يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في الجسم الحي أسلوب التصوير لتميز الالتهاب الحاد والمزمن

19.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50690

⸱

أغسطس 16, 2013

 , 
1Lurie Family Imaging Center, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, 2Division of Pediatric Hematology/Oncology/Stem Cell Transplantation, Columbia University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

نحن تصف طريقة التصوير غير الغازية للتمييز مراحل التهابات. تسليم النظامية من كسيماترين يكشف مجالات التهاب حاد تعتمد على النشاط MPO في العدلات. في المقابل، حقن lucigenin يسمح التصور من التهاب مزمن تعتمد على النشاط Phox في الضامة.

الملخص

الالتهاب هو أحد الجوانب الأساسية لكثير من الأمراض التي تصيب الإنسان. في هذا التقرير الفيديو، ونحن لشرح تقنيات التصوير تلألؤ بيولوجي غير الغازية التي تميز الالتهاب الحاد والمزمن في نماذج الماوس. مع تلف الأنسجة أو غزو الممرض، العدلات هي خط الدفاع الأول، ولعب دورا رئيسيا في التوسط في الاستجابة الالتهابية الحادة. كما تقدم رد فعل للالتهابات، وحيدات تعميم تهاجر تدريجيا إلى موقع الإصابة وتفرق في الضامة ناضجة، الذي توسط الالتهابات المزمنة وتعزيز إصلاح الأنسجة عن طريق إزالة الحطام الأنسجة وإنتاج السيتوكينات المضادة للالتهابات. حقن داخل الصفاق من كسيماترين (5-الأمينية-2 ،3-ثنائي هيدرو-1 ،4-phthalazinedione، ملح الصوديوم) تمكن من الكشف عن التهاب حاد توسط إلى حد كبير من الأنسجة تسلل العدلات. كسيماترين يتفاعل على وجه التحديد مع الفائق المتولدة داخل phagosomes من العدلات منذ النتائج تلألؤ بيولوجي من الميلوبيروكسيديز (MPO) رد فعل بوساطة. Lucigenin (مكرر-N-methylacridinium نترات) يتفاعل أيضا مع الفائق من أجل توليد تلألؤ بيولوجي. ومع ذلك، lucigenin تلألؤ بيولوجي مستقل من الخطة الرئيسية للعمليات وأنها تعتمد فقط على أوكسيديز NADPH بلعمية (Phox) في الضامة أثناء الالتهابات المزمنة. معا، وكسيماترين وlucigenin سماح التصور غير الغازية وتقييم طولية من مجموعات سكانية مختلفة بلعمية عبر مراحل التهابات حادة ومزمنة. ونظرا للدور المهم من التهاب في مجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب التصوير غير الغازية يمكن أن تساعد في التحقيق في أدوار الفرق من العدلات والبلاعم في مجموعة متنوعة من الحالات المرضية.

المقدمة

الالتهاب هو استجابة بيولوجية درجة عالية من التنظيم تشارك في مجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك العدوى الميكروبية 1، 2 التئام الجروح، ومرض السكري 3، 4 السرطان، القلب والأوعية الدموية 5، 6 الاعصاب، وأمراض المناعة الذاتية 7. يتطلب التهاب الأنسجة التنسيق السليم لمختلف الخلايا المناعية من أجل تحقيق إزالة العوامل المسببة للأمراض، وإصلاح الأنسجة، وقرار المرض. العدلات والضامة وسطاء المناعة مفتاح من التهاب الأنسجة. في المرحلة الحادة من الالتهاب، والعدلات هي أول المستجيبين لمختلف المنبهات الضارة وتلف الأنسجة 8. العدلات يتسرب بسرعة من التداول إلى موقع الإصابة، حيث إبطال نشاط الخلايا الغازية الميكروبات عن طريق الإفراج عن حبيبات مضادة للميكروبات والبلعمة. خلال البلعمة، العدلات تبتلع الميكروبات الغازية في phagosomes، ضمن الخلايا التي تنتج مستويات عالية من superoxIDE (O 2 · -). الفائق Phagosomal هو المصدر الأساسي للعديد من أنواع الاكسجين التفاعلية المصب (ROS). على سبيل المثال، يمكن dismutated الفائق لبيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) بواسطة تطافر عفوية أو عن طريق ديسموتاز الفائق (الاحمق) 9، 10. في العدلات، الميلوبيروكسيديز (MPO) تحويل مزيد من بيروكسيد الهيدروجين إلى حمض تحت الكلور المضادة للميكروبات (HOCL) 11. كما تواصل الاستجابات الالتهابية، وحيدات تعميم تهاجر تدريجيا إلى موقع الإصابة وتفرق في الضامة ناضجة 2، التي تساعد على إزالة مسببات الأمراض المعطل والحطام الخلية وظيفة البلعمة. وبالإضافة إلى ذلك، كمنظم رئيسي في مرحلة لاحقة من الالتهاب، والبلاعم يعزز إصلاح الأنسجة من خلال إنتاج السيتوكينات المضادة للالتهابات 12 وعن طريق توليد ROS خارج الخلية في انخفاض مستوى 9. وROS ولدت في هذه المرحلة في وقت لاحق تنظيم إعادة عرض الأنسجة، وتشكيل سفينة جديدة، وreepithelialization 13.

