. Dye and electrical coupling between cells of the rabbit corneal endothelium. Curr. Eye Res. 8, 859-869 (1989).
  23. Watsky, M. A., Rae, J. L. Dye coupling in the corneal endothelium: effects of ouabain and extracellular calcium removal. Cell Tissue Res. 269, 57-63 (1992).
  24. Williams, K. K., Watsky, M. A. Dye spread through gap junctions in the corneal epithelium of the rabbit. Curr. Eye Res. 16, 445-452 (1997).
  25. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Thrombin inhibits intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells by modulation of hemichannels and gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 120-133 (2007).
  26. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Reduced intercellular communication and altered morphology of bovine corneal endothelial cells with prolonged time in cell culture. Curr. Eye Res. 34, 454-465 (2009).
  27. D'hondt, C., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Adenosine Opposes Thrombin-Induced Inhibition of Intercellular Calcium Wave in Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 1518-1527 (2007).
  28. Gomes, P., Srinivas, S. P., Van Driessche, W., Vereecke, J., Himpens, B. ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1208-1218 (2005).
  29. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. ATP-dependent paracrine intercellular communication in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 104-113 (2005).
  30. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Gap junctional intercellular communication in bovine corneal endothelial cells. Exp Eye Res. , (2006).
  31. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4816-4827 (2008).
  32. Ponsaerts, R., et al. RhoA GTPase Switch Controls Cx43-Hemichannel Activity through the Contractile System. PLoS ONE. 7, e42074(2012).
  33. Ponsaerts, R., et al. Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity. Faseb J. 24, 4378-4395 (2010).
  34. Charles, A. Reaching out beyond the synapse: glial intercellular waves coordinate metabolism. Sci STKE. 2005, pe6(2005).
  35. Laird, D. W. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem. J. 394, 527-543 (2006).
  36. Kelsell, D. P., Dunlop, J., Hodgins, M. B. Human diseases: clues to cracking the connexin code. Trends Cell Biol. 11, 2-6 (2001).
  37. Pearson, R. A., Dale, N., Llaudet, E., Mobbs, P. ATP released via gap junction hemichannels from the pigment epithelium regulates neural retinal progenitor proliferation. Neuron. 46, 731-744 (2005).
  38. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Randall, V. T. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  39. Cotrina, M. L., Lin, J. H., Lopez-Garcia, J. C., Naus, C. C., Nedergaard, M. ATP-mediated glia signaling. J. Neurosci. 20, 2835-2844 (2000).
  40. Burnstock, G., Williams, M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 862-869 (2000).
  41. Schwiebert, E. M., Zsembery, A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim. Biophys Acta. 1615, 7-32 (2003).
  42. Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., Harden, T. K. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol. Pharmacol. 64, 785-795 (2003).
  43. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol. 265, C577-C606 (1993).
  44. Blair, S. A., Kane, S. V., Clayburgh, D. R., Turner, J. R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease. Lab. Invest. 86, 191-201 (2006).
  45. Boudreault, F., Grygorczyk, R. Cell swelling-induced ATP release and gadolinium-sensitive channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C219-C226 (2002).
  46. Romanov, R. A., Rogachevskaja, O. A., Khokhlov, A. A., Kolesnikov, S. S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. J. Gen. Physiol. 132, 731-744 (2008).
  47. Pelegrin, P., Surprenant, A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J. 25, 5071-5082 (2006).
  48. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272, 735-738 (1996).
  49. D'hondt, C., et al. Pannexin channels in ATP release and beyond: an unexpected rendezvous at the endoplasmic reticulum. Cell Signal. 23, 305-316 (2011).
  50. Leybaert, L., et al. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell Commun. Adhes. 10, 251-257 (2003).
  51. Stout, C. E., Costantin, J. L., Naus, C. C., Charles, A. C. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J. Biol. Chem. 277, 10482-10488 (2002).
  52. Verma, V., Hallett, M. B., Leybaert, L., Martin, P. E., Howard Evans, W. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur. J. Cell Biol. , (2008).
  53. Pharmacol, B. rJ. 147, S172-S181 (2006).
  54. Slakey, L. L., Gordon, E. L., Pearson, J. D. A comparison of ectonucleotidase activities on vascular endothelial and smooth muscle cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 603, 366-378 (1990).
  55. Gordon, E. L., Pearson, J. D., Slakey, L. L. The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J. Biol. Chem. 261, 15496-15507 (1986).
  56. Moerenhout, M., Himpens, B., Vereecke, J. Intercellular communication upon mechanical stimulation of CPAE- endothelial cells is mediated by nucleotides. Cell Calcium. 29, 125-136 (2001).
  57. Ralevic, V., Burnstock, G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50, 413-492 (1998).
  58. Edelhauser, H. F. The resiliency of the corneal endothelium to refractive and intraocular surgery. Cornea. 19, 263-273 (2000).
