Method Article

الفصل بين أنواع الخلايا المنوية عن طريق STA-PUT سرعة الترسيب

DOI:

10.3791/50648

⸱

October 9th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania, 2Biomedical Graduate Studies, University of Pennsylvania, 3Department of Animal Biology and Center for Animal Transgenesis and Germ Cell Research, University of Pennsylvania, 4Department of Genetics, University of Pennsylvania, 5Department of Biology, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح أسلوب STA-PUT للفصل بين مجموعات مختلفة من الخلايا المنوية على أساس الحجم والكثافة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحيوانات المنوية لدى الثدييات هو عملية التمايز المعقدة التي تحدث في مراحل عدة في الأنابيب المنوية من الخصيتين. حاليا، لا يوجد نظام موثوق زراعة الخلايا مما يسمح لتمايز المنوية في المختبر، وتتطلب معظم الدراسات البيولوجية للخلايا المنوية الحصاد الأنسجة من النماذج الحيوانية مثل الماوس والفئران. لأن الخصية يحتوي على العديد من أنواع الخلايا - على حد سواء غير المنوية (ايديغ، سيرتولي، النخاعي، والخلايا الظهارية) والمنوية (أمهات المني، الخلايا المنوية، طلائع منوية الجولة، التكثيف طلائع منوية والحيوانات المنوية) - دراسات الآليات البيولوجية المعنية في الحيوانات المنوية تتطلب العزلة وإثراء هذه أنواع مختلفة من الخلايا. يسمح أسلوب STA-PUT لفصل السكان غير متجانسة من الخلايا - في هذه الحالة، من الخصيتين - من خلال BSA الانحدار الخطي. أنواع الخلايا الفردية الرواسب مع مختلف سرعة الترسيب وفقا لمحجم ليرة لبنانية، والكسور المخصب لأنواع مختلفة من الخلايا التي يمكن جمعها والاستفادة منها في إجراء المزيد من التحليلات. في حين أن طريقة STA-PUT لا يؤدي إلى كسور نقية للغاية من أنواع الخلايا، على سبيل المثال كما يمكن الحصول مع بعض أساليب الخلية والفرز، وأنها لا توفر عائدات أعلى بكثير من مجموع الخلايا في كل جزء
(~ 1 × 10 8 خلايا / نوع من الخلايا المنوية من السكان بدءا من 7-8 × 10 8 خلايا). يتطلب هذا الأسلوب عالية الغلة الأواني الزجاجية المتخصصة فقط ويمكن القيام بها في أي غرفة باردة أو ثلاجة كبيرة، مما يجعلها وسيلة مثالية للمختبرات التي لديها محدودية فرص الحصول على المعدات المتخصصة مثل مضان تنشيط فارز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) أو elutriator.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحيوانات المنوية لدى الثدييات هو عملية التمايز المعقدة التي تحدث في مراحل عدة في الأنابيب المنوية من الخصيتين 1. لفترة وجيزة، وقف مثل أمهات المني الموجودة بالقرب من ظهارة نبيب الفجوة المنوية وتفرق في الخلايا المنوية، التي تخضع ثم الانقسامات الانتصافي. بعد الانقسام الاختزالي كاملة، وخلايا فرداني الناتجة عن ذلك، أو طلائع منوية الجولة، الخضوع لتكون النطاف، وهي عملية التمايز التي تنطوي على سفك السيتوبلازم والضغط من النواة. طلائع منوية تتطور تدريجيا السوط والخضوع استطالة والتكثيف من نواة، وإنتاج التمطيط ثم التكثيف طلائع منوية، على التوالي. المنتجات النهائية هي الحيوانات المنوية، والتي تم إصدارها في تجويف أنبوب صغير المنوية ومنه إلى البربخ حيث تنضج أخرى.

