مقالة منهجية

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

DOI:

10.3791/50608

⸱

نوفمبر 7, 2013

 ,  ,  , 
1School of Molecular Medical Sciences, University of Nottingham, 2Division of Drug Delivery and Tissue Engineering, University of Nottingham, 3Laboratory of Biophysics and Surface Analysis, University of Nottingham

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن إدراج حيويا درجة الحموضة استجابة nanosensors سول جل في بولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) (PLGA) السقالات electrospun. السقالات الإبلاغ الذاتي المنتجة يمكن استخدامها لرصد الوضع الطبيعي من الظروف microenvironmental في حين زرع الخلايا على السقالة. هذا هو مفيد مثل بناء الخلوية 3D يمكن رصدها في الوقت الحقيقي من دون إزعاج التجربة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعتقد أن زراعة الخلايا في 3D على السقالات المناسبة لتقليد بشكل أفضل في الجسم الحي المكروية وزيادة التفاعلات خلية خلية. يمكن أن ينجم عنها من بناء الخلوية 3D غالبا ما تكون أكثر ملاءمة لدراسة الأحداث والتفاعلات الجزيئية خلية خلية من التجارب المماثلة درس في 2D. لخلق 3D الثقافات الفعال مع بقاء الخلية عالية في جميع أنحاء سقالة الشروط الثقافة مثل الأكسجين ودرجة الحموضة ضرورة أن يكون للرقابة بعناية كما التدرجات في تركيز تحليلها يمكن أن توجد في جميع أنحاء بناء 3D. نحن هنا وصف الطرق إعداد حيويا درجة الحموضة استجابة nanosensors سول جل وإدماجها في بولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) (PLGA) السقالات electrospun جنبا إلى جنب مع إعدادها لاحقة للثقافة خلايا الثدييات. السقالات استجابة درجة الحموضة يمكن استخدامها كأدوات لتحديد درجة الحموضة microenvironmental ضمن بناء الخلوية 3D. وعلاوة على ذلك، ونحن من التفصيل تسليم الحموضة nanose استجابةnsors على البيئة داخل الخلايا من خلايا الثدييات الذي كان مدعوما من السقالات electrospun PLGA النمو. موقع حشوية من nanosensors استجابة درجة الحموضة يمكن أن تستخدم لرصد درجة الحموضة داخل الخلايا (PHI) خلال التجريب المستمر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استراتيجية رئيسية في هندسة الأنسجة هو استخدام مواد حيويا لافتعال السقالات التي تشبه الأنسجة التي أريد لها أن تحل محل وقادر أيضا على دعم نمو الخلايا وظيفة 1،2 التشكل. يوفر السقالة الدعم الميكانيكية من خلال السماح مرفق الخلية والانتشار حتى الآن يسمح الهجرة الخلية في جميع أنحاء الفجوات لبناء الخلوية 3D. يجب السقالة تسمح أيضا لنقل كميات كبيرة من المواد الغذائية وخلية لا تمنع إزالة النفايات الأيضية 3.

وقد برزت Electrospinning كوسيلة من وسائل واعدة لتصنيع السقالات البوليمرية قادرة على دعم النمو الخلوي 4-6. الألياف electrospun محبوكة المنتجة هي مناسبة لنمو الخلايا كما أنها غالبا ما تكون مسامية تسمح والتفاعل خلية خلية، وكذلك الهجرة الخلية في جميع أنحاء الفجوات لبناء الخلوية 3D 7. فمن المهم رصد بقاء الخلية أثناء رانه الفترة من الثقافة وضمان بقاء الخلية يتم الاحتفاظ في كل أنحاء لبناء 3D. على سبيل المثال، وظروف ثقافة مثل الأكسجين ودرجة الحموضة تتطلب التحكم الدقيق، وتدرجات في تركيز تحليلها يمكن أن توجد داخل بناء 3D. المفاعلات الحيوية أو نظم الارواء يمكن استخدامها لتقليد في ظروف المجراة من تدفق الخلالي ونتيجة لنقل المواد الغذائية نتيجة زيادة وإزالة النفايات الأيضية 8. مسألة ما إذا كانت مثل هذه الأنظمة وضمان ظروف microenvironmental ثابتة يمكن معالجتها من خلال تقييم المكروية الخلوية في الوقت الحقيقي.

