مقالة منهجية

A منصة الآلي تنوعا للتجارب تحفيز الخلية الصغيرة الحجم

DOI:

10.3791/50597

⸱

أغسطس 6, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, Sandia National Laboratories, 2Department of Biotechnology and Bioengineering, Sandia National Laboratories, 3Canon U.S. Life Sciences, 4Department of Advanced Systems Engineering and Deployment, Sandia National Laboratories

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بتطوير زراعة الخلايا الآلي ومنصة الاستجواب للتجارب التحفيز الخلية الصغيرة الحجم. منصة يوفر تحكم بسيطة، وتنوعا، ودقيق في زراعة وتحفيز المجموعات الصغيرة من الخلايا، واستعادة لست] للالتحليلات الجزيئية. منصة هي مناسبة تماما للدراسات التي تستخدم الخلايا الثمينة و / أو الكواشف.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وفرت دراسة الخلايا في الثقافة (في تحليل المختبر) نظرة متبصرة في النظم البيولوجية المعقدة. الأساليب التقليدية والمعدات اللازمة لفي تحليل المختبر هي مناسبة تماما لدراسة أعداد كبيرة من الخلايا (≥ 10 5) في مجلدات على نطاق وملليلتر (≥ 0.1 مل). ومع ذلك، هناك العديد من الحالات التي كان من الضروري أو المرغوب فيه إلى تقليص حجم الثقافة للحد من استهلاك الخلايا من الفائدة و / أو الكواشف اللازمة لثقافتهم، والتحفيز، أو المعالجة. للأسف، والنهج التقليدي لا تدعم التلاعب دقيقة وقابلة للتكرار من الثقافات الصغيرة الحجم، والنظم الآلية القائمة على على microfluidics المتوفرة حاليا هي معقدة جدا ومتخصصة للاستخدام الروتيني من قبل معظم المختبرات. لمعالجة هذه المشكلة، قمنا بتطوير منصة تقنية بسيطة وتنوعا للثقافة الآلي، والتحفيز، واستعادة مجموعات صغيرة من الخلايا (100 - 2،000 الخلايا) في حجم الصغيرة الحجمق (1-20 ميكرولتر). تتكون منصة لمجموعة من فبرونيكتين المغلفة microcapillaries ("غرف نضح الخلية")، التي وضعت ضمن الثقافات الصغيرة الحجم، حافظ، وحفز؛ وعلى microfluidics (DMF) جهاز رقمي تجهيزه مع "نقل" microcapillaries ("المحور المركزي ")، التي المسارات الخلايا والكواشف من وإلى غرف نضح؛ مضخة محقنة عالية الدقة، والذي نقل صلاحيات المواد بين الغرف نضح والمحور المركزي؛ وواجهة الإلكترونية التي توفر السيطرة على نقل المواد، والتي هي منسقة والآلي عبر البرامج النصية محددة سلفا. وكمثال على ذلك، استخدمنا منصة لتسهيل دراسة استجابات النسخي أثارت في الخلايا المناعية على التحدي مع البكتيريا. استخدام منصة مكنتنا من تقليل استهلاك الخلايا والكواشف، وتقليل التباين التجربة إلى التجربة، وإعادة توجيه التدريب العملي على العمل. وبالنظر إلى المزايا التي تمنح، وكذلك في إمكانية الوصول والتنوع، سمنصة اور ينبغي أن تجد استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من المختبرات والتطبيقات، وتكون مفيدة خاصة في تسهيل تحليل الخلايا والمحفزات التي تتوفر بكميات محدودة فقط.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وفرت دراسة خلايا المحافظة في الثقافة (في تحليل المختبر) نظرة لا تقدر بثمن في المبادئ الأساسية والآليات الجزيئية التي تحكم النظم البيولوجية المعقدة وصحة الإنسان. تم تصميم الطرق التقليدية للثقافة، والتحفيز، ومجموعة من الخلايا لتحليلها، التي تستخدم أطباق بتري ووحات microtiter، لدراسة أعداد كبيرة من الخلايا (≥ 10 5) في مجلدات الثقافة على نطاق وملليلتر (≥ 0.1 مل). ومع ذلك، هناك العديد من الحالات التي ليست سوى كميات محدودة من الخلايا المتاحة (مثل الخلايا الأولية)، أو المجموعات الصغيرة من الخلايا المرغوب فيه (على سبيل المثال للحد من خلية الى خلية تقلب عبر السكان)، أو الكواشف المطلوبة يصعب الحصول عليها أو باهظة التكاليف (مثل تنقية العوامل الخلية يفرز). مثل هذه القضايا لا يمكن معالجتها بنجاح من قبل تقليص حجم والثقافة، والتي لها فائدة إضافية تتمثل في خفض استهلاك جميعالكواشف اللازمة للتحليل في المختبر 1،2. للأسف، المعدات والأساليب التقليدية لا تعتمد التلاعب دقيقة وقابلة للتكرار من الثقافات الصغيرة الحجم والنظم الآلية القائمة على على microfluidics المتاحة حاليا 3-11 معقدة جدا ومتخصصة للاستخدام الروتيني من قبل معظم المختبرات.

