ثقافة الخلية الأولية هي تقنية مفيدة لتحليل فئات معينة من السكان من الخلايا، لا سيما من أجنة الفئران المعدلة وراثيا في مراحل نمو محددة. هنا، يتم تشريح البطينين الجنينية وفصلها، والخرز الأجسام المضادة، مترافق الاعتراف وفصل الخلايا البطانية لمزيد من التحليل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ثقافة الخلية عززت بشكل كبير من قدرتنا على تقييم السكان من الخلايا الفردية في ظل ظروف ثقافة لا تعد ولا تحصى. بينما خطوط الخلايا خلد توفر مزايا كبيرة لسهولة استخدامها، وهذه خطوط الخلايا غير متوفرة لجميع أنواع الخلايا المحتملة. من خلال عزل الخلايا الأولية من منطقة محددة من الفائدة، ولا سيما من الماوس المعدلة وراثيا، ودراسات أكثر دقة لا يمكن أن يؤديها. الأسلوب الذي ينطوي على تشريح الأساسية للجهاز أو الجهاز الجزئي للاهتمام (مثل القلب أو منطقة محددة من القلب) والفصل بين الجهاز إلى الخلايا واحد. ثم يتم تحضين هذه الخلايا مع حبات مغناطيسية مترافق إلى الأجسام المضادة التي تعترف نوع من الخلايا في المصالح. الخلايا من الفائدة يمكن أن ثم تكون معزولة مع استخدام المغناطيس، مع التربسين الحضانة قصيرة الانفصال الخلايا من الخرز. ويمكن بعد هذه الخلايا المعزولة يكون مثقف وتحليلها كما تريد. وقد تم تصميم هذه التقنية في الأصل لجهاز الماوس الكبارو لكن يمكن زيادتها بسهولة إلى أسفل للاستخدام مع أجهزة الجنينية، كما هو موضح هنا. لأن مصلحتنا هي في الأوعية الدموية التاجية النامية، أردنا أن دراسة هذه الفئة من السكان من الخلايا الجنينية خلال مراحل محددة. وهكذا، فإن البروتوكول الأصلي إلى تعديل لتكون متوافقة مع صغر حجم البطينين الجنينية والعائد قدرة منخفضة من الخلايا البطانية في هذه المراحل التنموية. الاستفادة من هذا النهج تحجيم، قمنا بتقييم التاجي الضفيرة إعادة عرض في المعدلة وراثيا الجنينية الخلايا البطانية البطين.
المقدمة
ظهور خطوط الخلايا خلد قد أحدثت ثورة بيولوجيا الخلية الأساسية 1. وتستمد خطوط الخلايا المتوفرة حاليا من مجموعة واسعة من الأجهزة وتشمل جميع أنواع الخلايا الرئيسية. ومع ذلك، خطوط الخلايا التي أنشئت لديها بعض القيود. من الواضح أن عملية تخليد تغيير سلوك الخلايا، وتحديدا فيما يتعلق مدى الحياة والانتشار، ولكن يمكن أن تؤثر أيضا على التعبير عن البروتينات غير متوقعة، مثل البروتينات هيكل الخلية 2. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن العديد من خطوط الخلايا المختلفة المتاحة، وهناك تنوع كبير بين حتى نوع خلية واحدة داخل الكائن الحي بأكمله. الخلايا البطانية على وجه الخصوص تظهر السلوكيات المتنوعة سواء كانت تقوم على خط الشرايين أو الأوردة وأي نوع من تدفق موجود في السفينة 3. حتى أكثر إلحاحا من منظور إنمائي، ومع ذلك، هو أن الغالبية العظمى من خطوط الخلايا المتاحة مستمدة من أنسجة البالغين (انظر، على سبيل المثال خميسوقال انه جمع متاحة عبر آي تي سي سي). هذه خطوط الخلايا الكبار الأرجح لا ألخص الطبيعة الديناميكية لسلائفها الجنينية. ويتغير بسرعة الزمانية المكانية أنماط التعبير الجيني لوحظت خلال تطوير تشير أيضا إلى أن خلية البطانية من جهاز واحد في كل مرحلة تنموية معينة قد لا تتصرف بنفس الطريقة باعتبارها الخلية البطانية من نفس الجهاز في مرحلة تنموية مختلفة.