لأن عملية تكوين الحيوانات المنوية يعتمد على الظروف الهرمونية والجزيئية الخاصة فيالخصيتين، لم يتم حتى الآن وضع نظام موثوق الثقافة في المختبر لكامل عملية تكوين الحيوانات المنوية 2،3. وقد تم تطوير أساليب لخلق ثقافة "الجرثومية البدائية خلايا تشبه الخلايا" و "الخلايا مثل أرومة النطفة الجولة" فرداني، من الخلايا الجذعية، ولكن هذه الأساليب ليست قادرة على توليد أعداد كبيرة من هذه الخلايا وتفشل في إنتاج الخلايا المنوية في وقت لاحق بعد أنواع 4،5. لحسن الحظ، وأنواع الخلايا المنوية تختلف اختلافا كبيرا في الحجم، والذي يسمح لنظام التعليق وحيدة الخلية التي تم الحصول عليها من الخصيتين كله أن تكون مفصولة مع التدرج السائل. طريقة STA-PUT، تظاهر هنا، يستخدم الانحدار الخطي BSA والترسيب بسيطة لفصل الخلايا المنوية على أساس الحجم والكتلة 6-9.

طريقة STA-PUT ديها العديد من المزايا أكثر من غيرها من الأساليب الأكثر استخداما على نطاق واسع لفصل أنواع الخلايا المنوية: نظام مراقبة الأصول الميدانية وتصويل 10-13. جهاز STA-PUT يتطلب قلذ عدة قطع من الأواني الزجاجية المتخصصة تجميعها في غرفة باردة أو ثلاجة كبيرة. وبالتالي، فمن أقل تكلفة من استخدام فارز الخلية أو elutriator. طريقة STA-PUT ينتج كميات أكبر من الخلايا لكل نوع من الخلايا والخصية مما يمكن الفرز حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية في إطار زمني مشابه، على الرغم من نقاء كل السكان الخلية ليست عالية مثل تلك التي حصلت مع نظام مراقبة الأصول الميدانية 11. فرز الخلايا باستخدام الخرز المغناطيسي (المغناطيسية الفرز الخلية تفعيلها، MACS) مؤخرا استخدمت بنجاح لتخصيب أمهات المني من السكان الخلية الخصية مختلطة، لكنه غير مناسب حاليا لفصل الخلايا المنوية أو طلائع منوية بسبب الافتقار إلى المعرفة السطحية المناسبة علامات 14. ميزة إضافية للأسلوب STA-PUT على نظام مراقبة الأصول الميدانية أو MACS هو القدرة على عزل خلايا قابلة للحياة مناسبة لاحقة لأن الثقافة، وعلى النقيض من معظم بروتوكولات نظام مراقبة الأصول الميدانية، أنها لا تتطلب أي الحمض النووي أو أنواع أخرى من تلطيخ. للدراسات التي تتطلب لغلة الدو من أنواع الخلايا المنوية في ~ 90٪ النقاء، وSTA-PUT هو الأسلوب الأمثل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشمل البروتوكول STA-PUT ثلاث مراحل: 1) إعداد لأجهزة والكواشف، 2) إعداد تعليق خلية من الخصيتين كله، و 3) التحميل الخليوي، والترسيب، وجمع الكسر. عندما أجريت من قبل فريق من اثنين من الباحثين، وبروتوكول يأخذ ثماني ساعات في المتوسط.

1. إنشاء جهاز STA-PUT (الشكل 1)

*** يجب وضع جهاز STA-PUT في ثلاجة كبيرة 4 درجة مئوية أو غرفة باردة التي يمكن أيضا استيعاب جزء جامع، إذا ويفضل أن طريقة جمع.