في هذا التقرير، وصفنا التجمع واستخدام منصة تكنولوجيا بسيطة وتنوعا للثقافة الآلي، والتحفيز، واستعادة مجموعات صغيرة من الخلايا (100 - 2،000 الخلايا) في أحجام الصغيرة الحجم (1-20 ميكرولتر). بنية منصة (الشكل 1) هي وحدات مستقلة في تصميم: مجموعة من فبرونيكتين المغلفة microcapillaries ("غرف نضح الخلية" وحدة نمطية) يخدم كموقع لإنشاء، والصيانة، والتحفيز من الثقافات على نطاق والجزئي؛ وعلى microfluidics الرقمية (DMF ) 12،13 الجهاز تجهيزه مع "نقل" microcapillaries ("المحور المركزي" وحدة نمطية) 14،15 المسارات الخلاياوالكواشف من وإلى غرف نضح. DMF تمكن المستخدم من معالجة فردي قطرات متعددة في نفس الوقت وإلى تغيير أو إعادة ترتيب التلاعب (أي إعادة تكوين نموذج القطارات التجهيز) دون تغيير الأجهزة الجهاز. لها مرونة هائلة هو واضح في ظهور في الآونة الأخيرة باعتباره التكنولوجيا الرئيسية في مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك الثقافة خلية 16،17، المقايسات انزيم 18،19، 20،21 المناعية، وتحليل الحمض النووي 22،23، وتجهيز بروتين، 24،25 وتجهيز العينات السريرية. 26،27 محور مركزي لدينا يستفيد من المرونة الملازمة لأجهزة DMF، وكذلك يعزز ذلك من خلال إضافة واجهات microcapillary، الذي يوفر فرصة لتنفيذ مجموعة فرعية من التلاعب (مثل زراعة الخلايا) في الطرفية المتخصصة وحدات، وليس على جهاز DMF نفسها. تجزئة وحدات لمعالجة بهذه الطريقة أيضا يبسط تصميم جيش التحرير الشعبى الصينىtform العمارة (لا حاجة لبناء جهاز DMF التي يمكن تنفيذ جميع خطوات التجهيز) ويسهل تطورها، وظائف جديدة مطلوبة (ببساطة دمج وحدات طرفية جديدة حسب الضرورة). هو الدافع وراء نقل الخلايا والكواشف داخل محور مركزي من قبل electrowetting القوات التي تولدها تفعيل متتابعة من الأقطاب الكهربائية داخل الجهاز DMF 13،28؛ النقل من وإلى وداخل غرف نضح هو مدعوم من وتغيرات الضغط الناتجة عن حقنة عالية الدقة مضخة. يتم التحكم في جميع هذه الحركات السوائل عبر واجهة إلكترونية بسيطة ومؤتمتة من خلال استخدام البرامج النصية محددة سلفا.

