Method Article

المضاعفة نيون ميكروأري لتحليل البروتين اللعابية الإنسان عن طريق البوليمر المجهرية وحزم الألياف البصرية

DOI:

10.3791/50726

⸱

October 10th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Tufts University, 2Department of Analytical Chemistry, Complutense University (Spain), 3Department of Electrical and Computer Engineering, Tufts University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف إجراءات التنميط البروتينات اللعابية باستخدام صفائف المضاعفة الأجسام المضادة المستندة إلى المكروية. كانت مرتبطة تساهميا الاجسام المضادة لفلوري ترميز الصبغة 4.5 ميكرومتر المجهرية البوليمر باستخدام الكيمياء carbodiimide. أودعت المجهرية المعدلة في microwells الألياف الضوئية لقياس مستويات بروتين في اللعاب باستخدام المناعية شطيرة مضان.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن تصف بروتوكول للقياس في وقت واحد ستة البروتينات في اللعاب باستخدام الأجسام المضادة المكروية القائمة على مجموعة من الألياف البصرية. التكنولوجيا المناعية مجموعة العاملين يجمع بين مزايا القائمة على المكروية تعليق مجموعة تلفيق باستخدام المجهر مضان. كما هو موضح في بروتوكول الفيديو، وترميز المتاحة تجاريا المجهرية 4.5 ميكرومتر البوليمر في سبعة أنواع مختلفة، متباينة من قبل اثنين من تركيز الأصباغ الفلورية المحاصرين جسديا داخل المجهرية. تم تعديل المجهرية المشفرة التي تحتوي على مجموعات الكربوكسيل السطح مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من خلال التقاط EDC / NHS اقتران الكيمياء. لتجميع ميكروأري البروتين، وأنواع مختلفة من المجهرية المشفرة وبين functionalized مختلطة عشوائيا وأودعت في 4.5 ميكرون microwells، والتي كانت محفورا كيميائيا في نهاية القريبة من حزمة من الألياف البصرية. تم استخدام حزمة من الألياف البصرية على حد سواء الناقل وللتصوير مicrospheres. مرة واحدة تجميعها، فقد تم استخدام ميكروأري لالتقاط البروتينات في طاف اللعاب التي تم جمعها من العيادة. واستند الكشف على المناعية شطيرة باستخدام مزيج من الأجسام المضادة الكشف عن البيروكسيديز التحاليل المختلفة مع لجنة التحقيق الفلورسنت streptavidin مترافق، R-فيكوإيريترين. تم تصوير ميكروأري بواسطة المجهر مضان في ثلاث قنوات مختلفة، واثنين للتسجيل المكروية واحد للإشارة الفحص. كانت الميكروسكوب مضان ثم فك الشفرة وتحليلها باستخدام خوارزمية محلية الصنع في MATLAB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ أول ميكروأري ذكرت من قبل كافة Schena وزملاء العمل في منتصف 1990s، وقد استخدمت هذه الأداة القوية في العديد من مجالات البحوث البيولوجية 1. ميكروأرس الضد قادرة على اكتشاف البروتينات في وقت واحد في عدة سوائل التشخيص، مثل الدم، ولها تطبيقات مهمة في التشخيص السريري وفحص العلامات البيولوجية 2-10. اللعاب، يحتوي على العديد من نفس التحاليل والدم، فقد اعتبر كبديل أفضل من الدم لجمع اللعاب آمنة، موسع، ويمكن القيام بها من قبل العاملين الطبيين المدربين الحد الأدنى من 11-13. حاليا، وتحليل البروتين المضاعفة باستخدام عينات من اللعاب محدودة بسبب عدة عوامل هامة، بما في ذلك تركيز منخفض من الهدف الحليلة 14 ومجموعة واسعة من المؤشرات الحيوية تركيز مختلفة 15.

.