مقاييس المكروية الأساسية التي يمكن رصدها في الوقت الحقيقي وتشمل: درجة الحرارة، والتركيب الكيميائي للخلية وسائل الإعلام، وتركيز الأكسجين المذاب وثاني أكسيد الكربون، ودرجة الحموضة، والرطوبة. من هذه المقاييس، ودرجة الحرارة يمكن رصدها بسهولة أكثر باستخدام تحقيقات في الموقع. أساليب لرصد المقاييس المدرجة المتبقية عادة فيإزالة فوالذي من قسامة لأخذ العينات وبالتالي تعكير صفو زراعة الخلايا وتزيد من خطر التلوث. يجري البحث المستمر، وأساليب الوقت الحقيقي. عادة ما تعتمد أساليب الرصد الحالي على الصكوك التي بحث جسديا بناء الخلوية مثل جهاز الحموضة أو التحقيق الأوكسجين. ومع ذلك، يمكن لهذه الأساليب تطفلا تلف بناء الخلوية وتعكر صفو التجربة الجارية. رصد موسع تركيزات تحليلها ضمن بناء 3D يمكن تمكين مراقبة الوقت الحقيقي من الجوانب البيئية المختلفة مثل نضوب المغذيات 9. هذا من شأنه أن تسمح بتقييم توريد المواد الغذائية إلى مناطق أعمق داخل الهيكل وتحديد ما إذا كان يجري إزالة النفايات الأيضية بشكل فعال 10،11. الأنظمة التي تحاول معالجة مسألة الغزو تنطوي عموما على استخدام غرفة نضح الذي يمر مستنبت من خلال كل سفينة الثقافة وأجهزة الاستشعار الخارجية لرصد درجة الحموضة والأوكسجين والجلوكوز 12. الإعادة اهتماما متزايدا في تطوير أجهزة الاستشعار التي يمكن دمجها مباشرة في سفينة الثقافة التي لا تتطلب إزالة قسامة لأخذ العينات وعلى هذا النحو من شأنه أن يوفر الرصد في الموقع.

لمعالجة هذه النواقص لفي الموقع ورصد موسع الظروف microenvironmental أدخلنا الحليلة nanosensors استجابة إلى السقالات electrospun لإنتاج السقالات الإبلاغ الذاتي 13. تم إعداد السقالات التي تعمل أجهزة الاستشعار عن بعد من خلال رصد النشاط مضان من قبل، حيث كان الجهاز الاستشعار إما السقالة البوليمرية الفعلية التي أنشأتها electrospinning أو من خلال استخدام صبغ استجابة تحليلها والتي يتم تضمينها في البوليمر قبل تشكيل سقالة 14،15 . ومع ذلك، وهذه الأجهزة الاستشعار لديها القدرة على إعطاء المخرجات البصرية الخاطئة الناجمة عن تدخل محتمل من التحاليل الأخرى. استخدام جهاز الاستشعار ratiometric سوالفصل عن تلك التي أعدت في البروتوكول وصفها تحمل في طياتها احتمال للقضاء على هذه الآثار السلبية المحتملة وتوفير استجابة محددة لتحليلها في السؤال.

تم إعداد السقالات electrospun المقدمة هنا من الاصطناعية شارك في البوليمر بولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) (PLGA)، يتم اختيارهم بسبب وجود إدارة الغذاء والدواء (FDA) الموافقة، نظرا لخواصه القابلة للتحلل حيويا ومسار و سجل لدعم النمو والوظائف من مختلف أنواع الخلايا 16-18. الحليلة ratiometric nanosensors استجابة استعداد تستجيب لدرجة الحموضة. وnanosensors دمج اثنين من الأصباغ الفلورية في حيويا مصفوفة جل سول حيث الصبغة واحد، FAM تستجيب لدرجة الحموضة وغيرها، TAMRA بمثابة معيار الداخلية كما أنها ليست استجابة لدرجة الحموضة. علاوة على ذلك، مضان من كل من FAM وTAMRA يمكن تحليلها بشكل منفصل لأنها لا تتداخل بشكل كبير. تحديد نسبة EMI مضانssion كل من الأصباغ في موجات محددة يعطي استجابة درجة الحموضة مستقلة عن الظروف البيئية الأخرى. السقالات الإبلاغ الذاتي يمكن أن تسمح تقييم تكرار درجة الحموضة في الموقع وفي الوقت الحقيقي دون تعطيل نموذج 3D المتقدمة. لقد أثبتنا أن هذه السقالات هي قادرة على دعم مرفق الخلية والانتشار وتبقى استجابة لتحليلها في السؤال. حركية الحمضية من المنتجات في بنيات هندسيا يبقى سلوكه وعلى هذا النحو باستخدام السقالات استجابة درجة الحموضة يمكن أن يسهل إلى حد كبير مثل هذه الدراسات 19. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام السقالات الإبلاغ الذاتي لتطبيقات هندسة الأنسجة ويقدم الفرصة لنفهم تماما، ورصد وتحسين نمو 3D نموذج يبني الأنسجة في المختبر، وnoninvasively في الوقت الحقيقي.