كمثال ممثل، ونحن لشرح استخدام منصة لدراسة استجابات النسخي أثارت في الخلايا المناعية على التحدي مع البكتيريا (الشكل 2). تنفيذ هذه التجارب على منصة مكنتنا من العمل مع أعداد صغيرة من الخلايا (~ 1،000 في التجربهحالة TAL)، تقليل التباين التجربة إلى التجربة، الكواشف الحفاظ، وإعادة توجيه التدريب العملي على العمل. وبالنظر إلى المزايا التي تمنح، وكذلك في إمكانية الوصول والتنوع، ينبغي أن هذا المنبر تجد استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من المختبرات والتطبيقات وتكون مفيدة خاصة في تسهيل تحليل الخلايا والمحفزات التي تتوفر بكميات محدودة فقط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويهدف هذا البروتوكول العام لدعم تطبيق منصة لمجموعة واسعة من الدراسات؛ يتم فصل جوانب محددة لدراسة ممثل وصفها في هذا التقرير بين قوسين ويوضح الشكل 2 دراسة ممثل نفذت باستخدام بروتوكول. لاحظ أنه في البروتوكول، وأتمتة كافة الأوامر "إرشاد" من خلال استخدام البرامج النصية محددة سلفا. لاحظ أيضا أن الخطوة 2 يمكن القيام بها بالتوازي مع الخطوة 1 (على سبيل المثال خلال خطوات 1.7 و 1.8)، وهذه الخطوة 2.1 في كثير من الأحيان تجاوزها (لأن منقوشة / المغلفة لوحات الجهاز DMF يمكن غسلها وإعادة استخدامها، وانظر الخطوة 5.2) .

1. تجميع وتعبئة الدوائر الإرواء الخليوي

  1. معطف السطوح الداخلية من تعقيمها (تعقيمها) microcapillaries (تنصهر السيليكا؛ 679 ميكرون OD، 534 معرف ميكرون؛ 15 سم) مع فبرونيكتين، وذلك بإعطاء تعليمات ضخ حقنة لرسم الحل فبرونيكتين العقيمة (30 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل) في كلmicrocapillary، يحتضنها (37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة)، تعليمات ضخ حقنة لسحب الحل، والسماح للmicrocapillaries الجافة (درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 6 ساعة).
  2. ربط كل فبرونيكتين المغلفة microcapillary (غرفة التروية) لأنابيب البولي (OD 500 ميكرون، 100 ميكرون معرف) والأنبوب إلى مضخة محقنة متعدد الميناء، وذلك باستخدام التجهيزات CapTite (6 غرف نضح، 8 منافذ ضخ حقنة).
  3. باستخدام الشريط، تأمين جسم كل غرفة نضح إلى كتلة الحرارة لتعيين درجة الحرارة المطلوبة (37 ° C).
  4. تزج نهايات مفتوحة للدوائر نضح في خزان (أنبوب أو microcentifuge وحة microtiter جيدا) الخلايا التي تحتوي على (P388D.1 الضامة الفئران) معلقة في متوسطة النمو الطازجة (RPMI-1640، FBS 10٪، 500 وحدة / مل البنسلين، 500 ميكروغرام / مل الستربتوميسين) في التركيز المطلوب (10 6 خلية / مل).
  5. إرشاد ضخ حقنة لرسم الخلايا (10 ميكرولتر، 10 4 خلايا) في كل غرفة نضح تليها بما فيه الكفاية لمنظمة العفو الدوليةr لتحريك المكونات السائلة (~ 4.5 سم) إلى قسم تأمين إلى كتلة الحرارة.
  6. تسمح للخلايا على الانضمام إلى الأسطح الداخلية فبرونيكتين المغلفة للدوائر نضح (37 درجة مئوية لمدة 1 - 2 ساعة). في غضون ذلك، نقل نهايات مفتوحة للدوائر نضح من الخزان الخلايا إلى خزان جديد يحتوي متوسطة النمو الطازجة.
  7. بعد فترة الالتزام، إرشاد ضخ حقنة لإرسال المقابس السائل (سائل الإعلام مكيفة والخلايا غير مرتبط) سدى، سحب متوسطة جديدة (10 ميكرولتر)، واتبع مع ما يكفي من الهواء لوضع سدادات سائلة جديدة (المتوسطة الطازجة) على مدى الالتزام الخلايا.
  8. مواصلة تنفيذ التبادلات المتوسطة (أي كرر الخطوة 1.7) على فترات منتظمة (كل 2 ساعة) حتى السكان الخلية هي معايرتها بما فيه الكفاية والموسع (16-24 ساعة من الثقافة على نطاق والصغرى ولدت من السكان ~ 1،000 خلية / غرفة).