بلعمية أوكسيديز NADPH (Phox) هو المصدر الرئيسي للإنتاج الأكسيد في كل من العدلات والبلاعم 9. Phox عبارة عن مجمع متعدد الوحيدات الذي ينظم بإحكام 9 الجمعية. وعميم الإنزيم يحتوي على عدة مفارز التنظيمية عصاري خلوي (P67 phox، P47 phox، P40 phox، وRAC) وغشاء محدد مغاير السيتوكروم ب 558 (تتألف من الوحيدات صبا وCYBB). السيتوكروم ب 558 هو جوهر رد فعل من خلاله الوحيدات CYBB (المعروف أيضا باسم P91 phox وNOX2) ينفذ الأولية الأكسدة سلسلة من ردود الفعل 9. ومن المثير للاهتمام، مواقع التجميع تختلف بين العدلات والضامة. في العدلات يستريح، السيتوكروم ب 558 هي في معظمها موجودة في غشاء من حبيبات تخزين داخل الخلايا 14. خلال البلعمة، العدلات تجميع حoloenzymes في phagosomes 9، حيث مستويات عالية من النشاط MPO موجودة أيضا. والعدلة Phox يستهلك بسرعة الأكسجين وتمارس قوتها ميكروبات التي كتبها الإنتاج ROS، ووصف ظاهرة انفجار الجهاز التنفسي 11. في المقابل، الضامة لديها مستوى أدنى من التعبير MPO والسيتوكروم ب 558 تم العثور على معظمها في غشاء البلازما 15 و 16. وهكذا العدلات تنتج مستويات عالية من النشاط الفائق لمكافحة الجراثيم، في حين الضامة توليد أقل الفائق للوظائف التنظيمية 15.

منذ التهاب هي معقدة في عملية الجسم الحي، وأساليب التصوير غير الغازية محددة لمراحل مختلفة من التهاب تسمح التقييم الكمي ونماذج طولية من المرض. باستخدام دراسات الآلي، وقد أثبتنا سابقا استخدام اثنين من وكلاء chemiluminescent، كسيماترين (5-الأمينية-2 ،3-ثنائي هيدرو-1 ،4-phthalazinedione) وlucigenin (مكرر-N-methylacridinium نترات)، للتصوير غير الغازية من المراحل الحادة والمتأخرة (المزمنة) من الالتهاب، على التوالي 17. كسيماترين يمكن تصور النشاط MPO العدلة في المرحلة الحادة من التهاب 18-20، في حين تلألؤ بيولوجي lucigenin يمكن استخدامها لتقييم نشاط البلاعم بالتعاون مع المرحلة في وقت متأخر أو الالتهابات المزمنة 17. في هذا المخطوط، استخدمنا نموذجين التهاب التجريبية (SC سلطة النقد الفلسطينية والشوري LPS) لإثبات هذه التقنيات التصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الدراسات على الحيوانات تحت بروتوكولات المؤسسية المعتمدة والمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان.

1. الكواشف وحلول

  1. حل سلطة النقد الفلسطينية لSC التلقيح: إعداد محلول المخزون من phorbol 12-13-ميريستات خلات (سلطة النقد الفلسطينية) في 5 ملغ / مل في DMSO. تخزين محلول المخزون في -20 درجة مئوية. قبل التلقيح، وذوبان الجليد الحل الأوراق المالية وتمييع إلى 1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني سلطة النقد الفلسطينية.
  2. حل LPS لSC التلقيح: ذوب عديد السكاريد الشحمي (LPS السالمونيلا الملهبة للمن النمط المصلي الملهبة) في برنامج تلفزيوني العقيمة في 1 ملغ / مل قبل SC التلقيح.
  3. حل كسيماترين للتصوير المرحلة الحادة: ذوب كسيماترين (5-الأمينية-2 ،3-ثنائي هيدرو-1 ،4-phthalazinedione، ملح الصوديوم) في محلول ملحي معقم (0.9٪ كلوريد الصوديوم) في 10 ملغ / مل. ويمكن تخزين الحل في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  4. حل Lucigenin للتصوير المرحلة المزمنة: ذوب lucigenin (مكرر-N-methylacridinium نترات) في محلول ملحي معقمفي 2.5 ملغ / مل. ويمكن تخزين الحل في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.