  1. في الليلة السابقة (أو على الأقل قبل بضع ساعات) إجراء الأسلوب، ويغسل جميع المعدات (وخاصة الأواني الزجاجية والأنابيب) وتعقيم مع الايثانول 70٪. دعونا المعدات جافة تماما قبل تجميع الجهاز كما هو موضح في الشكل 1.
  2. تأمين اثنين 2 L اسطوانات (الأرقام 1B و C) وغرفة تحميل الخلية ( الشكل 1A) إلى منصة أعلى وربط جميع مع اثنين من قطع صغيرة من الأنابيب مع المشابك الأنبوب. المشبك أغلقت جميع الأنابيب. ختم صنبور على اسطوانة L أقصى اليمين 2.
  3. وضع بقضيب صغير في غرفة تحميل الخلية (الشكل 1A) وبقضيب أكبر في معظم اليسار 2 L اسطوانة (الشكل 1B) التي سوف تحتوي على 2٪ BSA.
  4. وضع غرفة الترسيب 2 L على منصة (1D الشكل). وضع يربك المعادن (الشكل 1F) مباشرة على الجزء العلوي من فتحة في الجزء السفلي من الغرفة الترسيب (الشكل 1D). هذا أمر بالغ الأهمية، كما يمنع يربك vortexing لمن السائل وتعطيل التدرج الخلية أثناء جمع الكسر. وضع غطاء على رأس غرفة الترسيب.
  5. بعد تطبيق كمية صغيرة جدا من الشحوم فراغ إلى أرض مشتركة الزجاج ثلاثي محبس (الشكل 1G)، المشبك محبس لأسفل حد ذاتهغرفة dimentation، وربط المفاصل الزجاج الأرضي من محبس وغرفة الترسيب.
  6. ربط الغرفة خلية التحميل (الشكل 1A) للمخرج حق محبس مع الأنابيب. إغلاق محبس.
  7. إرفاق أنابيب تجزئة الخلية إلى منفذ اليسرى من محبس. يضم أنابيب تجزئة قطعة من الأنابيب مع ماصة باستير الزجاج متصلة نهاية مفتوحة. وترد قطعة من أصغر تجويف أنابيب إلى نهاية ضيقة من ماصة الزجاج. ماصة ضيق يحد من تدفق تعليق خلية خلال جمع الكسر. المشبك هذا أنبوب صغير في أسفل جدا.
  8. إعداد 2 L كريبس (1X) العازلة يوم من التجربة (الجدول 1). ثم، وإعداد 550 مل 2٪ BSA في 1X كريبس، 550 مل 4٪ BSA في 1X كريبس، و 50 مل 0.5٪ BSA في 1X كريبس. تصفية وتبريد هذه الحلول إلى 4 درجات مئوية.
  9. صب الحل BSA 4٪ في L اسطوانة الحق 2 (الشكل 1C) وجيش صرب البوسنة 2٪الحل في ترك L 2 اسطوانة (الشكل 1B). تأكد من عدم وجود فقاعات كبيرة في الأنبوب الذي يربط هذه الاسطوانات.
  10. صب العازلة كريبس في غرفة التحميل الخلية وملء الأنابيب التي تربط هذه الغرفة مع غرفة الترسيب، والتأكد من عدم وجود فقاعات كبيرة، وهذه يمكن أن تعكر صفو التدرج. الضغط أو التحريك الأنبوب يساعد بلطف لإزالة الفقاعات. تأكد من أن جميع من المخزن المؤقت كريبس هو في الأنبوب وليس في غرفة الخلية.
  11. السماح لكمية صغيرة من العازلة كريبس في التدفق إلى غرفة الترسيب وثم تصفى تقريبا كل المخزن المؤقت في أنابيب تجزئة الخلية من أجل ملء الأنبوب وإزالة أي فقاعات كبيرة.
  12. وضع جامع الكسر مباشرة تحت غرفة الترسيب. التأكد من أن جميع الأنابيب جزء في مكان ومغطاة التفاف البلاستيك لمنع التلوث.