2. تلفيق جهاز DMF وتجميع العمارة المحور

  1. كما هو موضح سابقا 14،29، نمط لوحة السفلي من الجهاز DMF مع ستة وأربعين الإنديوم أكسيد القصدير (ITO) أقطاب (سائق قطيرة يشتغل) بواسطة ضوئيه والحفر، ومعطف مع 5 ميكرون من Parylene-C و 50 نانومتر من تفلون-AF. تشكل لوحة العلوي من الجهاز DMF بواسطة طلاء على unpatterned ايتو الركيزة الزجاج مع تفلون-AF، على النحو الوارد أعلاه.
  2. باستخدام إطارات ضغط المعادن، إصلاح لوحات DMF إلى الزهر البوليمر 14،30 مع فترات الاستراحة التي تحافظ على تباعد ميكرون 400 بين لوحات، وهذا التباعد، جنبا إلى جنب مع حجم القطب يشتغل (2.5 مم 2)، يحدد حجم القطيرات (2.5 ميكرولتر في القطب). لاحظ أن DMF الجمعية يمكن أن يتحقق عن طريق ابسط 24.
  3. إدراج تفلون المغلفة نقل microcapillaries (360 ميكرون OD، 100 معرف ميكرون؛ 3،5-4،0 سم طويلة) في الفضاء بين لوحات DMF، وتحديد المواقع كل لتمتد إلى حافة القطب لها يشتغل وما شابه ذلك.
  4. إلى EN المعاكسد من كل نقل يضعوا microcapillary من المناسب CapTite.
  5. إشراك الموصلات الكهربائية لتزويد التيار الكهربائي إلى الأقطاب ايتو. يتم آليا تسلسل التنشيط الكهربائي من خلال استخدام واجهة الإلكترونية الكمبيوتر التي تسيطر عليها تشغيل البرامج النصية محددة سلفا.
  6. اختياري: حرك محور DMF تجميعها على خشبة المسرح متعدية من المجهر (SZ-6145TR (أوليمبوس، اليابان)) مجهزة بجهاز المسؤول عن جانب (CCD) كاميرا (DCR-HC96 (سوني، اليابان)) لتسهيل تتبع من قطرات 31

3. ربط الدوائر الإرواء إلى محور DMF وحفز السكان الخلية

  1. إزالة نهايات مفتوحة للدوائر نضح من الخزان المتوسطة (انظر الخطوة 1.6) وإدراجها في التجهيزات CapTite الملصقة على طرفي نقل microcapillaries من محور DMF (انظر الخطوة 2.4).
  2. إرشاد ضخ حقنة لإرسال المقابس السائل (سائل الإعلام مكيفة) في غرف نضح لنضيعه.
  3. انستruct محور DMF لرسم التحفيز (E. القولونية BioParticles في 100 ميكروغرام / مل في متوسطة جديدة مع 0.1٪ بلورونيك F127 ث / ت) من خزان على متن وتسليم قطرات من الحجم المناسب (10 ميكرولتر) إلى كل نقل microcapillary . وتتألف الخزانات على متن مقصورات على شكل أسطواني (1.5 × 1.5 سم لكل منهما) ومتصلا محور DMF عبر أنابيب.
  4. إرشاد ضخ حقنة لرسم التحفيز المقابس في نقل microcapillaries، واتبع مع ما يكفي من الهواء لوضع سدادات على السكان الخلية في غرف نضح.
  5. احتضان الخلايا مع التحفيز (37 درجة مئوية لمدة 1-4 ساعة). اختياري: صرف العملة لتحفيز الطازجة (أي تكرار خطوات 3،2-3،4) على فترات منتظمة.