  59. George, A. J., Larkin, D. F. Corneal transplantation: the forgotten graft. Am. J. Transplant. 4, 678-685 (2004).
  60. Hong, S. J., Wu, K. Y., Wang, H. Z., Fong, J. C. Change of cytosolic Ca2+ mobility in cultured bovine corneal endothelial cells by endothelin-1. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 19, 1-9 (2003).
  61. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Histamine H1 receptor-mediated Ca2+ signaling in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, 3041-3049 (1992).
  62. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Agonist-induced Ca2+ mobilization in cultured bovine and human corneal endothelial cells. Curr. Eye Res. 12, 303-311 (1993).
  63. Srinivas, S. P., Yeh, J. C., Ong, A., Bonanno, J. A. Ca2+ mobilization in bovine corneal endothelial cells by P2 purinergic receptors. Curr. Eye Res. 17, 994-1004 (1998).
  64. Satpathy, M., Gallagher, P., Jin, Y., Srinivas, S. P. Extracellular ATP opposes thrombin-induced myosin light chain phosphorylation and loss of barrier integrity in corneal endothelial cells. Exp Eye Res. 81, 183-192 (2005).
  65. Srinivas, S. P., et al. Cell volume response to hyposmotic shock and elevated cAMP in bovine trabecular meshwork cells. Exp. Eye Res. 78, 15-26 (2004).
  66. D'hondt, C., Ponsaerts, R., De Smedt, H., Bultynck, G., Himpens, B. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions. Bioessays. 31, 953-974 (2009).
  67. Boitano, S., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular propagation of calcium waves mediated by inositol trisphosphate. Science. 258, 292-295 (1992).
  68. De Vuyst, E., et al. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. EMBO J. 25, 34-44 (2006).
  69. De Vuyst, E., et al. Ca2+ regulation of connexin 43 hemichannels in C6 glioma and glial cells. Cell Calcium. 46, 176-187 (2009).
  70. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium waves propagate through radial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex. Neuron. 43, 647-661 (2004).
  71. Iyer, S., Deutsch, K., Yan, X., Lin, B. Batch RNAi selector: a standalone program to predict specific siRNA candidates in batches with enhanced sensitivity. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 85, 203-209 (2007).
  72. Stehberg, J., et al. Release of gliotransmitters through astroglial connexin 43 hemichannels is necessary for fear memory consolidation in the basolateral amygdala. Faseb J. 26, 3649-3657 (2012).
  73. Evans, W. H., Bultynck, G., Leybaert, L. Erratum to: Manipulating Connexin Communication Channels: Use of Peptidomimetics and the Translational Outputs. J. Membr. Biol. 245, 451(2012).
  74. Majumder, P., et al. ATP-mediated cell-cell signaling in the organ of Corti: the role of connexin channels. Purinergic Signal. 6, 167-187 (2010).
  75. Carvalho, A. C., et al. affects intracellular Ca2+ stores and induces Ca2+ wave propagation. Cell Death Differ. 11, 1265-1276 (2004).
  76. Torres, A., et al. Extracellular Ca2+ acts as a mediator of communication from neurons to glia. Sci. Signal. 5, ra8(2012).
  77. Decrock, E., et al. Transfer of IP(3) through gap junctions is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 19 (3), 947-957 (2012).
  78. Beltramello, M., Piazza, V., Bukauskas, F. F., Pozzan, T., Mammano, F. Impaired permeability to Ins(1,4,5)P3 in a mutant connexin underlies recessive hereditary deafness. Nat. Cell Biol. 7 (1,4,5), 63-69 (2005).
  79. Bukauskas, F. F., Bukauskiene, A., Verselis, V. K. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J. Gen. Physiol. 119, 171-186 (2002).
  80. Bukauskas, F. F., Verselis, V. K. Gap junction channel gating. Biochim. Biophys. Acta. 1662, 42-60 (2004).
  81. Dahl, G. Where are the gates in gap junction channels? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 1047-1052 (1996).
  82. Retamal, M. A., Schalper, K. A., Shoji, K. F., Bennett, M. V., Saez, J. C. Opening of connexin 43 hemichannels is increased by lowering intracellular redox potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8322-8327 (2007).
  83. Shibayama, J., et al. Effect of charge substitutions at residue his-142 on voltage gating of connexin43 channels. Biophys. J. 91, 4054-4063 (2006).
  84. Desplantez, T., Verma, V., Leybaert, L., Evans, W. H., Weingart, R. Gap26, a connexin mimetic peptide, inhibits currents carried by connexin43 hemichannels and gap junction channels. Pharmacological Research: The Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 65, 546-552 (2012).
  85. Delmar, M. Gap junctions as active signaling molecules for synchronous cardiac function. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 11, 118-120 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Fluo4 AM ATP

مقالات ذات صلة