2. عزل الخلايا المنوية من الخصية الجامعة

  • تشريح الخصيتين من الفئران كاليفورنيا 12 الكبار (ويفضل لا يقل عن ثمانية أسابيع من العمر) ووضعت في المخزن كريبس في درجة حرارة الغرفة ليغسل أي مواد الملوثة. هذا البروتوكول يتم شرحها ينطوي على استخدام الفئران المختبرية وأعدم في الامتثال للمبادئ التوجيهية من جامعة اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام بنسلفانيا.
  • إضافة 45 ملغ كولاجيناز إلى 50 مل العازلة كريبس في أنبوب مخروطي الحق قبل كنت تنوي إضافة الأنابيب المنوية. يسمح هذا الحل لحرارة تصل إلى 33 درجة مئوية لمدة بضع دقائق. تقسيم بالتساوي إلى أنبوبين 50 مل المخروطية.
  • Decapsulate الخصيتين في لوحة منفصلة تحتوي على 8 مل كريبس العازلة، التخلص من الغلالة البيضاء الغلالة والإفراج عن الأنابيب المنوية. والغلالة البيضاء الغلالة هو الغشاء الرقيق الذي يحيط الأنابيب المنوية. يجب الأنابيب فصل بسهولة من الغلالة البيضاء الغلالة. للقيام بذلك، وجعل شق في الغلالة البيضاء الغلالة، وعقد هذا الغشاء مع بايص من الملقط، ودفع الأنابيب من وبعيدا عن الغشاء مع زوج آخر من الملقط.
  • إضافة 4 مل كريبس العازلة التي تحتوي على الأنابيب إلى كل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على 25 مل من محلول كولاجيناز واحتضان، والهز، في 33 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. في النهاية، يجب أن يكون على الأنابيب "السباغيتي مثل" المظهر.
  • تسمح الأنابيب لتسوية ل~ 5 دقائق إلى أسفل الأنبوب. من اجل الخروج من طاف وغسل 2X في 25 مل العازلة كريبس (في درجة حرارة الغرفة)، والسماح للالأنابيب لتستقر في قاع الأنبوب في كل مرة. ترك ~ 5 مل العازلة كريبس في كل أنبوب.
  • في حين الغسيل، إضافة 30 ملغ التربسين إلى 50 مل العازلة كريبس في أنبوب الصقر الحق قبل كنت تنوي إضافة الأنابيب المنوية. يسمح هذا الحل لحرارة تصل إلى 33 درجة مئوية لمدة بضع دقائق. تقسيم بالتساوي إلى أنبوبين 50 مل المخروطية.
  • إضافة 25 مل من محلول التربسين إلى كل من أنابيب تحتوي على اثنين من الأنابيب. إضافة 3 ميكروغرام الدناز (1 μg/10ml) إلى كل أنبوب لمنع الخليةق من التثاقل. احتضان، والهز، في 33 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  • استخدام تتحمل ماصة واسعة للتحريض على محلول يحتوي على الأنابيب، pipetting للهم ويخرجون تقريبا 10X. الحل يجب أن تبدأ لتبدو أكثر مثل تعليق خلية واحدة.
  • احتضان، والهز، في 33 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وإضافية. استخدام ماصة واسعة تتحمل لتفريق الأنابيب في تعليق خلية واحدة، pipetting للهم ويخرجون تقريبا 25X. إذا كنت لا تزال ترى الكثير من الأنابيب أو كتل الخلايا، وتفريق أكثر مع ماصة و / أو إضافة أخرى الدناز 3 ميكروغرام لكل أنبوب (تركيز أولي مزدوج).
  • تحديد تعليق خلية واحدة من خلال مصفاة الخلية شبكة 100 ميكرون (واحد لكل أنبوب من 30 خلية مل تعليق). الجمع بين الايقاف الخلية وحساب العدد الكلي للخلايا (يجب أن يكون بين 7-8 × 10 8 خلايا). *** لا تقم بتحميل أكثر من 800،000،000 الخلايا على التدرج.
  • استنادا إلى عدد الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.10، بيليه approprحجم IATE من الخلايا التي تمت تصفيتها في إطار التعاون الإقليمي 450 لمدة 5 دقائق ويغسل مع 30 مل كريبس العازلة. تكرار. وعادة ما *** 22 الخصيتين الغلة أكثر من 800،000،000 الخلايا، ولكن لا يتم تحميل أكثر من هذا العدد من الخلايا.
  • في resuspend بعناية الخلايا في 25 مل 0.5٪ BSA التي تحتوي على ما بين 2.5 و 5 ميكروغرام الدناز (اعتمادا على درجة التثاقل الخلية) دون خلق الفقاعات. تأكد من أن الخلايا لا تتجمع. تحديد تعليق خلية واحدة من خلال مصفاة الخلية شبكة 100 ميكرون. الخلايا هي الآن جاهزة للتحميل. تخلط جيدا قبل التحميل بواسطة قلب الأنبوب عدة مرات.