كبديل لاستخدام المتاحة تجاريا خطوط الخلايا خلده، الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن الأنسجة محددة من الفائدة. من بين مزايا هذه التقنية، وهذه الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن جهاز معين أو حتى جزء من الجهاز في أي مرحلة تنموية محددة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن مجموعة واسعة من الحيوانات المعدلة وراثيا المتوفرة، مما يتيح دراسة في المختبر من خروج المغلوب الجينات والضربة القاضية في حين تجنب مشاكل أخرى مثل كفاءة ترنسفكأيشن للفي. ليس من المستغرب، وكثيروقد نشرت تقنيات بالتفصيل كيفية عزل أنواع معينة من الخلايا 4،5. بشكل عام، هذه التقنيات تشمل جمع المنطقة من الفائدة، وعدم الربط بين الخلايا، ووضع علامات على نوع من الخلايا محددة من الفائدة، وعزل تلك الخلايا لمزيد من التحليل.
لدراسة السكان الجنينية المبكرة من الخلايا البطانية التاجي، ان قلصنا تقنية 4 التي تم نشرها مسبقا للاستخدام مع جهاز أصغر. مع هذا الإجراء تحجيم، يمكننا عزل الخلايا البطانية التاجية من القلب الجنينية في مراحل جنينية محددة. ويمكن بعد هذه الخلايا يمكن استخدامها في المقايسات البطانية التقليدية، مثل تحليلات الهجرة. حتى أوائل خطوط الخلايا الجنينية تصبح أكثر انتشارا، والعمل مع الخلايا الأولية هي تقنية لا تقدر بثمن.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الخرز الضد مترافق
- يوم واحد قبل تشريح، والجمع بين الأضداد من خيار مع Dynabeads المناسبة (مثل الفئران Dynabeads مفتش للجسم التي أثيرت في الفئران، 4 × 10 8 حبات / مل) في تعليمات الشركة الصانعة. لBD الفئران مكافحة CD31 الأجسام المضادة (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر، وتستخدم لعزل الخلايا البطانية)، يتم إضافة 3 ميكرولتر الضد لكل ميكرولتر 25 حبات، لتركيز النهائي من 1.5 ميكروغرام الأجسام المضادة لمكافحة CD31 و 1 × 10 7 حبات / 25 ميكرولتر العازلة.
- احتضان حبات والأضداد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
2. إعداد لوحة الكولاجين
- خلايا معزولة تشكيل الأنابيب بسرعة أكبر عندما نمت على هلام الكولاجين بدلا من مجرد لوحة الكولاجين المغلفة. لذلك، مصنوعة المواد الهلامية الكولاجين في الليلة التي سبقت تشريح، كما هو موضح في 6. على الجليد في نسيج الثقافة هود، والجمع بين الكواشف التالية (ما يكفي لمدة 19 بئرا): 206.4 ميكرولتر H العقيمة <الفرعية> 2 O، 140.4 ميكرولتر نوع الكولاجين الأول (4.08 ملغ / مل)، 38.4 ميكرولتر 10X M199، و 1.15 ميكرولتر 5 M هيدروكسيد الصوديوم.
- ماصة 20 ميكرولتر من هذا الجل الكولاجين في الآبار من 384 جيدا نسيج لوحة الثقافة. وضع لوحة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 80 ميكرولتر DMEM إلى كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إزالة مستنبت وكرر مرتين أكثر من ذلك.
- بعد شطف النهائي، إضافة 80 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. إزالة مستنبت قبل إضافة الخلايا المعزولة.
3. المكوس وهضم القلب
- الموت ببطء الماوس توقيت الحوامل في اليوم الجنينية المطلوب باستخدام تقنية القتل الرحيم المعتمدة. تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان في جامعة ولاية كارولينا الشمالية في تشابل هيل.
- مع الماوس في موقف ضعيف، رش تحرري الجانب البطني من الأنثى مع الايثانول 70٪ قبلتشريح. باستخدام ملقط لرفع الجلد أسفل البطن والعضلات بعيدا عن الأعضاء الداخلية، وقطع فتح تجويف الأنثى في أسفل البطن لتصور أعضائه الداخلية.
- عقد عنق الرحم مع ملقط، وقطع بعناية الذيلية إلى ملقط والبدء في رفع قرن الرحم من تجويف البطن. في حين رفع قرن الرحم، وقطع بعيدا أي النسيج الضام الذي يحمل قرن في المكان. لإنهاء استئصال قرن الرحم، وقطع تقاطع قرن الرحم مع قناة البيض لتحرير قرن الرحم.