2. سلطة النقد الفلسطينية تحت الجلد التهاب الموديل

  1. تخدير المجلس الوطني للمقاومة الفئران عارية في غرفة الاستقراء مع 1-2٪ isoflurane و. تأكيد التخدير العام عن طريق فقدان الحركة ومعدل التنفس المستمر. نقل حيوان إلى مخروط الأنف توصيل الغاز isoflurane والمختلطة والحفاظ على الحيوان تحت التخدير.
  2. استخدام الكحول الآيزوبروبيل مسح لتنظيف وتطهير مكان الحقن على الجناح الأيسر.
  3. باستخدام تقنية معقمة، وضخ 50 ميكرولتر من الحل التلقيح سلطة النقد الفلسطينية (التي تحتوي على 50 ميكروغرام من سلطة النقد الفلسطينية) في الفضاء تحت الجلد على الجناح الأيسر. إزالة السوائل الزائدة من موقع الحقن باستخدام وسادة ايزوبروبيل. تجنب استخدام التسكين لأنها قد تؤثر على الاستجابات الالتهابية.
  4. نقل الحيوان إلى قفص الإسكان ويرصد عن كثب انتعاشها من التخدير. من أجل المساعدة في الانتعاش، واستخدام وسادة التدفئة للحفاظ على الحيوانات دافئة.

3. تحت الجلد LPS التهاب الموديل

  1. تخدير الفئران C57BL/6J مع 1-2٪ isoflurane وفي غرفة الاستقراء. مرة واحدة إقامة التخدير العام، نقل حيوان إلى مخروط الأنف توصيل الغاز isoflurane ووالحفاظ على الحيوان تحت التخدير.
  2. استخدام الكحول الآيزوبروبيل مسح لتنظيف موقع الحقن على قاطع الطريق الأيسر.
  3. باستخدام تقنية معقمة، وضخ 50 ميكرولتر من الحل التلقيح LPS (التي تحتوي على 50 ميكروغرام من LPS) في قاطع الطريق الأيسر. إزالة السوائل الزائدة من موقع الحقن باستخدام وسادة ايزوبروبيل. تجنب استخدام التسكين لأنها قد تؤثر على الاستجابات الالتهابية.
  4. نقل الحيوان إلى قفص الإسكان ويرصد عن كثب انتعاشها من التخدير. استخدام وسادة التدفئة للحفاظ على الحارة الحيوان خلال فترة الانتعاش.

