يوصف A-خطوتين الإجراء كولاجيناز نضح تعديل لعزل خلايا الكبد البشرية. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على كبد الثدييات الأخرى. هي خلايا الكبد معزولة المتاحة في ارتفاع العائد والجدوى، مما يجعلها نموذجا مناسبة للبحث العلمي في مجالات مثل تجديد الكبد، الدوائية والسمية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل خلايا الكبد البشرية من قبل خطوتين كولاجيناز الإرواء الداخلي
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
الكبد، والجهاز مع قدرة استثنائية التجديد، ويحمل مجموعة واسعة من الوظائف، مثل إزالة السموم، والتمثيل الغذائي والتوازن. على هذا النحو، هي خلايا الكبد نموذجا هاما لمجموعة كبيرة ومتنوعة من الأسئلة البحثية. على وجه الخصوص، واستخدام خلايا الكبد البشرية أهمية خاصة في مجالات الدوائية، وعلم السموم، وتجديد الكبد والبحوث متعدية. وبالتالي، فإن هذا الأسلوب نسخة معدلة من على بعد خطوتين الإجراء كولاجيناز نضح لعزل خلايا الكبد كما وصفها Seglen 1.
سابقا، وقد تم عزل خلايا الكبد عن طريق الطرق الميكانيكية. ومع ذلك، فقد ثبت أساليب الأنزيمية لتكون متفوقة كما تحتفظ خلايا الكبد سلامتها الهيكلية وظيفة بعد العزلة. هذه الطريقة المعروضة هنا تتكيف مع أسلوب تصميم من قبل لكبد الفئران إلى الإنسان قطعة الكبد ويؤدي إلى تحقيق عائد كبير من خلايا الكبد مع بقاء 77 ± 10٪. الرئيسيةالفرق في هذا الإجراء هو عملية إقناء؛ إدخال القنية في الأوعية الدموية. علاوة على ذلك، الطريقة الموصوفة هنا يمكن أيضا أن تطبق على كبد من الأنواع الأخرى مع الكبد أو الأوعية الدموية أحجام قابلة للمقارنة.
المقدمة
خلية التعليق الكبد يمكن إعدادها من الكبد عن طريق الطرق الميكانيكية أو الأنزيمية. وتشمل الطرق الميكانيكية المستخدمة في إعداد خلايا الكبد كله يجبر الكبد من خلال القماش القطني 2، والهز قطعة الكبد مع الخرز الزجاجي في شاكر خان 3، وذلك باستخدام المجانسة الزجاج مع المطاحن فضفاضة 4،5 الخ على مر السنين، انخفضت الطرق الميكانيكية من صالح بسبب الأضرار التي لحقت أغشية الخلايا وفقدان وظيفة خلايا الكبد من 6،7 معزولة. وبالتالي فإن استخدام طريقة الأنزيمية هو حاليا الوسيلة الرئيسية لعزل خلايا الكبد.
عزل خلايا الكبد باستخدام أ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الإرواء وعزل حلول
- إعداد الحلول اللازمة لنضح من قطعة الكبد وعزل خلايا الكبد وفقا للجدول 1. ويمكن تخزين الحلول في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- تصفية العقيمة جميع الحلول باستخدام فلتر 0.22 ميكرون.
- ينبغي لجميع الحلول التي تتلامس مع الكبد تكون معقمة.
2. إعداد معدات الإرواء وحلول
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الإعداد التروية
يجب تعيين المعدات اللازمة لنضح الكبد حتى وفقا لالشكل 1.
الجدوى والعائد من خلايا الكبد البشرية المعزولة
كان متوسط بقاء خلايا الكبد البشرية معزولة 77 ± 10٪ وكان متوسط العائد من خلايا الكبد 13 ± 11 مليون خلايا الكبد / ز الكبد، مع القيم كنسبة يعني ± ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
النتائج هذا البروتوكول في عزلة خلايا الكبد البشرية مع قابلية عالية ونقاء. من أجل تحقيق هذه النتائج، فمن المهم أن تبدأ مع قطعة مناسبة من الكبد. قطعة من الكبد وينبغي أن يكون الكبسولة سليمة غليسون على جميع الأسطح باستثناء 1 قطع السطح. عامل مهم آخر هو دفعة معينة من كولاجيناز المستخدمة، ودفعات مختلفة يمكن أن تؤدي إلى اختلافات واضحة في viabilities من خلايا الكبد بعد عملية الهضم 11. لذلك، ينبغي اختبار دفعات مختلفة من كولاجيناز وينبغي الحصول على الدفعة التي تنتج خلايا الكبد مع .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد تم تمويل الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول جزئيا عن طريق منحة من Hepacult GmbH المزيد. الدكتور وولفغانغ Thasler هو واحد من مؤسسي Hepacult GmbH المزيد ويظل واحدا من أعضاء المجلس في هذه الشركة. توظيف Maresa Demmel هو جزئيا Hepacult. يعمل بواسطة ماريا Hauner Hepacult GmbH المزيد. Hepacult هو العرضية شركة التكنولوجيا الحيوية من جامعة، والتي تقدم خلايا الكبد البشرية بموافقة والوصول المفتوح لأغراض البحث.