- ضع قرن الرحم في طبق بتري تحتوي الباردة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وشطف حسب الحاجة. خفض فتح قرن الرحم عن طريق خط الوسط لفضح الحويصلات الجنينية المرفقة.
- خفض فتح الكيس الجنيني عند تقاطع المشيمة والجنين لتجنب قصد قطع الجنين واسترجاع الجنين. وضع الجنين في طبق بيتري الثانية مع برنامج تلفزيوني الباردة. العودة طبق بيتري مع قرن الرحم إلى جليد.
- Decapitate الجنين لتحسين الوصول إلى جدار الصدر. إذا التنميط الجيني هو ضروري، وقطع الذيل لإزالته وحفظ في أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد.
- مع الجنين على ظهرها، وقطع فتح جدار الصدر لتصور القلب والرئتين. لتجنب قطع القلب، وجعل قطع عمودي على طول الجانب من القفص الصدري، بالقرب من forelimb، تليها قطع أفقي عبر الجزء السفلي من الأضلاع، ثم، وسحب بلطف جدار الصدر صعودا وللخروج من الطريق. من خلال ما يقرب من 13.5 يوم الجنينية، جدار الصدر هو شفاف، والمساعدة في التصور.
- رفع بعناية القلب باستخدام ملقط وقطع الأوعية أدناه. ثم، وقطع فوق سفن كبيرة للافراج عن القلب. إذا لم يتم قطع الأوعية الرئوية، قد تتم إزالة الرئتين مع القلب. وهكذا، وإزالة أنسجة غريبة، مثل الرئتين، إذا لزم الأمر.
- فصل وتجاهل السفن الأذينين والبطينين كبيرة من. باستخدام مقص، اللحم المفروم البطينين إلى قطع صغيرة (حوالي 1 ملم 3 </ سوب>) ووضعت في ما يقرب من 500 ميكرولتر كولاجيناز (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة). الاحتفاظ بعينات على الجليد حتى تم مفروم جميع البطينين ووضعها في كولاجيناز.
- كرر الخطوات السابقة حتى يتم رفعه البطينين من جميع الأجنة، وجمع كل قلب في أنبوب إيبندورف منفصلة. إذا كان كل الأجنة لديها نفس التركيب الوراثي، قد يتم تجميع قلوب في أنبوب إيبندورف واحد. عدد العينات معالجتها في وقت واحد قد تكون محدودة استنادا إلى مغناطيس تستخدم لعزل، وDynaMag (123-21D) تستخدم هنا يحمل بحد أقصى 16 أنابيب إيبندورف.
- وضع البطينين المفروم عند 37 درجة مئوية مع هزاز لمدة 45 دقيقة. كل 15 دقيقة، وإزالة بلطف العينات وماصة صعودا وهبوطا لفصل ميكانيكيا الخلايا.
4. عزل الخلايا البطانية
- تمرير حل البطين للكولاجيناز خلال 70 ميكرون فلتر لإزالة كتل المتبقية من الخلايا.
- الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. نبذطاف، مع استبدال ما يقرب من 200 ميكرولتر FBS 10٪ في DMEM، وماصة صعودا وهبوطا لفصل الخلايا.
- كرر الخطوة السابقة مرة واحدة. الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة بعد الثانية 10٪ FBS / DMEM غسل. resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM.
- أثناء خطوة الطرد المركزي النهائية، وإعداد الخرز.
- وضع أنبوب إيبندورف التي تحتوي على الأجسام المضادة والخرز على مغناطيس لمدة 1 دقيقة.
- مع الأنبوب في مكان على المغناطيس، وإزالة طاف. إزالة أنبوب من المغناطيس وإضافة ما يقرب من 100 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM.
- وضع أنبوب على مغناطيس لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف، ويغسل مرة أخرى مع 10٪ FBS / DMEM. تكرار لما مجموعه 3 يغسل.
- بعد غسل النهائي، resuspend والخرز الأجسام المضادة، مترافق في 10٪ FBS / DMEM (5 ميكرولتر لكل عينة).
- إلى كل عينة الخلية، إضافة 5 ميكرولتر من الخرز الأجسام المضادة، مترافق. ضع تعليق حبة خلية في 4 درجات مئوية مع هزاز FOR 30 دقيقة.