كما تم تسليم nanosensors استجابة درجة الحموضة للبيئة داخل الخلايا الليفية مثقف على electrospun PLGA scaffolس. واستخدمت نسبة الانبعاثات مضان من الأصباغ لمراقبة PHI ومقارنة الإبلاغ الذاتي سقالة إدراج عنصر nanosensors درجة الحموضة. تسليم nanosensors إلى الخلايا المستزرعة في بيئة 3D قد تمكن من رصد تركيز الحليلة عميقة داخل بناء بطريقة غير تدميري. لذا nanosensors قد يكون أداة ناجعة التصوير لتقييم سلوك الخلية غير بشكل هدام في جميع أنحاء 3D يبني يسمح التحليل على المدى الطويل. يمكن فحص تركيز الحليلة من الخلايا الفردية داخل بناء 3D ضمان أنهم يتلقون تركيزات المغذيات والأكسجين الكافي. المعلمات عملية الرصد يمكن أن تساعد في تطوير تقنيات موحدة للنقل الجماعي الفعال من الأوكسجين والمواد المغذية. يمكن الجمع بين تقديم nanosensors على البيئة داخل الخلايا وإدماج nanosensors في السقالات البوليمرية للسماح بتقييم بقاء الخلية فضلا عن الأداء داخل سقالة 3D كانت constructs أثناء عملية نمو الأنسجة. هذا قد يؤدي إلى زيادة المعرفة من هذه التركيبات وتقدم في تصنيع بدائل الأنسجة ذات الصلة من الناحية البيولوجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرة عامة

يصف القسم 1 إعداد الحموضة nanosensors استجابة وتوصيف استجابة nanosensor لدرجة الحموضة باستخدام الطيف مضان وحجمها باستخدام SEM.

يصف القسم 2 إعداد السقالات electrospun البوليمر وتوصيف مورفولوجيا وحجمها باستخدام SEM. يصف القسم 2 أيضا إعداد السقالات الإبلاغ الذاتي التي هي السقالات electrospun مع إدراج nanosensors استجابة درجة الحموضة. وتتميز الناتجة السقالات الإبلاغ الذاتي عن طريق وزارة شؤون المرأة لتقييم ما إذا كان أي تغيرات شكلية في ألياف electrospun حدث. يتم تقييم مضان من السقالات الإبلاغ الذاتي الناتجة عن nanosensors أدرجت بواسطة المجهر متحد البؤر.

يصف القسم 3 ثقافة الخلايا على سقالة electrospun والسقالة الإبلاغ الذاتي. يتم تعقيم السقالات الأولى في preparatايون للثقافة الخلية التالية التي يتم تقييمها السقالات لتحديد ما إذا كان التعقيم وثقافة من الخلايا تؤثر على القدرة مضان من السقالات الإبلاغ الذاتي. يصف البروتوكول أيضا تسليم nanosensors للخلايا التي يتم زرعها على السقالات electrospun. يستخدم Lysotracker صبغ لضمان أن لم تؤخذ nanosensors في مقصورات الحمضية الخلوية.

1. إعداد وتحليل درجة الحموضة المستجيبة Nanosensors سول هلام

1.1 إعداد الحموضة المستجيبة Nanosensors سول هلام

ملاحظة: هذا الإعداد يجب أن يؤديها في غطاء الدخان.

