ثقافة الخلية الأولية هي تقنية مفيدة لتحليل فئات معينة من السكان من الخلايا، لا سيما من أجنة الفئران المعدلة وراثيا في مراحل نمو محددة. هنا، يتم تشريح البطينين الجنينية وفصلها، والخرز الأجسام المضادة، مترافق الاعتراف وفصل الخلايا البطانية لمزيد من التحليل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ثقافة الخلية عززت بشكل كبير من قدرتنا على تقييم السكان من الخلايا الفردية في ظل ظروف ثقافة لا تعد ولا تحصى. بينما خطوط الخلايا خلد توفر مزايا كبيرة لسهولة استخدامها، وهذه خطوط الخلايا غير متوفرة لجميع أنواع الخلايا المحتملة. من خلال عزل الخلايا الأولية من منطقة محددة من الفائدة، ولا سيما من الماوس المعدلة وراثيا، ودراسات أكثر دقة لا يمكن أن يؤديها. الأسلوب الذي ينطوي على تشريح الأساسية للجهاز أو الجهاز الجزئي للاهتمام (مثل القلب أو منطقة محددة من القلب) والفصل بين الجهاز إلى الخلايا واحد. ثم يتم تحضين هذه الخلايا مع حبات مغناطيسية مترافق إلى الأجسام المضادة التي تعترف نوع من الخلايا في المصالح. الخلايا من الفائدة يمكن أن ثم تكون معزولة مع استخدام المغناطيس، مع التربسين الحضانة قصيرة الانفصال الخلايا من الخرز. ويمكن بعد هذه الخلايا المعزولة يكون مثقف وتحليلها كما تريد. وقد تم تصميم هذه التقنية في الأصل لجهاز الماوس الكبارو لكن يمكن زيادتها بسهولة إلى أسفل للاستخدام مع أجهزة الجنينية، كما هو موضح هنا. لأن مصلحتنا هي في الأوعية الدموية التاجية النامية، أردنا أن دراسة هذه الفئة من السكان من الخلايا الجنينية خلال مراحل محددة. وهكذا، فإن البروتوكول الأصلي إلى تعديل لتكون متوافقة مع صغر حجم البطينين الجنينية والعائد قدرة منخفضة من الخلايا البطانية في هذه المراحل التنموية. الاستفادة من هذا النهج تحجيم، قمنا بتقييم التاجي الضفيرة إعادة عرض في المعدلة وراثيا الجنينية الخلايا البطانية البطين.
المقدمة
ظهور خطوط الخلايا خلد قد أحدثت ثورة بيولوجيا الخلية الأساسية 1. وتستمد خطوط الخلايا المتوفرة حاليا من مجموعة واسعة من الأجهزة وتشمل جميع أنواع الخلايا الرئيسية. ومع ذلك، خطوط الخلايا التي أنشئت لديها بعض القيود. من الواضح أن عملية تخليد تغيير سلوك الخلايا، وتحديدا فيما يتعلق مدى الحياة والانتشار، ولكن يمكن أن تؤثر أيضا على التعبير عن البروتينات غير متوقعة، مثل البروتينات هيكل الخلية 2. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن العديد من خطوط الخلايا المختلفة المتاحة، وهناك تنوع كبير بين حتى نوع خلية واحدة داخل الكائن الحي بأكمله. الخلايا البطانية على وجه الخصوص تظهر السلوكيات المتنوعة سواء كانت تقوم على خط الشراي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الخرز الضد مترافق
- يوم واحد قبل تشريح، والجمع بين الأضداد من خيار مع Dynabeads المناسبة (مثل الفئران Dynabeads مفتش للجسم التي أثيرت في الفئران، 4 × 10 8 حبات / مل) في تعليمات الشركة الصانعة. لBD الفئران مكافحة CD31 الأجسام المضادة (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر، وتستخدم لعزل الخلايا البطانية)، يتم إضافة 3 ميكرولتر الضد لكل ميكرولتر 25 حبات، لتركيز النهائي من 1.5 ميكروغرام الأجسام المضادة لمكافحة CD31 و 1 × 10 7 حبات / 25 ميكرولتر العازلة.
- احتضان حبات والأ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدام أجسام مضادة محددة البطانية التي تعترف CD31، تم عزل الخلايا البطانية من البطينين من الجنينية (E) 13.5 (الشكل 1A) و 18.5 (أرقام 1B-1D) الأجنة. عندما نمت على طبق ثقافة غير المعالجة، تبقى هذه الخلايا تقريب وسوف تشكل نمطا حصوه إذا قرب متموجة (الشكل 1A). كما تم استخدام تمييع الكولاجين لمعطف الآبار، وبينما الخلايا البطانية والتمسك به (الشكل 1B)، فإنها تشكل أقل من السلاسل عندما مطلي على هلام الكولاجين (أرق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
العمل مع الخلايا الجنينية الأولية يسمح التجارب رواية لمعالجة في المختبر الخطوات الحاسمة للتنمية. ومع ذلك، فإن إجراء العزل ليست تافهة. وتشمل الخطوات الحاسمة لعزل أي نوع من الخلايا ضمان أن يتم فصل الخلايا بشكل جيد على الهضم كولاجيناز ثم أنهم علقت جيدا خلال خطوات الغسيل. تشريح الميكانيكية من قبل pipetting يساعد كثيرا فصل الخلايا أثناء الخطوة كولاجيناز، والخطوة تصفية يزيل كتل من الخلايا. هذه الخطوات تحسين نقاء السكان والإنتاج.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر اندريا بورتبري لقراءة نقدية للمخطوطة، ومختبر خدمة مجهر UNC للحصول على المساعدة مع الوقت الفاصل بين التصوير، والمعاهد الوطنية للصحة (منحة # R01HL061656) لدعم التمويل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم
الشركة
رقم فهرسي
التعليقات
في الحامل مكافحة TD Colspan = "4" ><قوي>المعدات< / قوي >
| REAGENTS < / strong > | |||
| الوقت المناسب للفئران | ليتم تشريحها في المرحلة الجنينية من الاهتمام | ||
|---|---|---|---|
| الفئران CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| كولاجيناز ، النوع الأول | ورثينجتون الكيمياء الحيوية | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| وسط نمو الخلايا البطانية | (صنع في المختبر كما هو موضح في الملاحظات) | DMEM يحتوي على 20٪ FBS ، 5 & mu ؛ M &# 946 ؛ -mercapt &# 8211 ؛ ثانول ، 50 مو ؛ جم / مل تخطيط كهربية القلب ، و 1x البنسلين / الستربتومايسين | |
| &# 946 ؛ -mercapt &# 8211 ؛ ثانول | سيجما ألدريتش | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies، Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | تم تحضير اللوحة باستخدام هلام الكولاجين الرقيق ، كما هو موضح في 6< / sup> ؛ مساحة سطح العمل 10 مم 2< / sup> |
| الكولاجين من النوع الأول | BD | 354236 | الاستخدام في النهائي تركيز 1.5 مجم / مل |
| M199 ، 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | يستخدم حسب التوجيهات في 13< / sup> < |
| مجهر مجني | نيكون | SMZ645 | |
| حاضنة ثقافة الخلايا | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| جهاز طرد مركزي على الطاولة | Thermo | 75002430 | |
المراجع
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