هنا، ونحن لشرح تحليل ستة البروتينات: عامل النمو البطاني الوعائي الإنسان (VEGF)، انترفيرون غاما الناجمة عن البروتين 10 (IP-10)، انترلوكين 8 (IL-8)، وعامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي)، المصفوفة metallopeptidase 9 (MMP-9)، وانترلوكين 1 بيتا (IL-1β) . تم التحقق من أداء الأسلوب في البداية باستخدام الحلول القياسية تشكل البروتينات المؤتلف تحليلها وعرقلة العازلة. تم اختبار عينات اللعاب التي تم جمعها من المرضى الحقيقية لمختلف الأمراض التنفسية المزمنة وكذلك الاصحاء أيضا مع أداء مرضيا. وينبغي أن يكون البروتوكول تنطبق على التحاليل البروتين الأخرى وغيرها من المقايسات القائم المكروية. هذه المنصة توفر مزايا كبيرة لمجال الكيمياء التحليلية، لأنها تتيح سريعة ودقيقة، وقابلة للتكرار التحليل المتزامن لتركيزات منخفضة من البروتينات عدة مع مجموعة واسعة ديناميكية، والحد الأدنى التفاعلات غير محددة، وانخفاض استهلاك العينة، والتكلفة المنخفضة بالمقارنة إلى مماثلة انزيم مرتبط المناعي-مقايسة (ELISA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
الشكل 1. . سير العمل لتطبيق الألياف الضوئية المكروية الأجسام المضادة لمجموعة التنميط اللعاب (1) يتم ترميز المجهرية داخليا مع اثنين من الأصباغ الفلورية، (2) يتم تعديل المجهرية المشفرة خارجيا مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة البروتين محددة، (3) يتم خلط المجهرية المضاعفة، و (4) تودع بشكل عشوائي في microwells محفورا في نهاية القريبة من حزمة من الألياف البصرية؛ (5) يتم التقاط البروتينات اللعابية بواسطة المجهرية من خلال ساندويتش المناعية، و (6) كميا باستخدام المجهر مضان.

1. المجهرية ترميز

  1. تزن اليوروبيوم الصوديوم (III) thenoyltrifluoroacetonate هيدرات (EU-TTA، MW = 869.54 جم / مول) في قارورة من الزجاج العنبر وإعداد محلول المخزون 200 ملم في رباعي هيدرو الفوران (THF). المزيج بلطف من قبل pipetting؛ تحقق بصريايذوب الصبغة تماما.
  2. تزن الكومارين 30 (C30، MW = 347.41 جم / مول) في قارورة من الزجاج العنبر وإعداد محلول المخزون 12 ملي في THF. المزيج بلطف من قبل pipetting؛ تحقق بصريا يذوب الصبغة تماما.
  3. إعداد 700 ميكرولتر من محلول العمل لكل نوع المكروية باستخدام حلول الأسهم وTHF للوصول إلى تركيز النهائي المدرجة في الجدول 1.
  4. ضمان المجهرية (10٪ ث / ت) وعلقت كذلك من قبل vortexing، ومن ثم نقل 60 ميكرولتر التعليق إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  5. إضافة 600 ميكرولتر PBS إلى المكروية التعليق ومزيج من قبل pipetting 20x و. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 10،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق وإزالة بعناية طاف. كرر هذه العملية 2X أخرى لغسل المجهرية.
  6. غسل بيليه المكروية 3X مع THF باستخدام إجراء مماثل كخطوة 1.5.
  7. الطرد المركزي تعليق المكروية / THF في 10،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق، وإزالة طاف، وإعادة تعليق بيليه في 600 ميكرولترالحل العمل المدرجة في الجدول 1. نقل الخليط إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge جديدة.
  8. ختم أنبوب microcentrifuge مع parafilm ووضعه على شاكر. يهز في 3،000 دورة في الدقيقة واحتضان لمدة 24 ساعة، وحماية من الضوء من خلال تغطية الإعداد باستخدام مربع مغطاة بورق الألمنيوم.
  9. الطرد المركزي تعليق المكروية في 10،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق لتشكيل بيليه.
  10. إزالة طاف حل صبغ، وغسل المجهرية 6X مع 600 ميكرولتر الميثانول ثم مع 600 ميكرولتر PBS تحتوي على 0.01٪ توين 20 6X آخر، كما هو موضح في الخطوة 1.5.
  11. تخزين المجهرية المشفرة في 600 ميكرولتر PBS تحتوي على 0.01٪ توين 20 في 4 درجات مئوية حتى استخدامها، وحماية من الضوء.
اسم نوع المكروية: 1 2 3 4 5 6 قوية> 7
الاتحاد الأوروبي وTTA (ملم) 100 100 10 100 10
C30 (ملم) 1 1 6 6 1 6