- في تدفق الصفحي هود، ووضع أنابيب إيبندورف تحتوي على خلايا والخرز الأجسام المضادة، مترافق على مغناطيس لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف، وإزالة أنابيب من المغناطيس، ويغسل مع ما يقرب من 100 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM. كرر لمدة 5 يغسل.
- بعد غسل الماضي، وضع أنابيب على مغناطيس لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف، وإزالة أنابيب من المغناطيس. إضافة ما يقرب من 100 DMEM ميكرولتر.
- وضع أنابيب على مغناطيس لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف، وإزالة أنابيب من المغناطيس. prewarmed إضافة 100-200 ميكرولتر 0.25٪ التربسين EDTA-. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق.
- وضع أنابيب على مغناطيس لمدة 2 دقيقة. نقل بعناية طاف تحتوي الخلية الى أنابيب إيبندورف الطازجة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س.
- إزالة طاف. resuspend الخلايا في 80-100 ميكرولتر متوسطة النمو وطبق في 96 - 384 أو جيدا طبق ثقافة المعالجة، اعتمادا على العائد المتوقع(حوالي 450-600 الخلايا من البطينين من E14.5-E16.5 الأجنة). لخلايا بطانة الأوعية الدموية، واستخدام البطانية نمو الثقافة المتوسطة (المعرف أدناه).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدام أجسام مضادة محددة البطانية التي تعترف CD31، تم عزل الخلايا البطانية من البطينين من الجنينية (E) 13.5 (الشكل 1A) و 18.5 (أرقام 1B-1D) الأجنة. عندما نمت على طبق ثقافة غير المعالجة، تبقى هذه الخلايا تقريب وسوف تشكل نمطا حصوه إذا قرب متموجة (الشكل 1A). كما تم استخدام تمييع الكولاجين لمعطف الآبار، وبينما الخلايا البطانية والتمسك به (الشكل 1B)، فإنها تشكل أقل من السلاسل عندما مطلي على هلام الكولاجين (أرق...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
العمل مع الخلايا الجنينية الأولية يسمح التجارب رواية لمعالجة في المختبر الخطوات الحاسمة للتنمية. ومع ذلك، فإن إجراء العزل ليست تافهة. وتشمل الخطوات الحاسمة لعزل أي نوع من الخلايا ضمان أن يتم فصل الخلايا بشكل جيد على الهضم كولاجيناز ثم أنهم علقت جيدا خلال خطوات الغسيل. تشريح الميكانيكية من قبل pipetting يساعد كثيرا فصل الخلايا أثناء الخطوة كولاجيناز، والخطوة تصفية يزيل كتل من الخلايا. هذه الخطوات تحسين نقاء السكان والإنتاج.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر اندريا بورتبري لقراءة نقدية للمخطوطة، ومختبر خدمة مجهر UNC للحصول على المساعدة مع الوقت الفاصل بين التصوير، والمعاهد الوطنية للصحة (منحة # R01HL061656) لدعم التمويل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم
الشركة
رقم فهرسي
التعليقات
في الحامل مكافحة TD Colspan = "4" ><قوي>المعدات< / قوي >
| REAGENTS < / strong > | |||
| الوقت المناسب للفئران | ليتم تشريحها في المرحلة الجنينية من الاهتمام | ||
|---|---|---|---|
| الفئران CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| كولاجيناز ، النوع الأول | ورثينجتون الكيمياء الحيوية | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| وسط نمو الخلايا البطانية | (صنع في المختبر كما هو موضح في الملاحظات) | DMEM يحتوي على 20٪ FBS ، 5 & mu ؛ M &# 946 ؛ -mercapt &# 8211 ؛ ثانول ، 50 مو ؛ جم / مل تخطيط كهربية القلب ، و 1x البنسلين / الستربتومايسين | |
| &# 946 ؛ -mercapt &# 8211 ؛ ثانول | سيجما ألدريتش | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies، Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | تم تحضير اللوحة باستخدام هلام الكولاجين الرقيق ، كما هو موضح في 6< / sup> ؛ مساحة سطح العمل 10 مم 2< / sup> |
| الكولاجين من النوع الأول | BD | 354236 | الاستخدام في النهائي تركيز 1.5 مجم / مل |
| M199 ، 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | يستخدم حسب التوجيهات في 13< / sup> < |
| مجهر مجني | نيكون | SMZ645 | |
| حاضنة ثقافة الخلايا | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| جهاز طرد مركزي على الطاولة | Thermo | 75002430 | |
المراجع
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