  1. إعداد fluorophores للاستخدام داخل nanosensors درجة الحموضة عن طريق إذابة 5 - (و6) carboxyfluorescein، succinimidyl استر (FAM-SE) (1.5 ملغ) في ثنائي ميثيل (DMF) (1 مل) في جولة القاع قارورة و6 carboxytetramethylrhodamine ، استر succinimidyl (TAMRA-SE) (1.5 ملغ) في DMF (1 مل) في جولة أخرى القاع قارورة.إضافة 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) (1.5 مل) إلى كل قارورة ويقلب تحت جو النيتروجين الجاف (21 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة في الظلام أي التفاف العينات في احباط.
  2. إضافة كل من الأصباغ أعلاه (250 ميكرولتر) إلى خليط من الإيثانول (6 مل) وهيدروكسيد الأمونيوم (30٪ بالوزن، 4 مل) الواردة في قارورة جولة القاع ويقلب لمدة 1 ساعة (21 درجة مئوية).
  3. إضافة ببطء tetraethylorthosilicate (TEOS) (0.5 مل) إلى الخليط، مواصلة التحريك لمدة 2 ساعة أخرى. سوف يتحول الخليط غائم. وnanosensors يمكن جمعها عن طريق التبخر الدوارة. ويمكن تخزين Nanosensors في قارورة زجاجية في 4 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

    تنبيه: يجب أن يتم تنفيذ مزيد من التعامل مع nanosensors في شكلها الجاف في غطاء الدخان أو في حالة وزنها لهم يجب أن يرفق التوازن، على سبيل المثال في Weighsafe.

1.2 Nanosensor الاستجابة لدرجة الحموضة

  1. إعداد الحلول سورينسن في العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة تتراوح بين 5،5-8،0 قبل للانترنتنانوغرام نسب محددة من أحادى الصوديوم الفوسفات (0.2 م) والصوديوم ثنائي القاعدة فوسفات (0.2 M) حلول الأسهم. تحقق من درجة الحموضة النهائية باستخدام الرقم الهيدروجيني متر. إجراء أي تعديلات طفيفة على الرقم الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) (4 م) أو حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) (2 م).
  2. تعليق nanosensors درجة الحموضة في مخازن درجة الحموضة (5 ملغ / مل) من خلال عقد أولا السفينة التي تحتوي على حل nanosensor على دوامة لمدة 3 دقائق ثم غمر السفينة في ultrasonicator حتى يصبح الحل جزئيا (حوالي 5 دقائق). كرر هذه الخطوات لوقف تماما nanosensors في الحل.
  3. وضع الحل الأول إلى كفيت البصرية واستخدام موجات الإثارة من 488 نانومتر لمدة 5 - (و6) carboxyfluorescein (فام) و 568 نانومتر لمدة 6 carboxytetramethylrhodamine (TAMRA). جمع موجات الانبعاثات في 500-530 نانومتر لFAM و558-580 نانومتر لTAMRA باستخدام مطياف مضان.
  4. تغيير الحلول في كفيت البصرية بحيث يمكن ملاحظة درجة الحموضة في درجة الحموضة المختلفة ومواصلة جollecting أطياف الانبعاثات.
  5. حساب نسبة ماكسيما الانبعاثات المنتجة في كل قيمة الرقم الهيدروجيني لإنتاج منحنى المعايرة.

1.3 SEM من Nanosensors

  1. وضع عينة من nanosensors على الكربون المغلفة الإلكترون المجهر كعب وتفل معطف مع الذهب لمدة 5 دقائق تحت جو الأرجون.
  2. مراقبة عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM). خلال التصوير ضبط المسافة العمل، والجهد والتكبير للحد من شحن الإلكترون (الشكل 1).

2. إعداد وتحليل PLGA السقالات

2.1 Electrospinning السقالات PLGA

  1. في غطاء الدخان حل بولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) (PLGA) في ثنائي كلورو ميثان (DCM) (20٪ (وزن / وزن)) مع البيريدينيوم فورمات (PF) (1٪ (ث / ث)). وضع الحل في حقنة 10 مل مع إبرة حادة 18 G التعبئة وتناسب بشكل آمن إلى ضخ حقنة.
  2. تنأى طرف الإبرة 20 سم بعيدا عن 20سم × 15 سم الألومنيوم لوحة جمع.
  3. نعلق القطب من امدادات الطاقة عالية الجهد لغيض من حقنة والأرض على لوحة جمع الألومنيوم.

    وينبغي توخي الحذر حيث يستخدم الجهد العالي أي تتحول دائما على التيار الكهربائي من قبل التعامل مع أي من المعدات electrospinning: تنبيه.
  4. تقديم الحل باستخدام معدل تدفق مستمر من 3.5 متر / ساعة على 12 كيلو فولت لمدة 2 ساعة. سوف Electrospinning باستخدام هذه الظروف تعطي عمق السقالة من حوالي 60 ميكرون.
  5. ترك السقالة في غطاء الدخان لمدة 24 ساعة للسماح بقايا المذيبات تتبخر.