الجدول 1. تركيزات من الاتحاد الأوروبي ونقل واكتساب التكنولوجيا والحلول C30 العمل.

2. إعداد المجهرية البروتين التقاط

  1. إعداد العازلة MES [2 - (N-morpholino) حمض ethanesulfonic (MES) 0.1 M، كلوريد الصوديوم 0.9٪، 0.01٪ SDS، ودرجة الحموضة 5.7] والعازلة PBS / SDS (فوسفات الصوديوم 0.01 M، كلوريد الصوديوم 0.154 M، SDS 0.01٪، ودرجة الحموضة 7.4) مقدما في درجة حرارة الغرفة.
  2. إضافة 200 ميكرولتر المشفرة التعليق المكروية (المجهرية تحتوي على 2 ملغ ~) في صندوق للقفل 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. من المهم أن استخدام هذا النوع من أنبوب microcentrifuge لتجنب تسرب أثناء الحضانة في الخطوة 2.6.
    3. <لى> غسل المجهرية مع 600 ميكرولتر العازلة MES 3X كما هو موضح في الخطوة 1.5. إضافة 700 ميكرولتر MES إلى بيليه المكروية وتخلط جيدا من قبل pipetting.
  3. إعداد 0.105 جم / مل 1 إيثيل-3-[3 dimethylaminopropyl] carbodiimide هيدروكلوريد (EDC، MW = 191.7 جم / مول) و0.163 جم / مل سلفو-N-hydroxysulfosuccinimide (سلفو-NHS، MW = 217.13 جم / مول) الحلول في المنطقة العازلة MES في أنابيب منفصلة.
  4. إضافة 150 ميكرولتر الطازجة قطرة حل EDC قطرة في التعليق المكروية. وEDC hydrolyzes بسرعة كبيرة، وبالتالي فمن الضروري استخدام الحل تقدم طازجة لضمان كفاءة الشلل. مباشرة بعد اضافة EDC، إضافة 150 ميكرولتر سلفو-NHS حل لالمجهرية، وتخلط جيدا من قبل pipetting والتحقق من تعليق متجانسة.
  5. غطاء الأنبوب، وختم ذلك مع parafilm، ووضعه على شاكر. يهز في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعة، وحماية من الضوء باستخدام مربع مغطاة بورق الألمنيوم.
  6. أجهزة الطرد المركزي في suspens المكرويةايون في 10،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق لتشكيل بيليه وإزالة طاف. يغسل مع 500 ميكرولتر المجهرية PBS / SDS 3X العازلة كما هو موضح في الخطوة 1.5.
  7. إضافة 200 ميكرولتر PBS / SDS العازلة لبيليه، مزيج المجهرية جيدا ونقل الحل إلى 300 ميكرولتر PBS / SDS العازلة التي تحتوي على 60 ميكروغرام الأجسام المضادة الالتقاط. من المهم أن تعليق بيليه المكروية أولا ثم إضافة تعليق المكروية في حل الأجسام المضادة.
  8. احتضان الخليط الأجسام المضادة المجهرية التي تهز في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعة على شاكر، حماية من الضوء باستخدام مربع مغطاة بورق الألمنيوم.
  9. الطرد المركزي تعليق المكروية في 10،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق لتشكيل بيليه وإزالة طاف. يغسل مع 500 ميكرولتر المجهرية StartingBlock (TBS) 3X عرقلة العازلة، كما هو موضح في الخطوة 1.5.
  10. مزيج المجهرية مع 1 مل من TBS عرقلة العازلة واحتضان المجهرية في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة على شاكر، حماية من الضوء باستخدام كوف مربعالأحمر مع رقائق الألومنيوم.
  11. الطرد المركزي تعليق المكروية في 7،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق لتشكيل بيليه وإزالة طاف. غسل 3X بيليه مع 500 ميكرولتر TBS عرقلة العازلة، كما هو موضح في الخطوة 1.5.
  12. أجهزة الطرد المركزي الحل المكروية في 7،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق لتشكيل بيليه وإزالة طاف. إضافة 500 ميكرولتر TBS عرقلة العازلة ومزيج من قبل pipetting.
  13. تخزين التعليق المكروية تعديل في 4 درجات مئوية حتى استخدامها، وحماية من الضوء.
  14. كرر هذا الإجراء لجعل أنواع أخرى من المجهرية باستخدام الأجسام المضادة المقابلة.