شكر وتقدير
وقدم هذا العمل ممكن من الأنسجة والخلايا مؤسسة البحوث الإنسان، مما يجعل الأنسجة البشرية المتاحة للبحوث. وكان في استقبال الدعم المالي لهذا العمل من الوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث (اسم المنحة: شبكة الكبد الظاهري، عدد المنح: 0315759) وHepacult GmbH المزيد. نتوجه بالشكر أيضا إلى المساعدين التقنيين من البنك الأنسجة مستشفى Großhadern لللجمع عينات الكبد والمساعدين التقنيين من مرفق الأساسية عزل خلية لتنفيذ نضح الكبد والكبدية العزلة. على وجه الخصوص، نود أن نشكر Natalja فندق Löwen لإثبات هذا الإجراء في شريط الفيديو. أخيرا، نود أن نشكر Natalja فندق Löwen وEdeltraud Hanesch لخلق الرسوم التوضيحية لالشكل 1 والأرقام في نظرة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| فخ الفقاعات | Ga & szlig ؛ ner Glastechnik | ||
| مكثف مغلف بالزجاج | Ga & szlig ؛ ner Glastechnik | ||
| 41 درجة ؛ ج حمام مائي | Julabo | 35723-H24 / EG | |
| 37 درجة ؛ ج حمام مائي | GFL | 1083 | |
| أسطوانة غاز مضغوط (95٪ O2/5٪ CO2) | Linde | ||
| أنابيب نفاذية للغاز | Neolab | 2-4440 | & nbsp ؛ |
| مضخة تمعجية | Ismatec | IP65 | & nbsp ؛ |
| ريشة مشرط | 320010 | ||
| ملقط | Omnilab | 5171014 | |
| قوارير مخروطية 1 لتر | شوت دوران | 2121654 | |
| قوارير مخروطية 5 لتر | شوت دوران | 2121673 | |
| أكواب | شوت دوران | 2110654 | |
| أنابيب الطرد المركزي 200 مل | Becton Dickinson | 352075 | |
| طبق تبلور | Omnilab | 5144063 | |
| قنيات الري المنحنية بأطراف كروية | Ernst Kratz GmbH | 1464LL / 1465LL A + B / 1472LL | ؛ |
| المشابك الوعائية الدقيقة | Ernst Kratz GmbH& | nbsp; | |
| ب ü قمع chner | Carl Roth | HT38.1 | |
| شبكة نايلون 210 مو ؛ م | Neolab | 4-1413 | ؛ |
| شبكة نايلون 70 & مو ؛ م | Neolab | 4-1419 | ؛ |
| 0.22 & م مرشحات معقمة | Peske | 99505 | |
| زجاجات 500 مل | Schott Duran | 2180144 | |
| زجاجات 1 لتر | Schott Duran | 2180154 | |
| مقياس الدم | Peske | 06-0001 | |
| أنابيب 1.5 مل | Eppendorf | 0030 120،086 | ؛ |
| 50 مل أنابيب مخروطية BD | Biosciences | 352070 | |
| دلو الثلج | Neolab | 1508454 | |
| ماصات باستور معقمة | العلامة التجارية | 747715 | |
| حشو الماصة الآلية (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| أجهزة الطرد المركزي المبردة | Eppendorf | 5810R | |
| التدفق الصفحي | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| شفاط (مضخة شفط جراحية منخفضة التدفق) | Atmos | C361 | ؛ |
| مختبر غاز | الموقد Integra | Fire Boy eco | |
| معطف مختبر يمكن التخلص منه | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| قناع جراحي مع قناع | Kimberly-Clark | 48247 | |
| حاجز | غطاء المحرك الجراحي | 42072 | |
| قفازات اللاتكس | Semper Care | CE0321 | ؛ |
| كولاجيناز (رقم الدفعة NB 4G) | Serva | 17465 | |
| هيدرات كلوريد الكالسيوم | ميرك | 2382 | ؛ |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| كلوريد الصوديوم | روث | 9265.2 | |
| هيبس | روث | 9105.3 | |
| كلوريد البوتاسيوم | Serva | 26868 | ; |
| ألبومين | بيورومول | 01400-2 | |
| جلوكوز | سيرفا | 22700 | |
| كربونات هيدروجين الصوديوم | Serva | 30180 | & nbsp ؛ |
| 0.4٪ محلول تريبان الأزرق | Lonza | 17-942E | |
| حل التخزين البارد | Hepacult GmbH |
المراجع
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 7/01/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
| EGTA | 0.1mM |
to:
| EGTA | 1mM |
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
| Calcium chloride dihydrate | 0.5µM |
to:
| Calcium chloride dihydrate | 5mM |