    • 3. تحميل الخلية والترسيب

    1. تأكد من أن يتم إغلاق محبس، ولكن في الموقف من شأنها أن تسمح لتدفق السائل من الغرفة الخلية (الشكل 1A) في غرفة الترسيب (الشكل 1D).
    2. بدوره على حد سواء لوحات بقضيب إلى إعداد منخفض (حوالي 70 دورة في الدقيقة) للسماح القضبان ضجة للتحرك بشكل مستمر، ولكن ببطء.
    3. صب تعليق خلية في غرفة الخلية (الشكل 1A) وفتح محبس بحيث تتدفق الخلايا ببطء الى غرفة الترسيب بمعدل 10 مل / دقيقة (الشكل 1D). إغلاق محبس. يمكن تحديد معدل التدفق عن طريق وضع علامة على فترات حجم الغرفة الترسيب.
    4. صب 5 مل من محلول 0.5٪ BSA في غرفة الخلية وتصب في غرفة الترسيب بمعدل 10 مل / دقيقة. إغلاق محبس. وهذه الخطوة غسل الخلايا من الغرفة الخلية. تكرار 4X.
    5. إعداد التدرج: فتح المشابك بين غرفة الخلية (الشكل 1A) واثنين من اسطوانات 2 L (الشكل 1B و C)، وتبدأ في استنزاف السائل الى غرفة الترسيب بمعدل 40 مل / دقيقة (الشكل 1D) على الفور. ضبط معدل تدفق لذلك يستغرق حوالي 20-30 دقيقة لتحميل التدرج BSA في غرفة الترسيب. رقيقة، وطبقة من الخلايا دون عائق الكذب على رأسوينبغي أن يكون BSA التدرج مرئية. مرة واحدة يتم تحميل معظم BSA، إغلاق محبس وتحويله إلى موقف من شأنها أن تسمح لاستنزاف السائل من غرفة الترسيب في أنبوب تجزئة.
    6. إيقاف لوحات ضجة.
    7. تسمح للخلايا أن الرواسب لمدة ساعة و 45 دقيقة. لا تخل الجهاز خلال هذه الفترة. أي الانفعالات الميكانيكية يمكن أن تعكر صفو التدرج.