2.2 درجة الحموضة Electrospinning المستجيبة PLGA السقالات

  1. إعداد السقالات دمج الحموضة nanosensors تستجيب كما هو موضح في القسم 2.1 ولكن مع تعديل مضيفا nanosensors إلى حل البوليمر (5 ملغ / مل). تعليق nanosensors في حل PLGA بمساعدة ultrasonication (حوالي 5 دقائق) قبل لوضع في حقنة 10 مل.

2.3 SEM من PLGA سقالة ودرجة الحموضة سقالة المستجيبة

  1. وضع عينة من السقالة PLGA أو درجة الحموضة سقالة تستجيب على الكربون المغلفة الإلكترون المجهر كعب والمضي قدما كما هو موضح لوزارة شؤون المرأة من nanosensors (الشكل 1).

2.4 معايرة درجة الحموضة سقالة المستجيبة

  1. وضع عينة من درجة الحموضة سقالة تستجيب إلى لوحة الثقافة 35 مم وتزج في المحاليل المناسبة.
  2. على المجهر متحد البؤر استخدام الأرجون ليزر 488 نانومتر لإثارة FAM و568 نانومتر ليزر كريبتون لإثارة TAMRA داخل nanosensors. مراقبة الانبعاثات مضان لدرجة الحموضة السقالات استجابة في 500-530 نانومتر لFAM و558-580 نانومتر لTAMRA. (الشكل 2). استخدام المسح المتتابع لتجنب مجموعة من موجات الإثارة.

3. الثقافة الخلية على PLGA السقالات والشدات درجة الحموضة المستجيبة PLGA

ntent "> ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ التالية في خزانة ثقافة الخلية.

3.1 إعداد PLGA سقالات للثقافة الخليوي

  1. خفض درجة الحموضة أو PLGA السقالات PLGA استجابة إلى 2 سم 2 قطعة.
  2. تعقيم السقالات بواسطة تشعيع مع الأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء على مسافة 8 سم لمدة 15 دقيقة كل جانب.
  3. نقل السقالات لوحة الثقافة 12 جيدا ووضع حلقة من الصلب على القمة. إضافة محلول البنسلين / الستربتوميسين (5٪ ت / ت) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى داخل وخارج حلقة من الصلب، واحتضان بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). ملاحظة تم تصنيعها في حلقة من الصلب في جامعة نوتنغهام، وأبعاد التالية: 2 سم القطر الخارجي، 1 سم القطر الداخلي، عمق 1 سم.
  4. إزالة الحل تعقيم وغسل مع برنامج تلفزيوني.
  5. إضافة خلية سائل الإعلام والثقافة إلى الداخل (500 ميكرولتر) وخارجها (500 ميكرولتر) من حلقة من الصلب، ومكان في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 )، في حين إعداد تعليق خلية.
  6. إعداد تعليق خلية وتنفيذ عدد خلايا باستخدام مقايسة الاستبعاد التريبان الأزرق.
  7. إنشاء تعليق خلية لتحقيق عدد الخلايا من 1 × 10 6 خلية / مل.
  8. إزالة وسائل الإعلام من داخل وخارج الحلبة الصلب.
  9. استبدال مع prewarmed سائل الإعلام والثقافة الخلية على السطح الخارجي للحلقة من الصلب (1 م).
  10. إضافة 300 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى داخل الحلبة الصلب - لوحة الصخور الوراء وإلى الأمام بلطف لتوزيع الخلايا.
  11. وضع لوحة الثقافة خلية في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) - مرفق الخلية يجب حدثت في غضون 24 ساعة، ولكن لا تزال ثقافة لطالما يتطلب التجربة - منعش وسائل الاعلام كل 2-3 أيام.