3. الجمعية ميكروأري الألياف البصرية

  1. مزيج 50 ميكرولتر من كل نوع من البروتين المجهرية التقاط في أنبوب microcentrifuge تعقيمها جديدة. الطرد المركزي المجهرية الأسهم تجمع في 7،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق، وإزالة طاف بحيث حجم المتبقي هو ما يقرب من 100 ميكرولتر.
  2. الألياف البصرية ومن ناحية القص حزم إلى ما يقرب من 5 سم في الطول وبالتتابع تلميع طرفي على جهاز تلميع باستخدام 30، 15، 9، 6، 3، 1، 0.5، و 0.05 ميكرون الماس الحجم اللف الأفلام. يصوتن حزمة مصقول في الماء منزوع الأيونات لمدة 2 دقيقة لإزالة أي جزيئات.
  3. وضع شريط التحريك المغناطيسي صغيرة إلى 0.5 مل أنبوب microcentrifuge، إضافة 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني خالية من البروتين العازلة ويقلب على طبق التحريك المغناطيسي لمدة 30 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء.
  4. حفر واحدة من نهاية حزمة الألياف مصقول في محلول حمض الهيدروكلوريك 0.025 N لمدة 150 ثانية 10،16. يغرق فورا ويصوتن نهاية محفورا في الماء منزوع الأيونات لمدة 1 دقيقة. تجفيف حزم الألياف مع الهواء المضغوط.
  5. تحميل حزمة الألياف على حامل الألياف ومنع نهاية محفورا في فقاعة خالية، خالية من البروتين PBS العازلة لمدة 1 ساعة.
  6. إيداع 1 ميكرولتر قسامة لتعليق المكروية المخزنة على نهاية محفورا من حزمة من الألياف البصرية. حماية الإعداد من الضوء مع مربع بورق الألمنيوم، والانتظار لمدة 15 دقيقة. حجم التعليق سوفإنقاص عن طريق التبخر وإجبار المجهرية في microwells محفورا. كرر هذه الخطوة التحميل مرة أخرى.
  7. استخدام مسحة مشبعة بمحلول العينة لإزالة المجهرية التي لا محاصرون في microwells. ميكروأري البروتين هو الآن جاهزة للاستخدام. انتقل على الفور إلى الخطوة 4.1 لتحليل اللعاب.