4. إنهاء تحفيز واسترداد الخلية لست لتحليل

  1. اختياري: إذا كنت بحاجة لفترة ما بعد التحفيز، تبادل المقابس السائلة التي تحتوي على التحفيز لمتوسطة جديدة (أي تكرار خطوات 3،2-3.4، استبدال متوسطة جديدة لتحفيز)، والاستمرار في احتضان وتبادل حسب الحاجة.
  2. تبادل المقابس السائل في غرف نضح لغسل العازلة (مقدمة وحدة تحلل مباشر العازلة B) (أي تكرار خطوات 3،2-3،4، استبدال غسل العازلة للالتحفيز)، واحتضان حسب الحاجة (5 دقائق).
  3. تبادل المقابس السائل (غسل العازلة) للحصول على حل تحلل (مقدمة تحلل مباشر العازلة وحدة A مع 0.1٪ بلورونيك F127 ث / ت) (أي تكرار خطوات 3،2-3،4، استبدال حل تحلل لالتحفيز)، واحتضان حسب الحاجة (5 دقائق) .
  4. إرشاد ضخ حقنة لإرسال المقابس السائل (لست] خلية) إلى محور DMF.
  5. تفكيك محور DMF، وإزالة لوحة العلوي من الجهاز DMF (باستخدام الحرص على عدم إمالة لوحة جانبية، وهذا يمكن أن يؤدي إلى خلط الحبرية)، وجمع لست] باستخدام Pipetman أو حقنة للتحليل خارج منصة (الجينات التنميط التعبير عبر QPCR).

5. نظيفة وقطع غيار منهاجإعادة استخدام

  1. تزج نقل microcapillaries والتجهيزات CapTite في التبييض 10٪ (V / V في الماء) لمدة 10 دقيقة في RT، وشطف جيدا مع الماء منزوع الأيونات، والجاف باستخدام غاز النيتروجين.
  2. تزج لوحات الجهاز DMF في التبييض 10٪ لمدة 10 دقيقة في RT، وشطف جيدا مع الأيزوبروبانول يليه الماء منزوع الأيونات، والجاف باستخدام غاز النيتروجين تليها الخبز على 160 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. ضخ حقنة في أنابيب البولي، ويلقي البوليمر الجهاز DMF والإطار ضغط، ويمكن إعادة استخدامها دون تنظيف. يتم تجاهل نضح غرفة microcapillaries بعد كل تجربة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كدليل على منصة الآلي، ونحن استخدامه لإجراء دراسة في التي كانت تزرع المجموعات الصغيرة من الخلايا المناعية في الثقافات الصغيرة الحجم، تحدى مع البكتيريا، و lysed للتحليل خارج منصة من الردود المؤيدة للالتهابات (الشكل 2 ).