3.2 Nanosensor التسليم إلى الخلايا المستزرعة على PLGA سقالة

  1. خلايا البذور على PLGA السقالة كما هو موضح في القسم 3.1. لهذه الدراسة على PLGA سقالة فارغة (لا إحتوىnanosensors نينغ) كان يستخدم بسبب تداخل الانبعاثات مضان عند التصوير.
  2. وضع الخلية سقالة المصنفة في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 72 ساعة للسماح للخلايا أن تنمو وتهاجر في جميع أنحاء سقالة قبل nanosensor التسليم.
  3. قبل nanosensor تسليم غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وتغيير وسائل الإعلام من وسائل الإعلام ثقافة القياسية لوسائل الإعلام الحرة والمضادات الحيوية في الدم، واحتضان (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 1 ساعة. ملاحظة: وسائل الإعلام ثقافة القياسية ل3T3 الخلايا ويتألف من التعديل المتوسطة النسر Dulbecco وتستكمل مع الجنين العجل المصل (10٪ (V / V))،-L الجلوتامين الحل (2 ملم)، البنسلين / الستربتوميسين (1٪ (V / V)) .
  4. خلال فترة الحضانة إعداد معقدة nanosensor-الحويصلية بواسطة sonicating لفترة وجيزة nanosensors (5 ملغ) مع Optimem (50 ميكرولتر) لإنشاء حل A.
  5. إنشاء الحل B عن طريق إضافة Lipofectamine لعام 2000 (5 ميكرولتر) إلى Optimem (45 ميكرولتر)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. إضافة الحلA إلى B الحل، يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتشكيل حل C الذي هو مجمع nanosensor-الحويصلية.
  7. إضافة الحل C (100 ميكرولتر) إلى الخلايا واحتضان (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 3 ساعة.
  8. إزالة الخلايا السقالات المصنفة من الحاضنة، ووسائل الإعلام نضح ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة برنامج تلفزيوني (1 مل) للسماح التصور الخلية الحية بواسطة المجهر متحد البؤر. ملاحظة: تم استخدام برنامج تلفزيوني في هذا البروتوكول بحيث الفينول المؤشر الأحمر موجودة في خلية ثقافة وسائل الإعلام لم تسبب تألق ذاتي وأيضا بسبب معايرة في درجة الحموضة المختلفة والتي يتم تنفيذها. ومع ذلك الفينول وسائل الإعلام الحرة الحمراء يمكن استخدامها لتحليل المدى الطويل الثقافات الخلية.
  9. تزج الخلية سقالة المصنفة في مخازن درجة الحموضة المختلفة ورصد استجابة nanosensors المرتبطة الخلايا.
  10. رصد PHI عن طريق تحديد نسبة كثافة مضان من FAM وTAMRA من خلال مراقبة مضان المجهري متحد البؤر باستخدام (فيقوإعادة 3).