4. تحليل اللعاب عينة عن طريق المجهرية ميكروأري

  1. إضافة 200 ميكرولتر حل العينة (100 ميكرولتر طاف اللعاب المخفف مع حجم مساو من StartingBlock T20 (PBS) عرقلة العازلة. تم نشر بروتوكول جمع لعاب طاف سابقا 10). إلى 0.5 مل أنبوب microcentrifuge تعقيمها. تراجع ميكروأري البروتين تحميلها على الألياف في الحل واحتضان على شاكر في 600 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة، وحماية من الضوء باستخدام مربع مغطاة بورق الألمنيوم.
  2. تحضير 20 مل غسل العازلة بإضافة 200 ميكرولتر 10٪ محلول BSA و 200 ميكرولتر 10٪ توين 20 إلى 19.6 مل PBS، ميلس بشكل جيد عن طريق هز بلطف.
  3. تراجع ميكروأري البروتين إلى تعقيمها أنبوب microcentrifuge جديدة تحتوي على 200 ميكرولتر غسل العازلة ويهز في 600 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. كرر هذا يغسل 3X.
  4. احتضان ميكروأري في 100 ميكرولتر من حل كوكتيل الكشف عن الأجسام المضادة التي تحتوي على 5 ميكروغرام / مل من مكافحة VEGF، IP-10، IL-8، صندوق تعديل العولمة الأوروبي، MMP-9، IL-1β الأضداد البيروكسيديز في الكشف StartingBlock T20 (PBS) عرقلة العازلة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر في 600 دورة في الدقيقة، وحماية من الضوء باستخدام مربع مغطاة بورق الألمنيوم.
  5. غسل 3X ميكروأري مع غسل العازلة كما هو موضح في الخطوة 4.3.
  6. احتضان ميكروأري في 200 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل streptavidin R-فيكوإيريترين المتقارن (SAPE) الحل في برنامج تلفزيوني في 600 دورة في الدقيقة على شاكر لمدة 10 دقيقة، وحماية من الضوء باستخدام مربع مغطاة بورق الألمنيوم.
  7. غسل 5X ميكروأري مع غسل العازلة كما هو موضح في الخطوة 4.3.
  8. تنظيف النهاية البعيدة من الألياف (أي نهاية بعيدامن المجهرية) ربطة مع مسحة مشبعة الإيثانول المطلق.
  9. تجف طرفي الألياف مع الهواء المضغوط. تركيب الألياف على مجهر المجهر epifluorescent والصورة من خلال نهاية البعيدة من الألياف.
  10. الحصول على صور المكروية الموافق الاتحاد الأوروبي TTA، C30، وSAPE شدة الانبعاثات مضان. وصفت الإعداد المرشحات الضوئية ومرات التعرض للتصوير مضان من الاتحاد الأوروبي وTTA، C30، وSAPE في الجدول 2.
قناة الاتحاد الأوروبي وTTA C30 SAPE
المثير 365/10x 350/50x 546/10x
Beamsplitter 525DCLP 400DCLP 560LP
باعث 620/60m 460/50m 580/30m
زمن التعرض 1 ثانية 0.3 ثانية 1 ثانية