4. التصوير تلألؤ بيولوجي من التهاب

  1. تخدير الحيوان في دائرة الاستقراء مع 1-2٪ isoflurane والغاز المختلطة. بسnfirm التخدير العام عن طريق فقدان الحركة ومعدل التنفس المستمر.
  2. في حين أن الحيوان لا يزال تحت التخدير، والغشاء البريتونى (IP) حقن حل كسيماترين (10 ملغ / مل)، أو الحل lucigenin (2.5 ملغ / مل) للتصوير التهاب حاد أو مزمن، على التوالي. الجرعة النهائية هي 100 ملغ / كغ للكسيماترين و 25 ملغ / كغ للlucigenin. A أقل جرعة من lucigenin (10-15 ملغ / كلغ) يمكن استخدامها لتجنب السمية المحتملة لبعض سلالات الفئران. علامات السمية وتشمل ضيق في التنفس وضيق في التنفس. سلالة C57BL/6J ديه أدنى lucigenin التحمل من سلالة NCR عارية.
  3. نقل الحيوانات الى غرفة التصوير من نظام التصوير تلألؤ بيولوجي.
  4. أداء التصوير تلألؤ بيولوجي على فترات متتابعة حد أدنى 1. وتتألف كل خطوة التصوير من 1 دقيقة اكتساب الوقت، F / توقف = 1، binning = 16 و 0 ثانية تأخير.
  5. في لوحة الحصول على الصور، لتمكين متتابعة التصوير متعددة الخطوات، انقر على تسلسل وضع بوtton. توفير الخطوات التصوير كافية في اقتناء الشخصي لتحديد الناتج التلألؤ القصوى (عادة 15 خطوات دقيقة واحدة تكفي). يسمح قسم التصوير 15 دقيقة وقتا كافيا لامتصاص الركيزة وجهاز الدورة الدموية.
  6. إزالة الحيوان من غرفة التصوير ونقله مرة أخرى إلى القفص الإسكان. من أجل المساعدة في الانتعاش، واستخدام وسادة التدفئة للحفاظ على الحيوانات دافئة.
  7. خلال تحليل ما بعد الاستحواذ، استخدام حزمة برامج التصوير لحساب مجموع ذروة إشارة إضاءة الحيوية من خلال المناطق موحدة ذات الاهتمام (ROI). الصور موجودة كما الاشراق في الفوتونات / ثانية / سم 2 / ريال مع الحد الأدنى والحد الأقصى عتبة محدد. يتم عرض البيانات الكمية والجريان الكلي في الفوتونات في الثانية لكل ROI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أجرينا التصوير تلألؤ بيولوجي طولية لتقييم التهاب حاد ومزمن في النماذج التجريبية التهاب. Phorbol 12-13-ميريستات خلات (سلطة النقد الفلسطينية) هو بروتين كيناز C قوية (بي كي سي) ناهض الذي ينشط Phox لإنتاج أنيون الفائق ومشغلات الاستجابات الالتهابية الحادة الشديدة 21. تسبب SC حقن 50 ملغ من سلطة النقد الفلسطينية في المجلس الوطني للمقاومة الفئران عارية تهيج الجلد السريع والتهاب حاد في مواضع الحقن 18، 22، 23. أجرينا التصوير يوميا لمدة 4 أيام مع أول الصور التي تم الحصو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا التقرير، ونحن يبرهن على وجود طريقة للتصوير تلألؤ بيولوجي غير الغازية من التهاب في الحيوانات الحية. الاستفادة من الانارة اثنين من ركائز، كسيماترين وlucigenin، لا يمكن للطريقة تمييز مراحل مختلفة من الالتهابات. ويرتبط تلألؤ بيولوجي كسيماترين مع العدلات في المرحلة الحادة من التهاب، بينما توسط تلألؤ بيولوجي lucigenin بواسطة الضامة في المرحلة المزمنة. صغيرة نسبيا (MW = 177.16 جم / مول) وغير مشحونة كهربائيا، وكسيماترين يمكن ان تخترق بسهولة كل من البلازما وغشاء phagosomal 25-2...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح في هذه الدراسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة نانسي لوري ماركس. نشكر الدكتور نانسي E. كول لقراءة نقدية للمخطوطة. نشكر كين K. ونغ لمساعدته في إعداد هذا التقرير الفيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MOP8139 
عديد السكاريد الدهني من السالمونيلا المعوية < / em> النمط المصلي المعويSigma-Aldrich Co., St. Louis, MOL2012 
لومينول (5-أمينو-2،3-ثنائي هيدرو-1،4-فثالازينيديون ، ملح الصوديوم) شركةسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريA4685  ؛
لوسيجينين (نترات مهريس-N-ميثيل أكريدينيوم) شركةسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريM8010  ؛
نظام التصوير الطيفي IVIS مع حزمة برامج Living Imaging 4.2Caliper LS / Perkin Elmer ، Hopkinton ، MA& nbsp ؛

المراجع

  1. Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
  2. Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999).
  3. Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Inflammation, stress, and diabetes. J. Clin. Invest. 115, 1111-1119 (2005).
  4. Weitzman, S. A., Gordon, L. I. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 76, 655-663 (1990).
  5. Ridker, P. M., Cushman, M., et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).
  6. Wyss-Coray, T., Mucke, L. Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword. Neuron. 35, 419-432 (2002).
  7. Hamilton, J. A. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).
  8. Harlan, J. M. Leukocyte-endothelial interactions. Blood. 65, 513-525 (1985).
  9. Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
  10. Rest, R. F., Spitznagel, J. K. Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity. Biochem. J. 166, 145-153 (1977).
  11. Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. 92, 3007-3017 (1998).
  12. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).
  13. Jiang, F., Zhang, Y., et al. NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).
  14. Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18. Blood. 81, 3122-3129 (1993).
  15. Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis. Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).
  16. Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism. J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).
  17. Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo imaging of inflammatory phagocytes. Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).
  18. Gross, S., Gammon, S. T., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, 455-461 (2009).
  19. Kielland, A., Blom, T., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
  20. Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. Noninvasive assessment of localized inflammatory responses. Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).
  21. Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).
  22. Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury. Lab Invest. 52, 61-70 (1985).
  23. Fukaya, S., Matsui, Y., et al. Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation. Lab Invest. 93, 72-80 (2013).
  24. Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
  25. Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).
  26. Allen, R. C., Loose, L. D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).
  27. Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).
  28. Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).
  29. Dahlgren, C., Karlsson, A. Respiratory burst in human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 3-14 (1999).
  30. Aerts, C., Wallaert, B., et al. Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).
  31. Zhang, N., Francis, K. P., et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles. Nat Med. , (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تصوير التألق الحيويالالتهاب الحادالكشف عن الخلايا المتعادلةالكشف عن الخلايا البلعميةركيزة اللومينولركيزة اللوسيجينيننماذج الفئرانالاستجابة الالتهابيةالتصوير المتسلسل
في الجسم الحي أسلوب التصوير لتميز الالتهاب الحاد والمزمن
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.