3.3 Nanosensor الموقع داخل خلايا الثدييات

  1. احتضان الخلايا مع nanosensors تحتوي فقط الصبغة FAM كما هو موضح في القسم 3.2 (وذلك لأن الانبعاثات مضان من TAMRA في نفس المنطقة الطيفية كما LysoTracker الأحمر). إعداد هذه nanosensors كما هو موضح في القسم 1.1 ولكن مع إغفال إعداد وإضافة TAMRA.
  2. بعد فترة التسليم nanosensor تمييع LysoTracker الأحمر محلول المخزون إلى 50 نانومتر.
  3. إضافة قسامة من محلول مخفف (2 ميكرولتر) إلى الخلايا المستزرعة على السقالات PLGA.
  4. احتضان الخلايا مع LysoTracker الأحمر لمدة 1 ساعة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
  5. بعد فترة الحضانة إزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) قبل تغيير وسائل الإعلام لبرنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) (2 مل) استعدادا للعرض باستخدام متحد البؤر المجهري. ملاحظة: يمكن استخدام الفينول وسائل الإعلام الحرة حمراء بدلا من برنامج تلفزيوني.
  6. إضافة وصمة عار النووية ذراعQ5 إلى برنامج تلفزيوني وبالتالي فإن تركيز النهائي هو 5 ميكرومتر واحتضان مع الخلايا لمدة 3 دقائق (37 درجة مئوية 5٪ CO 2). فإنه ليس من الضروري تغيير وسائل الاعلام بعد فترة الحضانة مع Draq5.
  7. استخدام الليزر 488 نانومتر الأرجون لإثارة FAM nanosensors فقط، والكريبتون الليزر 568 نانومتر لإثارة LysoTracker الأحمر و 633 نانومتر الهيليوم / نيون ليزر لإثارة حامل اللون Draq5 ومراقبة مضان في 500-530 نانومتر، 580-600 نانومتر، 650 -750 نانومتر على التوالي (الشكل 3). استخدام المسح المتتابع لتجنب مجموعة من موجات الإثارة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تميزت توزيع حجم الرقم الهيدروجيني nanosensors استجابة استعداد باستخدام SEM، حيث تم قياس سكان nanosensors تصوير وجدت لديك أبعاد نانومتر في نطاق 240-470 نانومتر (الشكل 1A). تحقيق قطره ضيقة وصغيرة معقول يتسق مع استخدام أسلوب ستوبر لإعداد النانوية. فقد وجد أن استخدام بيئة درجة الحموضة الأساسية خلال تجميع الجسيمات النانوية أي النانوية إعدادها باستخدام أسلوب ستوبر، يسمح مراقبة جيدة من حجمها، في حين إعداد باستخدام الظروف الحمضية تنتج التشتت واسعة في حجم الجس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هندسة الأنسجة يطمح لخلق بدائل البيولوجية التي يمكن استخدامها على حد سواء كما في الجسم الحي في المختبر مثل نماذج الأنسجة والعلاج في استبدال الأنسجة لإصلاح، استبدال، والحفاظ على أو تعزيز وظيفة الأنسجة أو عضو معين. وقد استخدمت البدائل الاصطناعية لسنوات عديدة لاستبدال أو إصلاح الأنسجة المساعدات ولكن غالبا ما تفشل هذه بسبب ضعف الاندماج مع النسيج المضيف و / أو عدوى، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى رفض عملية جراحية أخرى أو المراجعة. توليد الأنسجة الحية في المختبر قبل الزرع ق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن المسلم به بتمويل من BBSRC التفضل (عدد المنح BB H011293 / 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الإيثانولفيشر32221
ثنائي ميثيل فورماميد اللامائي (DMF)سيجما270547
هيدروكسيد الأمونيوم 50٪ (حجم / حجم) محلول مائيAlfa Aesar35574مخفف إلى 30٪ (حجم / حجم) بماء نقي
TEOSSigma13190-3
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)SigmaA3648
5- (و -6) - كربوكسي فلوريسين ، إستر السكسينيميديل (FAM-SE)InvitrogenC1311
6-كربوكسي تتراميثيلرودمين ، إستر السكسينيميديل (TAMRA-SE)InvitrogenC1171
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (0.2 م)سيجما ألدريتشS-9638
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (0.2 م)سيجما ألدريتشS-0876
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتشS8045
التربسين / EDTAسيجما ألدريتشT4174
البنسلين / الستربتومايسينسيجما ألدريتشP0781
PBSسيجما ألدريتشD8537
DMEMسيجما ألدريتشD6046
FBSمصدر العلوم البيولوجيةالدفعة -213-101992
L-الجلوتامينسيجما ألدريتشG7513
ليبوفيكتامين 2000Invitrogen11668-019
OptimemInvitrogen11058-021
LysoTracker RedInvitrogenL-7528
Draq5Biostatus Ltdغاز النيتروجين DR50050
BOC
DCMSigma Aldrich320269
TFASigma AldrichT6508
مجهر متحد البؤرLeica TCS-SPمجهز بليزر الأرجون والكريبتون وعدسة غمر الماء 63X 0.9NA
ضوء الأشعة فوق البنفسجيةUVLS28 UVP ، الولايات المتحدة الأمريكية
لوحة النمامSB161-3 Jencons-PLS
مقياس الأس الهيدروجينيJenway نموذج 3510
المبخر الدوارBuchi Rotary المبخر R200
جهاز الطرد المركزي (أجهزة الاستشعار النانوية)Hermle Z300
الطرد المركزي (زراعة الخلايا)Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo
VortexWhirlimixer Fisherbrand
UltrasonicatorFB11021 صفائح الألمنيوم فيشربراند
جامعة نوتنغهام
لوحة زراعة الخلايا مقاس 35 ممIwaki3000035
10 مل حقنةBecton Dickenson
3T3 خلايا الخلايا الليفيةالمجموعة الأوروبية لمزارع الخلايا PLGA
Lakeshore المواد الحيوية7525 DLG 7E
فورمات البيريدينيومSigma AldrichP8535
Trypan blueSigma AldrichT8154
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتشS9638
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةسيجما ألدريتشS5136
حمض الهيدروكلوريكسيجماألدريتش 320331

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
  2. Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
  3. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
  4. Li, D., Xia, Y. N. Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel? Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).
  5. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
  6. Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
  7. Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
  8. Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
  9. Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
  10. You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
  11. Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).
  12. Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
  13. Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
  14. Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
  15. Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
  16. Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
  17. Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
  18. Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
  19. Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PLGA

مقالات ذات صلة