الجدول 2. المعلمات للصور الفلورسنت ثلاثة من ميكروأري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتظهر الصور مضان من ثلاث قنوات يظهر قسم صغير من حزمة من الألياف البصرية في أرقام 2A-C. وقد تم تحليل هذه الصور باستخدام خوارزمية مكتوب في MATLAB (كما هو موضح بمزيد من التفصيل في القسم مناقشة). تحليل توظف كلا من المعلومات من الصورة الترميز بين الاتحاد الأوروبي وTTA (الشكل 2A) وصورة ترميز C30 (الشكل 2B) لفك المجهرية، وحسبت كثافة مضان المجهرية مختلفة في الصورة إشارة (الشكل 2C). مع منحنيات المعايرة تم الحصول عليها من ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب على الباحثين إيلاء اهتمام إضافي إلى الخطوات التالية: للحصول على أفضل دقة فك التشفير، فمن الضروري للتحقق من والمجهرية علقت متجانس في جميع الحضانة وغسل الخطوات أثناء إجراء ترميز المجهرية. بالإضافة إلى ذلك، تحتاج المجهرية المشفرة أن تكون محمية من الضوء في كافة مراحل التجربة برمتها. وفقا للإجراءات الترميز والتخزين السليم، وجدنا أن دقة فك عموما كانت فوق 99٪. يجب أن يتم تخزين المجهرية المشفرة في 4 درجات مئوية. تجنب تجميد وحماية من الضوء. في ظل ظروف التخزين السليم، و...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (منحة 08UDE017788-05). كما يقر EBP بدعم من مؤسسة الإسبانية للعلوم والتكنولوجيا (FECYT). المؤلفين أشكر شوندا T. جايلورد وPratyusha Mogalisetti لقراءة نقدية للمخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Eu-TTA صبغةفيشر ScientificAC42319-0010
THFSigma-Aldrich34865-100ML
قارورة زجاجية كهرمانيةفيشر ساينتفيك03-339-23B
Coumarin 30 صبغةSigma-Aldrich546127-100MG
مجهريةBangslabsPC05N / 6698
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيفيشر ساينتفيك05-408-129
PBS 10x مركزسيجما ألدريتشP5493-1L
ماءسيجما ألدريتشW4502-1L
ميثانولسيجما ألدريتش34860-100 مل
Tw-20سيجما ألدريتشP7949-100 مل
BupH MES محلول ملحيمخزن حراري علمي28390
SDSSigma-Aldrich05030-500ML-F
حل هيدروكسيد الصوديومفيشر ScientificSS256-500
أنبوب الطرد المركزي الدقيق ذو القفلالآمن VWR labshop53511-997
EDCThermo Scientific22980
Sulfo-NHSThermo Scientific24510
الأجسام المضادة لالتقاط VEGFالبشري R & D SystemsMAB293
Human IP-10 يلتقط الجسم المضادR & D SystemsMAB266
Human IL-8 التقاط الجسم المضادR & D SystemsMAB208
يلتقط الإنسان EGF الأجسام المضادةR & D SystemsMAB636
Human MMP-9 التقاط الجسم المضادR & D SystemsMAB936
Human IL-1 & beta ؛ التقاط الجسم المضادR & D SystemsMAB601
Mouse IgG1 التحكم في الأجسام المضادة R& D SystemsMAB002
StartingBlock (TBS) العازلةThermo Scientific37542
HCl الحل القياسي 1.0 NSigma-Aldrich318949-500 مل
0.5 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيقة فيشر ساينتفيك05-408-120
عازلة خالية من البروتين (PBS)Thermo Scientific37572
مؤتلف بشري VEGF 165R & D Systems293-VE
المؤتلف البشري IP-10R & D Systems266-IP
المؤتلف البشري IL-8R & D Systems208-IL
المؤتلف البشري EGFR & D Systems236-EG
مؤتلف MMP-9 R& D Systems911-MP
المؤتلف البشري IL-1 & بيتا ؛R & D Systems201-LB
StartingBlock T20 (PBS) العازلةThermo Scientific37539
Blocker BSA في PBSThermo Scientific37525
بيوتينيل VEGF للكشف عن الجسم المضادR & D SystemsBAF293
بيوتينيل IP-10 للكشف عن الأجسام المضادةR & D SystemsBAF266
الأجسام المضادة للكشف عن IL-8 البيوتينيلR & D SystemsBAF208
بيوتينيل EGF للكشف عن الأجسام المضادةR & D SystemsBAF236
بيوتينيل MMP-9 للكشف عن الأجسام المضادةR & D SystemsBAF911
البيوتينيل IL-1 & بيتا الكشف عن الأجسام المضادةR & D SystemsBAF201
Streptavidin ، R-phycoerythrinInvitrogenS-21388
Ethanol (200 برهان)Sigma-AldrichE7023-500ML
الدقيقة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
  2. Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
  3. Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
  4. Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
  5. de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
  6. Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
  7. Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
  8. Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  9. Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
  10. Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
  11. Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
  12. Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
  13. Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
  14. St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
  15. Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
  16. Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
  17. Schena, M. Protein Microarrays. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).
  18. Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from: http://www.rndsystems.com/Products/MAB002 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Fluorescent MicroarraySalivary Protein AnalysisPolymer MicrospheresFiber optic BundlesMicrosphere EncodingAntibody CouplingFluorescence MicroscopySandwich ImmunoassayBiofluid AnalysisMATLAB Algorithm

Related Articles