    4. تجزئة وتحليل الكسور

    *** كما يمكنك تنفيذ الخطوات التالية، يجب الحرص على عدم تعكير صفو التدرج. إذا اختل التدرج BSA، فإن الإجراء لا يعمل!

    1. مرة واحدة وقد الرسوبية الخلايا، واستنزاف ببطء 50 مل من غرفة الترسيب في أنبوب مخروطي 50 مل وتوضع جانبا. هذا الكسر عادة ما تحتوي على كتل من الخلايا غير المرغوب فيها والحطام.
    2. نعلق الأنبوب جزء إلى جزء جامع. *** ومن الممكن أيضا لجمع الكسور باليد إذا كان جزء كوليالمنشئ غير متوفر.
    3. جمع الكسور: ضبط معدل التدفق مع محبس بحيث 10 مل (ملء أنبوب مجموعة واحدة) يتم جمعها كل 45 ثانية.
    4. سقف أنابيب جمع جزء وتدور لمدة 5 دقائق في 450 إطار التعاون الإقليمي في 4 درجات مئوية. تخلصي من طاف بلطف، والخلايا resuspend في السائل المتبقي، والحفاظ على الخلايا على الجليد.
    5. مرة واحدة يتم جمع جميع الكسور وتحليل مجهريا الكسور لصالح السكان مختلفة من الخلايا. ويمكن التمييز بين أنواع مختلفة من الخلايا استنادا إلى حجم الخلية ومورفولوجيا النووية 8،15 الشكل 2 يوضح "نتائج ممثلة" عن كسور المجمعة الثلاثة التي يتم إثراء للخلايا (أ) الجسمية والانتصافي وأمهات المني، (ب) طلائع منوية الجولة، و (ج) التمطيط والتكثيف طلائع منوية.
      • اكتب A أمهات المني هي 12-14μm كاليفورنيا. في قطر ولها نواة جولة التي هي متجانسة في تكوينها لونين.
      • نوع B أمهات المني هي 8 9μm كاليفورنيا. في قطر، وقد rounد نوى التي تظهر المغاير أكثر كثافة على طول محيط النووية.
      • الخلايا المنوية قبل مرحلة ترقق الصبغيات هي 7.5 8.2μm كاليفورنيا. في القطر، ويكون السيتوبلازم أقل من النوع (ب) أمهات المني، ولها نوى التي تبدو مماثلة لتلك التي في النوع (ب) أمهات المني.
      • الخلايا المنوية الأولية هي مرحلة ترقق الصبغيات 8-10 ميكرون كاليفورنيا. في قطر ولها نوى التي تبدو مشابهة لتلك الخلايا المنوية قبل مرحلة ترقق الصبغيات، ولكن يبدو للحصول على لونين أكثر كثافة في الغشاء النووي.
      • دور الاقتبال الخلايا المنوية الأولية هي 10-12 ميكرومتر كاليفورنيا. في قطر ولها نوى التي تبدو مشابهة لتلك الخلايا المنوية الأولية مرحلة ترقق الصبغيات.
      • الخلايا المنوية طور التثخن في أي مكان 12-18 ميكرومتر كاليفورنيا. في قطر، وتتألف من حافة رقيقة من السيتوبلازم المحيطة نواة كبيرة. ويمكن رؤية أكثر من لونين كتل كثيفة في النواة.
      • طلائع منوية الجولة هي 10 ميكرومتر كاليفورنيا. في قطر ولها نواة مستديرة مع جسيم نووي المكتظة تلطيخ في الوسط.
      • المتبقيالهيئات هي ~ 6.5 ميكرون في القطر، هي الجولة، وتفتقر إلى النواة.
      • التمطيط والتكثيف طلائع منوية هي مماثلة في الحجم لجولة طلائع منوية، ولكن لديها فريدة من نوعها، على شكل المنجل النواة.
      1. تبدأ مع جزء 15 وتحليل كل خمس كسور يصل إلى 85. عادة، سوف الكسور أقل من 15 تكون مختلطة جدا وملتف، وسوف كسور فوق 85 تحتوي على عدد قليل من أي خلايا قابلة للاستخدام.
      2. لتحليل جزء صغير، واتخاذ 5UL من السائل من أنبوب جمع جزء (مرة واحدة وقد تم معلق الخلايا بعد الطرد المركزي) وإضافة إلى 5UL من 8٪ الفورمالديهايد في المخزن كريبس. تسمح للخلايا ثابتة للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
      3. إضافة 5UL من 0.1٪ تريتون ودابي (5 μ / مل العازلة كريبس) إلى الخلايا الثابتة. تسمح للخلايا للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      4. وضع 10 ميكرولتر من الحل الناتج على شريحة، وتغطي مع انزلاق الغطاء، وتحليل مع المجهر مضان لتحديد نقاء كل جزء.
      5. الجمع بين الكسور التي تتشابه في الحجم والتشكل النووي (انظر "نتائج الممثل") لإنشاء السكان التالية من الخلايا: الخلايا مضاعفا الانتصافي والجسدية، طلائع منوية الجولة، والتكثيف / التمطيط طلائع منوية.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    نتيجة مثالية من الإجراء STA-PUT هو فصل ملحوظ نسبيا من الخلايا من الخصيتين يعتمد على حجم الخلية وكثافة. في حين أن الخلايا المعزولة من الخصيتين والمترسبة من خلال التدرج BSA، يمكن ملاحظة عدة نطاقات مميزة من الخلايا. أي كتل من الخلايا تميل إلى تنزل الى قاع الانحدار ولن تلوث الكسور الأخرى. مزيد قليلا حتى التدرج سيكون جسدية كبيرة والخلايا الانتصافي. أبعد ما يصل التدرج لا تزال وسوف تكون الجولة طلائع منوية صغيرة. سيتم مكثف في الجزء العلوي من التدرج طلائع منوية، الحيوانات المنوية، وتلويث خ...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    أولئك الذين يدرسون الحيوانات المنوية الاعتماد على النماذج الحيوانية لعينات الخلايا المنوية، كنظام ثقافة الخلية موثوق بها لا وجود لها حتى الآن طريقة لتوليد كل أنواع الخلايا المنوية 3. على الرغم من أن الخلايا المنوية يتم جمعها بسهولة من الخصيتين كله، النتائج فقط من السكان مختلطة. هذا يطرح مشكلة بالنسبة لأولئك الذين يرغبون في دراسة فرعية معينة من هذه الخلايا، مثل الخلايا الانتصافي، طلائع منوية الجولة، وطلائع منوية التكثيف. وتستخدم ثلاث طرق مختلفة حاليا لفصل هذه الأنواع الف...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة. هذا البروتوكول يتم شرحها ينطوي على استخدام الفئران المختبرية وأعدم في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة. تتم المحافظة على الحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول بتوجيه وموافقة من جامعة جنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية ولاية بنسلفانيا (IACUC بروتوكول # 804284).