وكان المصنف كل من ستة غرف نضح الخلية مع 10 4 الخلايا المناعية (P388D.1 الضامة الفئران) معلق في 10 ميكرولتر من متوسط ​​النمو. بعد فترة الالتزام (37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بتطوير منصة بسيطة وتنوعا الآلي للثقافة الخلية الصغيرة الحجم والتجارب التحفيز. منصة تمكننا من العمل مع وحدات التخزين الصغيرة وثقافة السكان الخلية (1-20 ميكرولتر و 100 - 2،000 خلايا، لكل غرفة)؛ الأحجام ثقافة يمكن تخفيض أكبر من خلال استخدام microcapillaries من قطر أصغر. يعمل في هذه المقاييس يقلل من تكلفة الدراسات الروتينية ويجعل دراسات جدوى التي تتطلب استخدام الكواشف الثمينة و / أو الخلايا. تظهر التجارب التي تنفذها منصة أيضا أقل تقلباته، ويفترض أن يعود إلى الدقة وال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفان بالشكر رونالد F. رينزي ومايكل S. بارتش لمساهماتها في مجال تصميم وتطوير أجهزة DMF والمحور DMF. وأيد هذا البحث بالكامل من قبل مختبر إخراج برنامج البحوث والتنمية في مختبرات سانديا الوطنية. سانديا هو مختبر برنامج متعدد إدارتها وتشغيلها من قبل شركة سانديا، وهي شركة تابعة مملوكة بالكامل لشركة لوكهيد مارتن كوربوريشن، عن وزارة الخارجية الأمريكية في إدارة الأمن النووي الوطنية للطاقة بموجب عقد DE-AC04-94AL85000.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وحدة التحلل المباشر PreludeNuGEN1400-24
Trypan Blue (0.4٪ وزن / حجم)GIBCO15250-061
متجرد الخلاياCellgro25-056-C1
Ovation PicoSL WTANuGEN3310-048
Agencourt RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsA63987
pHrodo BioParticlesInvitrogenP35361
CCL4 TaqMan qRT-PCRالفحص الأنظمة الحيوية التطبيقيةMm00443111_m1
CCL5 TaqMan qRT-PCRالاختبارات الحيوية التطبيقيةMm01302428_m1
PTGS2 TaqMan qRT-PCRالنظم الحيوية التطبيقيةMm00478374_m1
TNF TaqMan qRT-PCRالنظم الحيوية التطبيقيةMm00443258_m1
GAPDH TaqMan qRT-PCR الفحصالتطبيقي النظم الحيويةMm99999915_g1
البلورونيك F127سيجما الكيماوية2594628
فلورينرت FC-40سيجما كيميكال51142-49-5
باريلين سي ديمرأنظمة الطلاء المتخصصة28804-46-8
تفلون-AFدوبونتAF1600
شريط بوليميدULINES-11928
ركائز زجاجية مطلية بأكسيد القصدير الإنديوم (ITO) Delta TechnologiesCB-40IN-1107
محور DMF الشعيرات الدموية المنصهرة بالتفلونPolymicro TechnologiesTSU100375
الشعيرات الدموية الدقيقة لغرفة الترويةPolymicro TechnologiesTSP530700
الأنابيب والتركيبات الشعريةمختبرات سانديا الوطنية
أنابيب البولي كربوناتParadigm OpticsCTPC100-500-5
مضخة حقنة دقيقة ذات 8 منافذ مجهزة ب 30 مم (500 & # 956 ؛ ل) المحاقنشركة هاميلتون54848-01
أداة ترسيب بخار باريلين-سيأنظمة طلاء متخصصةPDS 2010 Labcoter 2
مولد وظيفة الجهد العاليTrek615A-1 615-3
MVX10 مجهرأوليمبوساختياري (يسهل تتبع القطرات على محور DMF)
كاميرا CCD الرقمية QIClickQImagingQIClick-F-CLR-12اختياري (يسهل تتبع القطرات على موزع DMF)
الدقيقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
  2. Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. Microfluidic devices for bioapplications. Small. 7, 12-48 (2011).
  3. Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
  4. Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
  5. Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
  6. Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
  7. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  8. Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
  9. Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
  10. King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
  11. Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
  12. Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
  13. Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
  14. Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
  15. Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
  16. Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
  17. Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
  18. Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
  19. Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
  20. Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
  21. Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
  22. Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
  23. Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
  24. Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
  25. Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2(2009).
  26. Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
  27. Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. Digital microfluidics. Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).
  28. Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603(2009).
  29. Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
  30. Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
  31. Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
  32. Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
  33. Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
  34. Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
  35. Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
  37. Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
  38. Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
  39. Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
  40. Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Micro scale Cell CultureDigital MicrofluidicsCell Perfusion ChambersSyringe Pump ControlAutomated Cell StimulationQuantitative RT PCR AnalysisFibronectin CoatingMicrocapillary TransportCell Lysate RecoveryImmune Cell Stimulation

مقالات ذات صلة