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM055360 إلى SLB وU54HD068157 لRGM. وأيد JMB من التدريب غرانت T32 علم الوراثة في جامعة ولاية بنسلفانيا (GM008216).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    BSAAffymetrix / USB10857 100MGAlternate.
    0.5٪ و 2٪ و 4٪ محاليل BSAتذوب 0.25 جم و 11 جم و 22 جم (على التوالي) بأحجام إجمالية تبلغ 50 مل و 550 مل و 550 مل من 1x KREBS (على التوالي).ليكون يوم إجراء STA-PUT. تعقيم الفلتر.
    KREBS (10x)3.26 جم KH2PO4 + 139.5 جم كلوريد الصوديوم +5.89 جم MgSO4/7H20 + 40 جم سكر العنب + 3.78 جم CaCl 2/2H20 + 7.12 جم KCl، إحضار إلى 2 لتر مع ddH 2< / sub >0الأوتوكلاف / المرشح وتخزينه في 4 درجة ؛ ج لعدة أشهر.
    KREBS (1x)قم بإذابة 4.24 جم NaHCO3 < / sub>in 100 مل ddH2< / sub>0. أضف 200 مل 10x KREBS. أحضر إلى 2 لتر مع ddH20.ليكون يوم إجراء STA-PUT. تعقيم الفلتر.
    كولاجينازسيجماC9891-1G
    DNAseSigmaDNEP-5MG
    TrypsinSigmaT9201-1G
    DAPIتفضيل الباحث
    Triton-X100تفضيل الباحث
    الفورمالديهايد (~ 37٪)تفضيل الباحث
    الجدول 2:
    كتالوجشركةمعداتتعليقات
    جهاز STA-PUT الكاملمتجرزجاج ProScienceSTA-PUT (يستخدم هذا الإجراء غرفة الترسيب القياسية: Cat. رقم 56700-500)يشمل جميع الأواني الزجاجية والمعدات الخاصة بالجهاز. الأواني الزجاجية البديلة متاحة لأداء STA-PUT بأرقام خلايا أصغر.
    10 و مو ؛ مرشح شبكي mالماوس 22363549
    تفضيل الباحث
    14 مل أنابيب جمع الأجزاء القاعية المستديرة مع أغطيةتفضيل الباحث
    بحاجة إلى ما يقرب من 100 أنبوب
    جامع الكسورGE Healthcare Life Sciencesالموديل: Frac-920 ، رمز المنتج: 18-1177-40يمكن استخدام البديل.
    شرائح المجهر، غطاء زجاجتفضيل الباحث
    الضوء / المجهر الفلوريتفضيل الباحث
    يمكن استخدام المعدات # أدوات تشريح فيشربراند

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
    2. Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
    3. Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
    4. Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
    5. Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
    6. Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
    7. Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
    8. Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
    9. Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
    10. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
    11. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602- (2011).
    12. Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
    13. Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
    14. Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
    15. Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
    16. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
    17. Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
    18. Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
    19. Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    STA PUT Velocity SedimentationSpermatogenic Cell SeparationTestis Cell IsolationBSA Gradient SedimentationCell Fraction CollectionFluorescence Microscopy AnalysisWestern Blot AnalysisCell Size DifferentiationNuclear Morphology AssessmentGerm Cell Enrichment

    Related Articles